賽里木酸奶細(xì)菌多樣性及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分分析

王子涵，林青，劉鈺潔，秦新政，李月，婁愷，袁華偉*，霍向東*

1(新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊,830052)2(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊,830091)3(宜賓學(xué)院，質(zhì)量管理與檢驗(yàn)檢測(cè)學(xué)部/固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓,644000)4(新疆師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊,830054)

賽里木酸奶是新疆阿克蘇地區(qū)拜城縣賽里木鎮(zhèn)維吾爾族農(nóng)家采用傳統(tǒng)方法制作的一種發(fā)酵乳制品，集鮮明的地域和民族特色為一體，是南疆特色乳品的代表[1]。賽里木酸奶氣味清香、酸甜可口、質(zhì)地黏稠，能拉出近1 m長(zhǎng)的絲，有“拉絲酸奶”之稱[2]。

近年，對(duì)賽里木酸奶的研究多數(shù)集中在菌株的分離鑒定、發(fā)酵工藝、生物活性物質(zhì)及主體風(fēng)味分析[2-5]。對(duì)原產(chǎn)地賽里木酸奶高通量測(cè)序結(jié)果表明，厚壁菌門(mén)是其優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)，乳桿菌屬為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬[1]。利用分離自賽里木酸奶的單株乳酸菌或復(fù)合菌發(fā)酵牛奶后，檢測(cè)出11種揮發(fā)性成分，其中乙醇、乙酸乙酯和3-羥基-2-丁酮是主體風(fēng)味物質(zhì)[2]。賽里木酸奶屬自然菌群發(fā)酵產(chǎn)品，菌種構(gòu)成復(fù)雜，全面評(píng)判其主體發(fā)酵菌群及風(fēng)味物質(zhì)，還需要深入研究。

本文以賽里木酸奶引子為發(fā)酵劑，采用當(dāng)?shù)貍鹘y(tǒng)工藝，制作賽里木酸奶，結(jié)合高通量測(cè)序及頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜(head space solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS)聯(lián)用技術(shù)，解析賽里木酸奶細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成，旨在為新疆特色發(fā)酵乳中優(yōu)勢(shì)功能菌的分離篩選及發(fā)酵劑的制備提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 主要材料與試劑

純牛奶，利樂(lè)枕包裝，新疆西域春公司；Gene JET膠回收試劑盒，Thermo Scientific公司；D2000 DNA Marker，北京天根生化科技有限公司；帶識(shí)別條碼(barcode)的細(xì)菌16S rRNA基因V3～V4區(qū)擴(kuò)展引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGTWTCTAAT-3′)，北京諾禾致源生物信息科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

PCR儀，美國(guó)Bio-Rad公司；Illumina NovaSeq 高通量測(cè)序平臺(tái)，美國(guó)Illumina公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭及萃取手柄，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；TQ8040 NX三重四極桿型氣質(zhì)聯(lián)用儀，日本SHIMADZU公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Fresco17離心機(jī)，Thermo Fisher Scientific公司；電泳儀，北京六一生物科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)，北京六一生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集

原產(chǎn)地賽里木酸奶樣品的采樣地點(diǎn)為新疆拜城縣賽里木鎮(zhèn)托喀其買里村，賽里木酸奶制作傳承人吐熱汗·吐熱甫工作室。使用經(jīng)滅菌后的50 mL離心管進(jìn)行分裝，每管30 mL左右，采集6管，1管用于高通量測(cè)序，1管用于后續(xù)試驗(yàn)，4管作為備份，放入車載低溫冰箱保存。

1.2.2 賽里木酸奶發(fā)酵工藝流程

傳統(tǒng)賽里木酸奶主要有5道制作工序:

擠奶→煮奶→盛碗→添加引子(發(fā)酵劑)→發(fā)酵(8 h)→成品

每次制作酸奶后都要留下一些引子供下次發(fā)酵用。據(jù)此，本研究采用如下工藝：

純牛奶(西域春利樂(lè)枕)→分裝→預(yù)熱(42 ℃)→接種[加入賽里木酸奶引子，接種量4%(體積分?jǐn)?shù))]→發(fā)酵(42 ℃，8 h)→冷藏(4 ℃)

用于揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)HS-SPME-GC-MS的檢測(cè)。

1.2.3 高通量測(cè)序

采用十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTMAB)溶解細(xì)胞膜的方法提取賽里木酸奶中的總DNA[6]。使用帶Barcode引物和高效高保真的酶，對(duì)細(xì)菌16S rDNA的V3～V4區(qū)域(引物 338F/806R)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增[7]。

PCR反應(yīng)體系(30 μL)：15 μL Phusion Master Mix(2×)，3 μL Primer(2 μmol/L)，10 μL(5～10 ng)DNA(1 ng/μL)，2 μL雙蒸水；反應(yīng)程序：98 ℃，1 min，(98 ℃，10 s；50 ℃，30 s；72 ℃，30 s)×30，72 ℃，5 min。PCR產(chǎn)物使用2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。選擇大小在400～450 bp的條帶，切膠回收純化。送往北京諾禾致源生物信息科技有限公司，借助Illumina NovaSeq平臺(tái)及相關(guān)資源完成高通量測(cè)序，并返回原始序列。

1.2.4 生物信息學(xué)分析

根據(jù)Barcode序列和PCR擴(kuò)增引物序列從下機(jī)數(shù)據(jù)中拆分出各樣本數(shù)據(jù)，使用FLASH軟件對(duì)樣本的reads進(jìn)行拼接，過(guò)濾處理得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)[7]。參照QIIME的Tags質(zhì)量控制流程，與物種注釋數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，剔除質(zhì)量較差的的嵌合體序列，最終得到有效序列[8]。利用UPARSE軟件以97%的一致性將序列聚類為操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)[9]。用MOTHUR方法與SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTUs代表序列進(jìn)行物種注釋分析，獲得分類學(xué)信息并分別在各個(gè)分類水平上的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[10]。通過(guò)QIIME軟件進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)分析。

1.2.5 純牛奶及酸奶樣品中揮發(fā)性成分的提取

采用HS-SPME方法，稱取20.00 g樣品，放入100 mL帶有硅膠墊帽的頂空萃取瓶中，立即密封，于60 ℃水浴中預(yù)平衡15 min后，推出老化過(guò)的萃取頭，頂空吸附40 min。取出萃取針頭后進(jìn)樣，250 ℃解析5 min。

1.2.6 GC-MS分析條件

GC條件：InertCap WAX色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升溫：進(jìn)樣口溫度為250 ℃，初始溫度為35 ℃保持5 min，以3 ℃/min升至100 ℃，再以4 ℃/min升至240 ℃，保持4 min；進(jìn)樣模式：不分流進(jìn)樣；色譜柱流速：1 mL/min。

MS條件：電離方式EI；載氣為He；離子源溫度230 ℃；數(shù)據(jù)采集方式Q3 Scan；掃描范圍45～500m/z。

1.2.7 相對(duì)氣味活度值(relative odor activity value，ROAV)計(jì)算及關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)的確定

ROAV值是一種能夠有效評(píng)價(jià)測(cè)得化合物的方法[11]，揮發(fā)性成分閾值見(jiàn)參考文獻(xiàn)[12-13]。定義樣品總體氣味貢獻(xiàn)最大化合物的ROAV值為100，其他風(fēng)味化合物的ROAV按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：Ci和Ti分別為各揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)含量和閾值;Cmax和Tmax分別為對(duì)樣品總體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大組分的相對(duì)含量和閾值。

2 結(jié)果與分析

2.1 賽里木酸奶中Alpha多樣性分析

賽里木酸奶樣品高通量測(cè)序返回原始序列58 475條，最終用于后續(xù)分析的有效序列有39 457條。采用Alpha多樣性指標(biāo)中表示群落多樣性的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)，表示物種豐富度的Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)以及群落覆蓋度指數(shù)Coverage[10]。對(duì)樣品中群落多樣性和物種豐度進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果如表1所示。樣品的OTUs覆蓋率達(dá)99.99%，說(shuō)明樣品中細(xì)菌種類幾乎都能被檢測(cè)到，測(cè)序結(jié)果可靠。OTUs數(shù)量越多說(shuō)明樣品中的細(xì)菌豐度越高，賽里木酸奶樣品中共檢測(cè)到186個(gè)OTUs，隸屬于9門(mén)、17綱、34目、58科、77屬。

表1 賽里木酸奶中細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)

2.2 賽里木酸奶中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成分析

對(duì)賽里木酸奶樣品的有效序列進(jìn)行聚類，以97%相似性度水平聚類的OTUs進(jìn)行深度分析，將平均相對(duì)豐度>1%定義為優(yōu)勢(shì)微生物，平均相對(duì)豐度>10%定義為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)微生物[10]。16S rDNA門(mén)水平上檢測(cè)到9個(gè)菌門(mén)(圖1)，厚壁菌門(mén)(Firmicutes)為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，占比97.45%，其次為擬桿菌門(mén)(Bacteroidota)占比0.74%，其他門(mén)豐度小于0.5%；共檢測(cè)出77個(gè)屬，賽里木酸奶樣品中占比最高的前10個(gè)屬(圖2)，鏈球菌屬(Streptococcus)占比82.94%為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌，其次為占比5.19%的乳桿菌屬(Lactobacillus)。

圖1 門(mén)水平上賽里木酸奶樣品的細(xì)菌群落組成

2.3 賽里木酸奶揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分分析

采用HS-SPME-GC-MS對(duì)純牛奶及賽里木酸奶的揮發(fā)性成分進(jìn)行定性和定量分析，結(jié)果如表2所示。兩種樣品共檢測(cè)出46種成分，包含酸、醛、酮、酯、醇、醚、酚、呋喃、烷烴和芳香族化合物。純牛奶共檢測(cè)出26種成分，其中酸類5種，醛類5種，酮類5種，酯類3種，醇類1種，醚類1種，酚類1種，呋喃類2種，烷烴及其他衍生類種。賽里木酸奶共檢測(cè)出31種成分，其中酸類10種，醛類1種，酮類5種，酯類5種，醇類4種，醚類1種，烷烴及其他衍生物4種，芳香族化合物1種。與純牛奶相比，賽里木酸奶中酸、酯、醇類化合物種類及含量明顯增加，醛類明顯減少，酮類含量減少但種類發(fā)生改變，減少了酚類、呋喃類化合物，增加了芳香族化合物；其中，酸類占總比例最大，為47.57%，其次是酮類及醇類，分別占21.31%、12.83%。酯類化合物在檢測(cè)結(jié)果中質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，但由于其香味閾值低，故對(duì)發(fā)酵乳風(fēng)味的形成影響較大[14]。

2.4 根據(jù)相對(duì)氣味活度值鑒定賽里木酸奶中主體風(fēng)味物質(zhì)

酸奶的整體風(fēng)味是多種物質(zhì)協(xié)同作用的結(jié)果，計(jì)算樣品中揮發(fā)性成分的ROAV值確定賽里木酸奶中的主體揮發(fā)成分，ROAV越大表示該化合物對(duì)樣品總體氣味的貢獻(xiàn)作用越大，一般認(rèn)為ROAV>1的風(fēng)味化合物是關(guān)鍵風(fēng)味化合物，1≥ROAV>0.1的風(fēng)味化合物起修飾作用[11]。如表3所示，純牛奶中有5種特征成分，分別為2-甲基丁醛、糠醇、癸醛、2-甲基丙醛、壬醛；2種修飾性成分為2-壬酮和2-庚酮。賽里木酸奶中有11種關(guān)鍵成分，分別為甲基乙酰甲醇(乙偶姻)、壬醛、2-庚酮、正己酸、2-壬酮、正丁酸、2-十一酮、2-壬醇、乙酸正丁酯、正辛酸、己酸甲酯；2種修飾性成分為5-羥基癸酸-δ-內(nèi)酯和正癸酸。

3 討論

本研究采用高通量測(cè)序?qū)惱锬舅崮讨屑?xì)菌群落組成進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Streptococcus占比82.94%為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬，能產(chǎn)生不同莢膜多糖和黏液多糖[15]，Lactobacillus占比5.19%，為優(yōu)勢(shì)菌屬，可產(chǎn)生葡聚糖[16]。乳酸菌胞外多糖通過(guò)結(jié)合大量水或與酸奶中的其他成分相互作用而具有增稠、乳化、凝膠和穩(wěn)定能力[17]，這與賽里木酸奶的拉絲特性相關(guān)。此外，在發(fā)酵過(guò)程中，鏈球菌與乳桿菌的協(xié)同作用能更快地形成更多的乳酸和芳香化合物[12]。

高冬臘對(duì)賽里木酸奶進(jìn)行高通量測(cè)序，發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，其次為鏈球菌屬[1]。本研究中鏈球菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，其次為乳桿菌屬，鏈球菌屬為唾液鏈球菌嗜熱亞種，乳桿菌屬主要包含希爾加德氏乳桿菌和鼠乳桿菌(Lactobacillusminurnius)。不同樣本的的細(xì)菌群落組成有所差別，但鏈球菌屬和乳桿菌屬在賽里木酸奶中占比均最高。此外，吳陽(yáng)[5]、瑪依諾·木圖拉等[4]，利用傳統(tǒng)的純培養(yǎng)方法從賽里木酸奶中分離得瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)和馬克思克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)；吐汗姑麗·托乎提[18]從賽里木酸奶分離得德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)、嗜熱鏈球菌和釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。

雷華威[2]利用分離自賽里木酸奶的瑞士乳桿菌單獨(dú)或與嗜熱鏈球菌、馬斯克魯維酵母混合發(fā)酵酸奶，單獨(dú)發(fā)酵時(shí)包含8種揮發(fā)性成分，其中脂肪酸為主要風(fēng)味物質(zhì)；與嗜熱鏈球菌共發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生10種揮發(fā)性成分，乙偶姻為主要風(fēng)味物質(zhì)；三者共發(fā)酵時(shí)檢測(cè)到11種揮發(fā)性成分，乙醇、乙酸乙酯和3-羥基-2-丁酮是主體風(fēng)味物質(zhì)，隨著菌種種類的增加酸奶的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類也隨之增加。本研究利用完整土著菌群的賽里木酸奶引子進(jìn)行發(fā)酵，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成更加豐富，共有31種揮發(fā)性成分，主體風(fēng)味物質(zhì)包括酸、酮、酯、醇等物質(zhì)，酸類物質(zhì)占比最高，為47.57%，與賽里木酸奶口感偏酸相符。

賽里木酸奶中的主體揮發(fā)成分包括乙偶姻、壬醛、2-庚酮、正己酸、2-壬酮、正丁酸、2-十一酮、2-壬醇、乙酸正丁酯、正辛酸、己酸甲酯。酸類物質(zhì)促進(jìn)賽里木酸奶特有感官風(fēng)味的形成。低分子量脂肪酸一般由微生物作用于脂肪分解產(chǎn)生，賦予酸奶酸爽的口感[19]。乙酸具有醋酸味，正丁酸天然存在于香茅中，普氏棲糞桿菌被認(rèn)為是最豐富的丁酸產(chǎn)生菌之一，丁酸鹽在結(jié)腸黏膜中具有抗炎作用[20]。3-甲基戊酸微帶清香氣息，具有酸的藥草氣味。正己酸、正庚酸、壬酸都具有脂肪樣氣味，正己酸還賦予酸奶乳酸味及乳酪味[21]，壬酸還具有椰子香氣。辛酸游離于西藏柏木、柳杉、煙草、肉豆蔻等植物精油中，具有微弱水果酸味。酮類物質(zhì)多由不飽和脂肪酸的氧化或微生物代謝產(chǎn)生，使酸奶具有特征的風(fēng)味[22-23]。甲基乙酰甲醇(3-羥基-2-丁酮/乙偶姻)具有強(qiáng)烈的奶油香氣，是嗜熱鏈球菌發(fā)酵糖類產(chǎn)生的特征風(fēng)味化合物之一[24]。2-庚酮有類似梨的水果香味，2-壬酮呈水果、花、油脂和藥草似的香氣，2-十一酮濃度低時(shí)具有類似桃子的香氣，有類似蕓香、油脂氣息，賦予酸奶奶油、乳酪風(fēng)味。醇類化合物比較柔和，使酸乳口感更加爽口，是賽里木酸奶中特有風(fēng)味物質(zhì)[4]。(+)-5-甲基-2-己醇具有水果的香氣，2-乙基-1-己醇有甜味和淡淡的花香，不飽和醇的風(fēng)味閾值較低，對(duì)風(fēng)味有較大貢獻(xiàn)[13]。酯類化合物大多數(shù)具有花香和果香，有助于中和發(fā)酵乳中脂肪酸尖銳的刺激性氣味。乙酸異丙酯、乙酸正丁酯具有水果香，己酸甲酯賦予酸奶令人愉快的氣味，5-羥基癸酸-δ-內(nèi)酯有奶油香味、椰子及桃子的果香氣，對(duì)酸奶風(fēng)味起重要作用，增添酸奶的奶香氣味[24]。

4 結(jié)論

Streptococcus，Lactobacillus為賽里木酸奶中絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬，與賽里木酸奶的拉絲特性相關(guān)；鏈球菌發(fā)酵糖類產(chǎn)生的乙偶姻賦予賽里木酸奶強(qiáng)烈的奶油香氣。純牛奶以原產(chǎn)地賽里木酸奶為引子發(fā)酵后生產(chǎn)的賽里木酸奶，其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成更加豐富，為開(kāi)發(fā)具有新疆特色的酸奶發(fā)酵劑提供理論基礎(chǔ)。