電針對腰椎間盤退變大鼠模型線粒體自噬影響的研究

陳延武,崔錦濤,康武林,袁普衛(wèi),王占魁△

(1.西安市中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710021；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046；3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨傷醫(yī)院，陜西 咸陽 712000)

腰椎間盤退變(Lumbar intervertebral disc degenera-tion，LIDD)是誘發(fā)包括下腰痛(Low back pain，LBP)在內(nèi)的一系列椎間盤相關(guān)疾病的最常見原因[1-3]。在一份報告中顯示，成人慢性腰背疼痛的發(fā)生率達(dá)到了38.9%[4]，LBP已經(jīng)是致使成人喪失勞動力的主要元兇之一[5-7]。

諸多研究認(rèn)為，電針對腰椎間盤退變性疾病具有良好的治療作用。單衍麗采用電針療法對比藥物治療腰椎間盤突出癥發(fā)現(xiàn)，電針可大幅改善腰椎間盤突出后癥狀并且優(yōu)于藥物治療[8]。Carolyn E等學(xué)者也認(rèn)為針刺對于腰痛的治療是安全有效的，尤其在藥物治療不佳時，針刺治療具有很好的替代性[9]。然而，針刺具體是通過何種途徑治療下腰痛、抑制椎間盤退變的，其具體作用機(jī)制目前相關(guān)研究尚不明確。線粒體自噬對于微環(huán)境的調(diào)控有重要的意義，它是通過細(xì)胞自噬的方式選擇性地清除受損或者多余的線粒體，從而維持相對穩(wěn)態(tài)。本研究筆者通過電針誘導(dǎo)腰椎間盤髓核細(xì)胞內(nèi)線粒體自噬，分析其抑制LIDD的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

選用雄性SPF級SD大鼠60只，體質(zhì)量(180±20)g[恩斯維爾實(shí)驗(yàn)動物中心，SCXK(陜)2018-001]。在陜西中醫(yī)藥大學(xué)南校區(qū)動物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行飼養(yǎng)，每籠5只，自由進(jìn)食飲水，室溫控制19～24 ℃，濕度45%～55%，待SD大鼠適應(yīng)環(huán)境1周后即可開展動物實(shí)驗(yàn)。根據(jù)隨機(jī)數(shù)表法隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組、模型組、電針組與假電針組，每組15只。

1.2 主要儀器設(shè)備、試劑與耗材

1.2.1 儀器設(shè)備 電子針療儀(華佗牌電針儀，SDZ-Ⅱ型)；Micro-CT[布魯克(北京)科技有限公司，SKYSCAN1276]；脫水機(jī)、包埋機(jī)和凍臺(武漢俊杰電子，JJ-12J)；病理切片機(jī)(上海徠卡儀器，RM2016)；正置光學(xué)顯微鏡(日本尼康，NIKON ECLIPSE CI)；垂直電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(美國伯樂實(shí)驗(yàn)室，Bio-Rad)；凝膠成像儀(上海勤翔儀器，Clinx)；低溫高速離心機(jī)(德國艾本德，Eppendorf)等。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑及耗材 中性樹膠(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；蘇木素-伊紅染液、RIPA裂解液(中)、BCA蛋白濃度測定試劑盒、PMSF(UBI)；Cox2一抗(AF7003)；異氟烷(國藥準(zhǔn)字H19980141)；頭孢呋辛鈉(國藥準(zhǔn)字H20065708)；針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，0.3 mm×25 mm)等。

1.3 動物模型的建立及治療方案

1.3.1 動物模型的建立 所有大鼠術(shù)前8 h禁食，4 h禁飲。根據(jù)付方達(dá)等[10]報道的方法復(fù)制LIDD大鼠動物模型：采用戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔麻醉，待麻醉起效后剃除目標(biāo)節(jié)段脊柱區(qū)毛發(fā)，判別施術(shù)部位，分別用碘伏、酒精棉球消毒術(shù)區(qū)皮膚，確認(rèn)手術(shù)部位后沿脊柱縱行向下銳性切開皮膚，鈍性剝離筋膜，使大鼠的豎脊肌充分顯露，并將兩側(cè)豎脊肌軸向鈍性分離(必要時可切斷部分豎脊肌)，完全顯露大鼠腰椎棘突，以大鼠髂前上棘正對L5～6椎間隙進(jìn)行定位，判別無誤后徹底剪斷腰L3～5節(jié)段的棘突、棘上及棘間韌帶等組織結(jié)構(gòu)，檢查臟器無出血、腹膜完整后，碘伏徹底消毒，在傷口處涂抹適量頭孢呋辛鈉預(yù)防感染，將肌肉、筋膜和皮膚等創(chuàng)口逐層關(guān)閉。假手術(shù)組：僅行豎脊肌鈍性分離，不咬除棘突及棘上及棘間韌帶等結(jié)構(gòu)，其余操作技術(shù)及手術(shù)方式同造模各組。

1.3.2 治療方案 電針組大鼠選取雙側(cè)的夾脊穴L3～5，采用0.3 mm×25 mm毫針直刺0.5～0.7 cm(避免傷及脊髓),快速捻轉(zhuǎn)刺入腧穴，針下有沉澀感后，針柄連接電針儀，同對電極應(yīng)連接同節(jié)段椎體的腧穴，儀器參數(shù)設(shè)置：疏密波，2 Hz/15 Hz，強(qiáng)度1～2 mA，連續(xù)干預(yù)4周，20 min/次，1次/2 d。假電針組大鼠針刺治療同電針組，但是針柄不連接電針儀。假手術(shù)組與模型組在假電針組與電針組進(jìn)行治療時，均施加同等時間及強(qiáng)度的約束，確保外在刺激的一致性。

1.4 取材方案

末次治療結(jié)束24 h內(nèi)，采用異氟烷過量吸入麻醉后處死，解剖脊柱區(qū)，8只大鼠取下椎體組織及椎間盤組織，用于病理學(xué)檢測和Micro-CT掃描，放置于足量的4%多聚甲醛固定液中，常溫下保存；7只大鼠的椎間盤組織，用于檢測髓核細(xì)胞的蛋白表達(dá)水平，放入-80 ℃冰箱中備用。

1.5 觀察指標(biāo)和檢測方法

1.5.1 椎體間隙高度變化 使用Micro-CT對椎間盤組織進(jìn)行掃描并重建，重建后沿正中矢狀線進(jìn)行斷層處理，保存并導(dǎo)出圖片。

1.5.2 病理學(xué)染色 將固定、脫鈣后的椎間盤組織包埋并切片，然后常規(guī)HE染色，在光鏡進(jìn)行觀察。

1.5.3 Western blot檢測蛋白表達(dá)量 使用Western blot法檢測各組大鼠腰椎間盤髓核細(xì)胞中PINK1/Parkin的蛋白表達(dá)情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 Micro-CT觀察L3～4與L4～5椎體間隙高度變化

CT掃描完成后，將每個椎間隙均分五等份，使用ImageJ軟件分別測量各組大鼠L3～4與L4～5椎間隙高度備用。通過測量發(fā)現(xiàn)咬除棘突及相關(guān)韌帶的各組大鼠椎間隙明顯減小，較假手術(shù)組差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而通過針刺治療后，電針組與假電針組的椎間隙高度部分恢復(fù)，較模型組差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；電針組與假電針組相比較，發(fā)現(xiàn)電針組椎間隙高度明顯大于假電針組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1和表1。

表1 各組椎間隙高度變化情況比較

2.2 腰椎間盤組織病理學(xué)染色比較

各組病理切片HE染色結(jié)果顯示：假手術(shù)組髓核細(xì)胞位置居中，排布均勻，形態(tài)大而圓，纖維環(huán)排列整齊規(guī)則；模型組明顯可見髓核細(xì)胞皺縮，形態(tài)各異，多似纖維條索狀，纖維環(huán)排布紊亂呈橢圓形；電針組髓核細(xì)胞位置居中，排布大致均勻，形態(tài)較大、似橢圓形，纖維環(huán)排布大體正常；假電針組髓核細(xì)胞位置基本居中，排布呈中心聚集形態(tài)，周邊部分呈條索狀，纖維環(huán)排布基本正常，稍向側(cè)方突起。見圖2。

2.3 腰椎間盤髓核細(xì)胞中PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬情況

根據(jù)蛋白檢測所得的WB條帶，使用ImageJ軟件測得相應(yīng)的灰度值。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)復(fù)制LIDD模型的各組大鼠椎間盤髓核細(xì)胞中PINK1/Parkin的表達(dá)均下調(diào)，與假手術(shù)組比較差異明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而電針組與假電針組經(jīng)過治療后，大鼠椎間盤髓核細(xì)胞中PINK1/Parkin的表達(dá)均有不同程度的上調(diào)，與模型組結(jié)果比較差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且電針組與假電針組之間比較，電針組要明顯優(yōu)于假電針組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3和表2。

表2 電針對LIDD大鼠椎間盤髓核組織中PINK1/Parkin蛋白水平的相對表達(dá)量

3 討論

在椎間盤組織逐步發(fā)生退變的過程中，局部產(chǎn)生的微物質(zhì)能夠激活多種炎性介質(zhì)，而引發(fā)下游炎癥級聯(lián)反應(yīng)[11-12]，這是發(fā)生LIDD的重要病理基礎(chǔ)。椎間盤組織主要是由中央的膠凍樣髓核、包繞在周圍的纖維環(huán)及上和下面貼附的軟骨終板等組織構(gòu)成，它相當(dāng)于人體縱軸上的“緩沖器”，承接和吸收外界作用在機(jī)體的強(qiáng)大應(yīng)力。隨著年齡增長或感受異常應(yīng)力后，終板軟骨血供被破壞，組織營養(yǎng)供給減少，局部出現(xiàn)鈣化；同時髓核細(xì)胞的含水量逐漸降低，纖維環(huán)被壓縮變薄，椎間盤彈性降低，椎間隙也逐漸變窄[13-14]；影像學(xué)檢查可以顯示椎間盤組織表現(xiàn)為膨出、突出甚至脫出[15]，整個脊柱的相對穩(wěn)定結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)平衡被打破，臨床上就會出現(xiàn)腰背部肌肉緊張、疼痛及LBP等[16]一系列不適癥狀。

在LIDD的過程中，線粒體自噬機(jī)制起著重要的作用[17-18]。線粒體受損之后，會產(chǎn)生大量的線粒體DNA及活性氧等并釋放到細(xì)胞質(zhì)中，激活PINK1/Parkin通路的自噬信號，消除受損的線粒體[19]，這是發(fā)生LIDD疾病后機(jī)體細(xì)胞進(jìn)行自我保護(hù)作用。通過siRNA敲除Parkin，促進(jìn)了髓核細(xì)胞的變性和凋亡，并上調(diào)腫瘤壞死因子α等炎性因子的表達(dá)，紅景天苷可以上調(diào)Parkin的表達(dá)，抑制髓核細(xì)胞的凋亡，并消除線粒體受損，促進(jìn)髓核細(xì)胞的存活[20]。MitoQ可以有效改善線粒體動力學(xué)平衡，清除受損的線粒體，增強(qiáng)核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)活性，增加髓核細(xì)胞的存活率[21]。Batlevi Y等[22]發(fā)現(xiàn)在小鼠的浦肯野細(xì)胞變性后，線粒體自噬的改變可能引起小腦中神經(jīng)元細(xì)胞死亡。Zhou J等[23]在研究心肌細(xì)胞時發(fā)現(xiàn)，芪藶強(qiáng)心方通過上調(diào)Pink1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬，可降低心肌細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)其活性，改善心臟的功能。低水平的胎牛血清可以上調(diào)caspase-9、caspase-3、DNA修復(fù)酶及細(xì)胞色素c等表達(dá)，誘發(fā)細(xì)胞程序性凋亡[24]。有實(shí)驗(yàn)研究[25]證實(shí)，亞精胺通過激活機(jī)體的自噬反應(yīng)，降低了叔丁基過氧化氫在髓核細(xì)胞中的凋亡作用，同時增加Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖的合成，降低基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)和軟骨蛋白聚糖抗體(ADAMTS)的分解；此外MRI結(jié)果顯示，大鼠的椎間盤組織學(xué)變性程度降低，說明通過激活自噬，有助于改善椎間盤的功能并延緩其退變。

現(xiàn)代解剖學(xué)證實(shí)，夾脊穴大致位于脊神經(jīng)后支，分布于背部體表及脊柱兩側(cè)深層的肌肉，多與血管伴行穿過骨纖維孔、棘肌及筋膜等組織[26]。各種因素導(dǎo)致各椎體之間發(fā)生擠壓、移位等情況，引起通行血管、神經(jīng)的孔道被迫變形變窄，誘發(fā)出現(xiàn)腰背部肌肉痙攣、僵直和LBP等一系列臨床癥狀。有研究證實(shí)，電針能夠有效減輕非急性疼痛患者術(shù)后的疼痛癥狀[27-28]。Shan YL[29]通過電針夾脊穴配伍膀胱經(jīng)穴治療腰椎間盤突出癥患者，腰背疼痛癥狀明顯減輕，治療的有效率84.4%，優(yōu)于藥物組的65.0%。Arriaga-Pizano L等[30]認(rèn)為電針能夠誘導(dǎo)腎上腺素分泌，減少了TNF-α等因子的產(chǎn)生，能夠有效緩解疼痛癥狀，但其作用與藥物治療無明顯差異；這對于部分不適合服藥的患者或是很好的替代療法。電針配合小劑量鹽酸氟西丁可以激活疼痛控制系統(tǒng)，改善血液流動，緩解疼痛，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)，對軀體疼痛障礙患者療效明顯[31]。有研究[32]使用電針夾脊穴治療以麻木為主要癥狀的椎間盤突出患者，通過電針規(guī)律性地收縮和舒張運(yùn)動刺激局部的肌肉，使緊張的肌肉和筋膜組織得以放松，加快組織的新陳代謝和氣血循行，減輕患者的不適癥狀。電針還能通過抑制相關(guān)炎性介質(zhì)表達(dá)水平的上調(diào)[33]，并刺激神經(jīng)遞質(zhì)的合成和釋放，延緩疼痛感覺的傳遞，改善局部的血供，促進(jìn)椎間盤組織的修復(fù)，緩解腰背部疼痛及放射痛癥狀[34]。

LIDD多因外傷暴力、筋傷骨折；邪氣外侵或外傷失治誤治；腎虧體虛、腰脊失養(yǎng)等引起。中醫(yī)學(xué)中雖未見LIDD的命名，但在一些散見的著作條文對LIDD很早就有一定的描述及認(rèn)知?！端貑枴吩唬骸敖饷}令人腰痛如引帶，常如折腰狀”“痹在于骨則重……在于筋則屈不伸”“骨枯而髓虛，故足不任身，發(fā)為骨痿”；《備急千金要方》云：“腰背痛者，皆是腎氣虛弱，臥冷濕當(dāng)風(fēng)得之”；危亦林也提到:“針決膝腰勾畫中青赤絡(luò)脈，出血便瘥。腰痛不得俯仰者，令患人正立”。這些著作中的條文論述與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中LIDD的臨床特征基本是相同的。電針療法是在針刺的基礎(chǔ)上，配合特制的電針儀，加強(qiáng)局部針感，使針刺作用集中于局部，改善組織的微循環(huán)，以達(dá)到治療疾病的效果。楊繼洲在治療腰痛疾患時，注重十二正經(jīng)的取穴，選穴少而精，強(qiáng)調(diào)辨證論治在針灸學(xué)中應(yīng)用的同時，側(cè)重于針刺、灸法和藥物三者的有機(jī)結(jié)合[35]，這一理論在臨床應(yīng)用中得到廣泛認(rèn)可。孫陽等[36]對32例急性腰扭傷患者以電針承山穴進(jìn)行治療，使患者腰部的自主活動逐步恢復(fù)，局部的椎小關(guān)節(jié)得以復(fù)位，放松肌肉、筋膜和韌帶等軟組織，使炎性物質(zhì)釋放減少，腰背部疼痛癥狀逐漸緩解；有研究結(jié)果[37]顯示，電針夾脊穴可以有效減輕慢性腰痛患者的疼痛癥狀，還能改善患者焦慮、疲勞的狀態(tài)。Heo I等[38]對54例背部術(shù)后非急性疼痛的研究證實(shí)，電針能夠有效減輕非急性LBP、改善患者腰背部屈伸不利的癥狀。針刺通過調(diào)控炎性因子的釋放、局部微環(huán)境的變化和中樞敏感度的強(qiáng)弱等方面[39]，達(dá)到鎮(zhèn)痛效果，但是電針對LIDD所引起的一系列LBP等癥狀的治療機(jī)制尚未有明確的論述，還需進(jìn)一步探索[40]。

本實(shí)驗(yàn)中，通過脊柱失穩(wěn)原理成功復(fù)制大鼠LIDD模型，通過對退變的椎間盤組織進(jìn)行病理學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，髓核細(xì)胞皺縮，形態(tài)各異，多似纖維條索狀，纖維環(huán)排布雜亂無序；使用電針干預(yù)4周后，腰椎間盤髓核細(xì)胞中PINK1/Parkin蛋白水平的表達(dá)明顯上調(diào)，說明通過電針夾脊穴促進(jìn)了髓核細(xì)胞的線粒體自噬，抑制了髓核細(xì)胞的凋亡以及細(xì)胞外基質(zhì)的分解，改善了椎間盤的局部微環(huán)境，可能有益于抑制椎間盤內(nèi)炎性因子的釋放，延緩LIDD的進(jìn)程。此外，椎間隙高度的丟失亦是引起LIDD的原因之一，通過Micro-CT掃描并三維重建及ImageJ測量椎間隙高度變化證實(shí)，電針刺激夾脊穴能有效恢復(fù)大鼠的腰椎間盤高度，對緩解LIDD有重要的意義。本研究說明了通過電針刺激夾脊穴是改善腰椎間盤退變的可能機(jī)制，為臨床治療LIDD提供理論依據(jù)。但對電針調(diào)控線粒體自噬對上下游炎性因子的影響以及電針的劑量對線粒體自噬的影響程度大小等情況還需要進(jìn)一步深入研究。