分子伴侶Hsp70變構機制及其在水生動物中的應用研究進展

張翔，王祖峰

(農業(yè)農村部全國水產技術推廣總站，北京 100125)

蛋白質是細胞功能的重要執(zhí)行者，絕大多數(shù)蛋白均需要折疊形成正確的三維構象才能正常行使功能。蛋白的折疊過程復雜而精密，對外界環(huán)境和細胞內環(huán)境的變化均較敏感，有些情況下會發(fā)生錯誤折疊或形成有害的蛋白聚集體。為保障生物體的正常運轉，細胞中各蛋白都應正確地合成、折疊、組裝及行使功能，即維持細胞的蛋白內穩(wěn)態(tài)(protein homeostasis)。為此，生物進化出了主要由兩部分組成的蛋白質量控制系統(tǒng)(protein quality control system)：其一是幫助蛋白折疊及構象修復的分子伴侶網絡，由熱休克蛋白為主的分子伴侶蛋白及其調控因子構成；其二是蛋白降解系統(tǒng)，主要包括自噬通路和蛋白降解相關的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)[1]。

細胞的分子伴侶網絡涉及幾類進化上保守的熱休克蛋白家族，這些蛋白因在熱休克脅迫條件下上調而被稱為熱休克蛋白或熱激蛋白(heat shock protein, Hsp)，但也可能受其他一些脅迫因子(如滲透壓、重金屬、氧含量和病原物等)誘導而上調[1]。通常根據(jù)其分子量大小將這些家族分為Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40和小熱休克蛋白sHsp(small Hsp)，它們的立體結構特征、亞細胞定位和功能等各不相同(表1)。Hsp100由六聚體構成，呈三層環(huán)狀；Hsp90二聚體在不結合ATP時呈“V”型；Hsp70不結合ATP時整體上接近串珠狀；多個Hsp60組裝成背對背疊加在一起的雙層桶狀；Hsp40均含有由4個α螺旋構成的特征性J結構域。不同的sHsp其分子量差異較大，以保守的α-晶狀體蛋白結構域為核心，N端和C端各有一段柔性肽鏈[2]。

表1 主要分子伴侶家族的分布、特征及功能Tab.1 Location, characteristics and function of the major chaperone families

在Hsp分子伴侶網絡層次結構中，Hsp70處于上游核心位置[3]。新生多肽鏈或非天然構象(錯誤折疊)蛋白作為分子伴侶的底物，通常先在Hsp40的幫助下與Hsp70結合[4]。若Hsp70能幫助底物成功正確折疊，則不需要下游分子伴侶參與，若不成功，則把底物移交給Hsp90和Hsp60等位于下游的作用更為專一的分子伴侶，由其進一步幫助底物完成正確折疊。含J結構域的Hsp40蛋白家族除能加速Hsp70的三磷酸腺苷(ATP)水解速率外，還能往Hsp70傳送底物蛋白。一些輔助因子能提高Hsp70的工作效率甚至擴展其底物范圍，如核苷酸交換因子(nucleotide exchange factor, NEF)能促進Hsp70中核苷酸的交換[1,5]。

Hsp70在進化上高度保守，廣泛存在于原核和真核等生物中，是含量最為豐富的分子伴侶之一，也是唯一已經明確兼具多種活性的分子伴侶[4]。Hsp70具有諸多功能，如幫助新生多肽鏈的合成與折疊，幫助蛋白易位至內質網等細胞區(qū)室，拆解蛋白復合體和調控蛋白活性，以及在真核生物的內吞過程中起關鍵作用等[7-9]。此外，Hsp70能促進非天然構象蛋白的重折疊，解聚已經形成的蛋白聚集體，協(xié)助細胞內的降解系統(tǒng)清除異常蛋白等，Hsp70還是生物體適應熱休克等逆境脅迫不可或缺的因子[10-11]。Hsp70這些多樣性功能的實現(xiàn)均依賴于其分子水平保守的作用機制，即通過Hsp70分子內各結構域間和結構域內部的構象變化(以下簡稱“變構”)可逆地調控蛋白底物的結合與解離，并影響底物的構象及解離后去向(如從Hsp70解離后，底物可自發(fā)折疊、被移交給其他分子伴侶或被降解等)?？梢园袶sp70對不同底物采用相同的機制進行識別、結合及解離這一動態(tài)循環(huán)過程簡稱為“變構循環(huán)”，相應的作用機制稱為“變構機制”(allosteric mechanism)[12-14]。近年來，對Hsp70分子內變構機制的研究有了較大進展。有報道表明，Hsp70與水生動物抗逆/病相關，但其生理過程和分子機制尚不明確。本研究中，重點綜述了Hsp70與底物相互作用的分子內變構機制及其與細胞功能的聯(lián)系，簡述了Hsp70參與水生動物抗逆/病的應用研究，分析了研究應用中存在的問題，并提出了未來研究的發(fā)展建議，以期為進一步認識Hsp70家族蛋白多功能作用機制及應用提供科學參考。

1 Hsp70的結構

Hsp70家族成員的氨基酸序列和蛋白結構在不同物種間高度保守[15]，所有Hsp70家族成員均含有兩個功能性結構域，一個是位于N末端的核苷酸結合結構域(nucleotide binding domain，NBD)，相對分子質量約為45 000，另一個是靠近C末端的底物結合結構域(substrate binding domain，SBD)，相對分子質量約為25 000。NBD和SBD分別對應Hsp70的ATP酶活性和底物結合活性，兩個結構域間由一段較為松散靈活的鉸鏈區(qū)連接，Hsp70蛋白的C末端含有無規(guī)則區(qū)域，其長度在不同Hsp70家族成員中各不相同。位于真核生物細胞質和細胞核的Hsp70，無規(guī)則區(qū)域通常含有保守的谷氨酸-谷氨酸-纈氨酸-天門冬氨酸(EEVD)帶電荷基序(motif)，能結合特定的輔助因子(如Hsp70-Hsp90 organizing protein，Hop)[16](圖1A)。

A、B—Hsp70蛋白的主要結構域示意圖； C—大腸桿菌Hsp70家族蛋白(DnaK)與ADP結合時的“經典”構象(蛋白結構數(shù)據(jù)庫編號2KHO)[21]； D—DnaK與ATP結合的“經典”構象(蛋白結構數(shù)據(jù)庫編號4B9Q)[22]。其中，NBD用藍色標出，鉸鏈區(qū)用橙色標出，SBDα和SBDβ分別用墨綠色和綠色標出。A，B—schematic representation of the main domains of Hsp70；C—structures of E.coli Hsp70(DnaK) showing the canonical ADP-bound state (Protein Data Bank ID 2KHO)[21]；D—structures of DnaK showing the canonical ATP-bound state (Protein Data Bank ID 4B9Q)[22]. NBD, blue; linker, orange; SBDα, dark green; SBDβ, green.圖1 Hsp70的結構示意圖Fig.1 Schematic representation of structure of Hsp70

NBD結構域由兩瓣(lobe)構成，分別為lobeⅠ和lobeⅡ，兩瓣間的縫隙底部是核苷酸結合區(qū)域。lobeⅠ和lobeⅡ被進一步劃分為亞結構域A和B，即ⅠA、ⅠB、ⅡA和ⅡB，這4個亞結構域共同參與核苷酸結合或解離而引起的NBD構象變化(圖1A、B)。SBD結構域包含兩部分，分別是底物結合結構域β(substrate binding domain β，SBDβ)和底物結合結構域α(SBDα)。SBDβ作為主要的底物結合區(qū)域，由2個反向平行的β折疊片和7個環(huán)區(qū)構成，上層的β折疊片包括β1、β2、β4和β5，下層的β折疊片包括β3、β6、β7和β8，其中，β5、β7和β8被認為是調節(jié)SBD內部構象變化的關鍵因素[17-18]。β1、β2、L1,2和L3,4(L代表環(huán)區(qū)，L下標的數(shù)字代表環(huán)區(qū)所連接的兩個β折疊的編號)構成底物結合區(qū)域，包含疏水性的底物結合口袋[17, 19]。SBDα完全由α螺旋組成，包含α螺旋A、B、C、D、E，其中，C、D、E構成一個α螺旋束。SBDα能像“蓋子”一樣在SBDβ的底物結合區(qū)域上打開和關閉。研究表明，SBDα具有較強的動態(tài)性，這有利于Hsp70結合不同折疊程度的底物[20](圖1B)。

2 Hsp70的分子內變構循環(huán)

Hsp70的分子內變構機制是其行使功能的基礎，Hsp70分子能根據(jù)情況改變自身構象。分子內變構使Hsp70具有兩種能力，分別為NBD的腺嘌呤核苷酸(ATP或ADP)結合能力和SBD的底物結合能力，這兩種能力相互配合，共同完成從識別結合多樣性底物到釋放底物的變構循環(huán)過程，從而行使分子伴侶功能。結合不同核苷酸的NBD，能通過同一個Hsp70分子各結構域內部和不同結構域間的構象變化，調控SBD與底物的結合及解離，SBD與底物的結合及解離又對NBD的構象產生影響，如此各結構域相互協(xié)調配合，使Hsp70通過保守的變構機制結合不同底物，從而行使多種多樣的細胞功能。在此過程中，有兩類協(xié)同分子伴侶起到重要作用，分別為Hsp40和NEF。Hsp40家族蛋白均含有特征性的J結構域，這是一種由約70個氨基酸構成的保守的α-螺旋發(fā)夾結構域，也是活化Hsp70的ATP酶活性所必需的。Hsp40能識別和捕獲底物，將其靶向地轉運至處于ATP結合狀態(tài)的Hsp70，且能顯著增強Hsp70的ATP水解活性，幫助Hsp70完成變構循環(huán)[23]。不同的Hsp40家族蛋白在序列和結構上存在較大差異，這有利于增強Hsp70的功能多樣性[5]。NEF家族蛋白與Hsp70的NBD結構域結合，促進核苷酸交換過程，有利于底物從Hsp70解離，或傳遞給下游的分子伴侶[24]。

目前，研究者多采用大腸桿菌或酵母的Hsp70家族成員作為模式材料，在體外環(huán)境中研究Hsp70的分子內變構機制，特別是大腸桿菌的Hsp70家族蛋白(DnaK)的生化試驗結果和其在不同核苷酸結合狀態(tài)下的高分辨率結構(圖1C、D)，為認識Hsp70的變構機制奠定了基礎[18]。盡管近期研究表明，來自不同物種Hsp70的變構特性可能存在一定的差異，但Hsp70家族總體的變構循環(huán)高度保守[25](圖2)。

圖2 Hsp70的變構循環(huán)示意圖Fig.2 Schematic representation of the allosteric cycle of Hsp70

i)結構域未對接(domain undocked)構象。高分辨率蛋白結構信息和生化試驗等結果表明，在NBD結合ADP時或無核苷酸結合時，Hsp70的NBD結構域與SBD結構域間無接觸，兩者由鉸鏈區(qū)松散地連接，近似于相互獨立的結構域[21]，此時，SBDα覆蓋在SBDβ頂部，可以把這種構象簡稱為結構域未對接構象[6, 14](圖2i)。

ii)結構域對接(domain docked)構象。研究表明，ATP結合到Hsp70的NBD后，誘導NBD的lobeⅠ和lobeⅡ發(fā)生旋轉，鉸鏈區(qū)N端的高度保守疏水序列(389VLLL392)與NBD底部的lobeⅡA形成反平行β折疊[22, 26]，這使lobeⅡ的旋轉受阻。同時，上述構象變化誘導位于NBD的氨基酸殘基Ile168和Asp328分別與位于SBDβ的Asp481和Lys414形成氫鍵，這使SBDβ錨定在NBD表面。此時，NBD的lobeⅠ和lobeⅡ無法旋轉，導致Hsp70的ATP酶活性降低(每6～40 min水解1個ATP分子)[9,19]。變構信號以目前尚不清楚的方式繼續(xù)傳遞到SBDα，SBDα的αA和αB融合成一根較長的能與NBD結合的α螺旋結構，SBDα離開SBDβ頂部，暴露出位于SBDβ的底物結合區(qū)域，有利于結合底物?？梢詫sp70的這種構象簡稱為結構域對接構象[6, 14](圖2ii)。

iii)從結構域對接轉變?yōu)榻Y構域未對接。Hsp40幫助底物靶向結合Hsp70，當?shù)孜锒嚯逆溑cHsp70的SBDβ結合后，SBD通過疏水作用和極性作用改變自身內部構象，SBDβ和SBDα從NBD解離，且SBDα覆蓋在SBDβ的頂部，此時Hsp70的底物結合速率常數(shù)(約為104/(M·s))及解離速率常數(shù)(約為10-3/s)較低，解離平衡常數(shù)為0.1～1.0 μM(即對底物高度親和)，這有利于與底物多肽鏈緊密結合，防止底物滑脫后發(fā)生錯誤折疊[9,27]。SBD構象的改變也使鉸鏈區(qū)離開NBD，NBD的lobeⅠ和lobeⅡ旋轉恢復到適合ATP水解的位置，此時ATP酶活性達到最大值(DnaK此時的ATP酶活性比其結構域對接構象下的基礎活性約高15 000倍[28])(圖2iii)。

iv)從結構域未對接轉變?yōu)榻Y構域對接。NEF幫助Hsp70進行核苷酸交換，促進底物釋放。當ATP結合NBD，此時位于SBDβ下層β折疊片的β8離開β7，而與位于SBDβ上層的β5折疊片通過氫鍵相連，這使β8由SBDβ的下層重新定位到上層，SBDβ、SBDα和鉸鏈區(qū)分別與NBD結合，誘導SBDα離開SBDβ的頂部(圖3)。此時底物的結合速率和解離速率分別提高100倍和1 000倍，解離平衡常數(shù)提高近10倍(即與底物的親和性減弱)[9]，有利于底物釋放[18]。底物釋放后，Hsp70可以在Hsp40的幫助下結合新的底物，重新啟動變構循環(huán)[21](圖2iv)。

A—大腸桿菌Hsp70家族蛋白(DnaK)的SBDβ與ADP結合時的構象(用暗粉色標出，蛋白結構數(shù)據(jù)庫編號2KHO[21]);B—DnaK的SBDβ與ATP結合時的構象(用綠色標出，蛋白結構數(shù)據(jù)庫編號4B9Q[22])。β8用藍色標出。A—diagrams are drawn for SBDβ from E.coli Hsp70(DnaK)-ADP (dirtypink, Protein Data Bank ID 2KHO[21]); B—diagrams are drawn for SBDβ from DnaK-ATP (green, Protein Data Bank ID 4B9Q[22]).β8 is shown in blue.圖3 不同核苷酸結合狀態(tài)下Hsp70的SBDβ構象比較示意圖Fig.3 Schematic comparison of SBDβ conformations of Hsp70 in different nucleotide binding states

另有研究認為，Hsp70的變構過程也會受翻譯后修飾的調控，如Thr518位氨基酸的氨?；?AMPylation)使酵母Hsp70家族成員免疫球蛋白結合蛋白(immunoglobulin binding protein, BiP)的NBD傾向于結合SBD，使BiP失活，限制其結合底物[29]。

3 Hsp70與底物的相互作用

3.1 Hsp70的底物特征

Hsp70能結合底物中含有的疏水性短肽基序(motif)，底物范圍十分廣泛。如大腸桿菌Hsp70蛋白(DnaK)能與約700種底物結合[30-31]，酵母Hsp70蛋白(Ssb2)能結合約80%位于細胞質和細胞核的新生蛋白和約80%的線粒體內新生蛋白，以及大于40%的運往內質網的新生蛋白[7]。Hsp70家族成員的共同特性之一是能通過SBD可逆地結合由5～7個連續(xù)的疏水氨基酸(特別是脂肪族氨基酸)形成的短肽基序(如NRLLLTG)，這種基序無嚴格的序列特異性，兩側常常分布有帶正電荷的氨基酸，在蛋白中較常見，平均每30～40個氨基酸殘基即出現(xiàn)一次[32]。在天然構象的蛋白中，這類基序通常被包埋在蛋白的疏水核心中。

3.2 Hsp70與多肽底物的結合

Hsp70能結合多肽底物中的疏水短肽基序。在研究Hsp70與底物相互作用的分子機制時，早期的試驗中經常采用含有疏水基序的短肽(而不是完整蛋白)作為模式底物，以簡化試驗條件。第一個解析的Hsp70-底物復合物結構，是來自大腸桿菌Hsp70蛋白(DnaK)的SBD與模式多肽NR(NRLLLTG)形成的復合物。結果顯示，多肽NR結合在SBDβ的疏水性區(qū)域中，NR的主鏈被SBDβ環(huán)繞，SBDα覆蓋在SBDβ疏水性區(qū)域的上方，作為“蓋子”幫助穩(wěn)定NR[27]，這與生化試驗中推測的結合模式一致。隨后，多項NMR和X射線晶體學試驗對不同多肽與DnaK形成的復合物進行了結構解析，結果顯示，DnaK能以相同的模式結合各不相同的多肽底物[33]，來源于其他生物的Hsp70家族蛋白與底物結合的研究結果也顯示相同的結合模式，表明這種結合模式在進化上高度保守[34]。

位于Hsp70的SBDβ底物結合區(qū)域由5個底物結合口袋組成，其中，位于中央的口袋被編為“第0位置”(0 th position)，具有最強的底物選擇性。如在大腸桿菌Hsp70蛋白(DnaK)的SBD中，中央口袋由6個氨基酸殘基構成，即第401位的異亮氨酸、第426位的苯丙氨酸、第436位的纈氨酸、第438位的異亮氨酸、第472位的異亮氨酸和第474位的纈氨酸，這個口袋與底物多肽中的亮氨酸殘基(如NRLLLTG的第4位亮氨酸殘基L4)最為匹配[27]，但也能結合異亮氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸。其余的4個底物結合口袋(分別編為-2，-1，1，2位置)可以與多種氨基酸殘基結合，這4個口袋的底物結合偏好有輕微不同，整體上都不偏好帶負電荷的氨基酸殘基[26](圖4)。

SBDβ有5個底物結合口袋，其中位于中央的底物結合口袋最具特異性。SBDβ has five binding pockets in which the central binding pocket has the highest specificity.圖4 Hsp70的底物結合區(qū)域示意圖Fig.4 Schematic representation of the region of Hsp70 for substrate binding

盡管Hsp70的SBD在進化上高度保守，但來源于不同生物或不同細胞器的Hsp70在多肽水平上顯示出一定的底物偏好性[35]。如位于細胞溶質中的Hsp70更傾向于結合富含脂肪族氨基酸殘基的基序，而以BiP為代表的位于內質網的Hsp70更偏好結合富含芳香族殘基的基序[36]。另外，相比于原核生物，真核生物Hsp70具有更高的底物結合速率和解離速率[26]。NBD可能對Hsp70的底物特異性也有影響[37]。有學者認為，底物偏好性可能是Hsp70家族成員之間功能差異的原因之一[4]。

3.3 Hsp70與蛋白底物的結合

Hsp70能結合天然蛋白中暴露出的疏水短肽基序。在天然構象蛋白中，包埋在內部的疏水氨基酸短肽基序，在下列情況下暴露出來：1)未折疊蛋白，如新生多肽鏈或為跨膜轉運而解折疊的蛋白，Hsp70能識別結合這類底物中暴露出的疏水性短肽基序[4]；2)折疊中間體或錯誤折疊的蛋白底物，如熱脅迫條件下變性的蛋白。對這類底物，Hsp70同樣能識別結合底物中暴露出的短肽基序，除此之外，似乎還能干擾底物多肽鏈的長距離相互作用，幫助穩(wěn)定Hsp70-底物結合位點附近的局部結構，防止底物進一步的錯誤折疊[38-39]。在Hsp70的作用下，底物結構變得較為穩(wěn)定，這可能有利于其隨后自發(fā)重折疊，也可能以此狀態(tài)為起點，等待Hsp90等其他分子伴侶幫助進一步折疊；3)天然構象蛋白的主體部分呈正常折疊狀態(tài)，而在環(huán)區(qū)或序列末端等未折疊區(qū)域存在疏水基序，Hsp70能識別并結合這些暴露出的疏水基序[40]。

4 Hsp70的功能

Hsp70通過上述變構機制，在細胞水平和整體水平上保護生物體。在細胞水平上，Hsp70一方面行使其作為分子伴侶的持家功能，如促進蛋白底物正常折疊，將底物移交給下游分子伴侶或降解系統(tǒng)，幫助蛋白易位，拆解蛋白復合體及調控蛋白活性等；另一方面，Hsp70參與細胞對環(huán)境脅迫的響應，如清除由脅迫所致錯誤折疊的蛋白，解聚已經形成的蛋白聚集體等(圖5)。在整體水平上，Hsp70參與調控多細胞生物體的免疫及細胞凋亡等過程。Hsp70以上述分子內變構機制為基礎，實現(xiàn)其多樣性功能，從而幫助細胞和生物體健康地生存[1, 9]。

圖5 Hsp70的部分持家功能和脅迫相關功能示意圖Fig.5 Some of the diverse housekeeping and stress-related functions of Hsp70

4.1 底物的折疊及跨膜轉運

Hsp70在原核生物和真核生物中均能為新生多肽鏈的折疊提供保護。真核生物還進化出了特定的Hsp70，在蛋白的生物合成中起重要作用[7]。以模式生物酵母為例，Hsp70家族蛋白Ssb、Ssz與Hsp40家族蛋白Zuotin組成核糖體結合復合物，幫助維持核糖體上新生多肽鏈正確折疊，防止其聚集[41]。

Hsp70還能幫助未折疊多肽鏈進行跨膜轉運。蛋白在跨膜時需要解折疊為多肽鏈，當多肽鏈出現(xiàn)在膜的出口側時，Hsp70分子與其結合，防止多肽鏈退回入口側，并為跨膜轉運提供所需的拉力，隨著多肽鏈進一步向出口側跨膜轉運，更多的Hsp70結合到多肽鏈上，防止其過早折疊，并將其轉運至下游分子伴侶(如Hsp60)完成折疊。在蛋白轉運到線粒體、葉綠體和內質網的過程中均有Hsp70參與[8]。

4.2 底物的移交及活性調控

在細胞中，Hsp70能夠將底物移交給Hsp90和Hsp60等其他分子伴侶[1,39]，共同完成底物的折疊。如分子伴侶Hop能結合位于Hsp70和Hsp90的C末端的EEVD基序，以此連接這兩個分子伴侶，以及幫助將底物從Hsp70轉移至Hsp90，這種從Hsp70到Hsp90的底物轉移常見于處于折疊晚期的折疊中間體底物或亞穩(wěn)態(tài)蛋白底物。有研究者認為，沿Hsp70至Hsp90降低的疏水性可能是分子伴侶幫助底物折疊的關鍵因素之一[42]。

除移交底物外，Hsp70也能通過與Hsp90等其他分子伴侶的合作來調控底物蛋白的活性或穩(wěn)定性。如糖皮質激素受體(glucocorticoid receptor，GR)的配體依賴性激活。在生理狀態(tài)下，Hsp70結合GR的配體結合結構域，使該結構域局部解折疊，這一構象變化妨礙配體糖皮質激素結合GR，或者導致已結合的配體從GR解離，使GR處于失活狀態(tài)。而Hsp90及其輔助分子伴侶(如Hop、p23)的結合能活化GR，使其從被Hsp70介導的失活狀態(tài)中釋放出來，并有利于配體結合以行使功能[43]。

4.3 底物復合體的拆解

Hsp70能拆解某些天然構象蛋白形成的復合體。如在真核細胞的網格蛋白依賴性內吞中，Hsp70家族蛋白Hsc70參與囊泡的網格蛋白脫包被過程。多個網格蛋白單體能組裝成封閉的多面體籠狀結構復合體，包被在用于運輸“貨物”的囊泡表面，當囊泡與目標膜融合時，為完成“貨物”的內吞，囊泡的網格蛋白包被需要迅速分解脫落。脫包被過程的關鍵步驟由Hsp70介導：組成籠狀復合體(包被)的網格蛋白C末端含有游離的QLMLT基序，Hsp70在輔助因子的幫助下識別并結合該基序，隨即通過變構機制將單個網格蛋白從籠狀結構復合體中拆解下來，并逐步分解囊泡包被[44]。

4.4 底物的降解

Hsp70也參與底物的降解。如對那些在一定時間范圍內仍未正確折疊或已經完成其生命周期的底物蛋白，需要Hsp70參與將其降解。

Hsp70能通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(chaperone-assisted ubiquitin-proteasome system, UPS)參與降解底物。UPS是真核生物可溶性蛋白降解的主要途徑，其核心是26S蛋白酶體識別被泛素共價修飾的底物蛋白。泛素化的底物蛋白需要解折疊，以多肽鏈的形式穿過蛋白酶體內部狹窄的中央孔道完成降解。由于存在空間位阻，處于折疊狀態(tài)的底物無法被降解。Hsp70在UPS通路中的主要功能是將待降解底物穩(wěn)定在解折疊狀態(tài)，防止底物在轉運至蛋白酶體的過程中重折疊而無法降解[11]。

Hsp70也在其他蛋白降解通路中起作用。與UPS不同，自噬能直接去除蛋白錯誤折疊形成的不可溶蛋白聚集體。在哺乳動物細胞中，Hsp70家族蛋白Hsc70參與分子伴侶介導的自噬通路，該通路的作用機制尚未完全闡明，而目前已知Hsc70能識別并結合含有KFERQ多肽序列(該序列與Hsp70 SBD識別的底物疏水基序無關)的蛋白，形成的Hsc70-KFERQ蛋白復合物與溶酶體相關膜蛋白2A在溶酶體膜上形成孔道。在Hsp70的幫助下，底物通過孔道易位進入溶酶體被降解[11]。此外，Hsp70家族蛋白還參與其他自噬通路，如分子伴侶輔助的核內體微自噬和分子伴侶輔助的巨自噬，這兩種途徑的詳細機制尚不明確[11]。

4.5 蛋白聚集體的解聚

Hsp70參與細菌、真菌和植物等生物體中的蛋白聚集體解聚過程。這類生物體主要由Hsp100家族蛋白執(zhí)行解聚功能，而Hsp70能調控Hsp100家族蛋白的活性，即當Hsp70結合Hsp100的中間結構域后，Hsp100才能被活化并完成解聚[45]。處于結構域對接構象的Hsp70對Hsp100家族蛋白存在空間位阻，這使Hsp100只能結合處于結構域未對接構象的Hsp70，從而保證Hsp100選擇性地與已結合底物的Hsp70相互作用，防止發(fā)生非特異結合[46]。

Hsp70在多細胞動物中執(zhí)行蛋白聚集體的解聚功能。這類生物體中，在某些Hsp40和NEF家族蛋白的協(xié)作下，Hsp70的解聚活性得到大幅增強，進而廣譜性地解聚蛋白聚集體[47]。Hsp40能把底物轉運至Hsp70，不同的Hsp40識別不同狀態(tài)的蛋白聚集體，這進一步擴大了Hsp70的底物范圍。研究表明，解聚所需的力來源于Hsp70和Hsp40在聚集體表面寡聚化時產生的熵拉力[47]。也有研究認為，NEF家族蛋白Hsp110有助于Hsp70結合蛋白聚集體，或提供了解聚所需的熵拉力[48]。

4.6 Hsp70在整體水平上保護多細胞生物體

Hsp70還通過調控免疫和細胞凋亡等生理過程，在整體水平上保護多細胞生物體，Hsp70的這種調控作用及在人類醫(yī)學中的應用是當前分子伴侶領域研究的前沿熱點之一，并已取得一些進展。

1)一種新型Hsp70抑制劑具有較強的抗腫瘤作用，其靶點位于Hsp70的NBD結構域中第267位半胱氨酸所處的凹槽位置。研究者認為，靶向Hsp70可能會成為治療急性髓系白血病的新途徑，并具有克服癌細胞耐藥性的潛力[49]。

2)Hsp70對記憶功能的形成和維持具有重要作用；在局部缺血和患阿爾茲海默癥的模式動物中，提高內源Hsp70合成水平或注射外源Hsp70均有助于減輕病情、刺激神經發(fā)生(neurogenesis)及恢復記憶，據(jù)此，研究人員考慮把Hsp70作為潛在的治療藥物[50]。

3)人乳頭瘤病毒外殼蛋白HPV L1和L2及癌蛋白E7在該病毒的侵染過程中起關鍵作用，是設計疫苗的靶標抗原，針對此抗原以Hsp70為組成部分的疫苗在模式鼠試驗中具有顯著的抗癌作用[51]。

5 Hsp70在水生動物抗逆/病的潛在應用

水生動物在糧食安全國策中占有不可替代的地位。而水產養(yǎng)殖常常受多種生物和非生物的逆境脅迫因子限制，增強水生動物抗逆/病性能，減少對藥物的過度依賴，是減輕限制的可持續(xù)發(fā)展途徑之一。與對Hsp70在人類醫(yī)學上的應用研究相比，相關學者對Hsp70參與水生動物抗逆/病的研究明顯較少，更缺乏對相關生理過程或分子機制的認識。盡管如此，已有一些研究表明，Hsp70與水生動物的抗逆/病之間存在相關性。

5.1 Hsp70與水生動物抗非生物脅迫相關

1)Hsp70基因表達上調有助于水生動物抗離水脅迫。在一項研究中，對凡納濱對蝦Litopenaeusvannamei進行輕度冷激處理，發(fā)現(xiàn)處理后的對蝦在模擬離水脅迫試驗中成活率顯著上升?；谶M一步的試驗結果，研究人員認為冷激處理提高了Hsp70表達，進而抑制細胞色素C、Caspase-3和活性氧自由基等細胞凋亡途徑相關分子的作用或活性，從而通過抑制細胞凋亡增強了蝦體對離水脅迫的抗性,這有利于活蝦離水運輸[52]。與此類似，冷激處理能誘導一些貝類體內Hsp70表達上調[53]及斑點叉尾鮰Ictaluruspunctatus腦部Hsp70表達上調[54]。

2)Hsp70基因表達上調有助于水生動物抗重金屬脅迫和抗氨脅迫。輕度或非致死熱休克(non-lethal heat shock, NLHS)能誘導水生動物Hsp70基因表達上調，進而產生非特異性的保護作用。有研究發(fā)現(xiàn)，經NLHS預處理后，凡納濱對蝦幼蝦體內Hsp70含量增加，除增強抗高溫脅迫能力外，還增強了對致死濃度氨脅迫及中等致死濃度銅、鋅脅迫的抗性[55]；經NLHS預處理的鯉Cyprinuscarpio幼魚對致死濃度氨脅迫的抗性提高了2～3倍[56]；經NLHS預處理的鹵蟲Artemiafranciscana，顯著地提高了對急性鋅和鎘脅迫的抗性[57]；經NLHS預處理的貽貝Mytilusedulis，顯著提高了對鎘脅迫的抗性[58]。

5.2 Hsp70與水生動物抗生物脅迫相關

1)誘導增加水生動物內源的Hsp70含量，能增強其抗生物脅迫能力。有研究表明，經NLHS誘導增加Hsp70含量，增強了凡納濱對蝦對副溶血弧菌感染的抗性，并發(fā)現(xiàn)敲低Hsp70的對蝦在副溶血弧菌和白斑綜合征病毒感染時死亡率升高。研究者認為，Hsp70能激活凡納濱對蝦的免疫系統(tǒng)，從而起到了增強其抗生物脅迫的作用[59-60]。與此類似，經NLHS誘導增加鹵蟲幼蟲Hsp70含量，增強了鹵蟲對坎氏弧菌和副溶血弧菌感染的抗性[61-62]，而敲低Hsp70的鹵蟲幼蟲在弧菌攻毒試驗中的生存率降低了約30%[63]。除NLHS外，間苯三酚(一種來自植物的多酚化合物)能誘導增加鹵蟲和羅氏沼蝦Macrobrachiumrosenbergii體內Hsp70含量，并增強它們對細菌的抗感染能力[64-65]；香芹酚也能誘導鹵蟲Hsp70的表達，從而增強其對哈維氏弧菌的抗感染能力[66]。

2)通過注射和飼喂等外源途徑給予Hsp70，能增強水生動物抗生物脅迫能力。如注射重組表達Hsp70的凡納濱對蝦，在副溶血弧菌攻毒試驗中存活率提高了75%，并檢測到IKKβ、Crustin等多種免疫相關基因被誘導表達，這暗示Hsp70可能是通過參與調控免疫過程起到抗感染作用[67-68]。注射Hsp70還增強了對蝦對白斑綜合征病毒的耐受性[68]。與此類似，把重組表達的大腸桿菌Hsp70蛋白(DnaK)注射到斑節(jié)對蝦后，再注射哈維氏弧菌，發(fā)現(xiàn)對蝦死亡率降低，并觀察到免疫相關蛋白酚氧化酶原的表達顯著提高[69]。

飼喂Hsp70也能增強水生動物抗生物脅迫能力。如Sung等制備出能生產鹵蟲Hsp70或大腸桿菌Hsp70蛋白(DnaK)的大腸桿菌制劑，在弧菌攻毒試驗中，給鹵蟲喂食這種制劑能提高鹵蟲存活率，研究人員推測，這是由于Hsp70提高了酚氧化酶等免疫相關蛋白的活性，并提高了鹵蟲的免疫力，從而提高了其存活率[70]。

綜上可見，通過誘導水生動物產生內源Hsp70或給予外源Hsp70，均有助于增強水生動物的抗逆/病性。除以上例子外，在過去5年內，國內外還有120多篇相關研究報道，表明Hsp70在不同程度上與水生動物及其他農業(yè)動植物抗逆/病相關聯(lián)，所涉及的脅迫因子包括高溫、低溫、干旱、重金屬、低氧、氨、鹽、酸、細菌、病毒和真菌等。所涉及的水生動物還包括草魚、鯽、半滑舌鰨、卵形鯧鲹、紅鰭東方鲀、短須裂腹魚、遠海梭子蟹、擬穴青蟹、菲律賓蛤仔、櫛孔扇貝、馬氏珠母貝、糙海參和可口革囊星蟲等；畜禽動物包括牛、雞、豬、羊、驢、鴨、鹿和牦牛等，已有應用Hsp70基因單核苷酸多態(tài)性作為DNA標記促進牛和雞抗逆/病育種的報道；農作物包括玉米、水稻、小麥、棉花、大豆、番茄和辣椒等，已有通過誘導Hsp70基因表達增強玉米和棉花抗旱性的報道。由此認為，Hsp70在包括水生動物在內的農業(yè)動植物抗逆和病害防控方面可能具有廣泛的潛在應用價值。

6 存在問題及展望

6.1 Hsp70變構機制及其應用研究中存在的問題

近年來，對Hsp70變構機制和功能的認識取得了較大進展，且已有研究證明Hsp70參與了水生動物抗逆/病等生理過程，但研究中仍存在以下幾方面的問題。

1)Hsp70在生物體內的原位變構機制尚未完全闡明。在研究Hsp70的變構機制時，為了減少變量，多采用模式底物在體外環(huán)境中進行。而在體內原位條件下，蛋白常常受到多種翻譯后修飾的調控，Hsp70所處的細胞內環(huán)境高度復雜并時刻處于動態(tài)變化中，這些變量在體外試驗中被排除在外。因此，體外試驗中得到的研究結果，不能完全代表Hsp70在體內的原位變構機制，仍需進一步研究。

2)多細胞生物Hsp70的分子內變構機制詳情尚不清楚。盡管Hsp70家族蛋白高度保守，但從單細胞生物向多細胞生物的進化過程中，為了適應更為復雜的細胞內外環(huán)境，多細胞生物分化產生了更為特異的細胞功能及相應的生理過程，作為這些過程的參與者，Hsp70一方面表現(xiàn)為高度保守，另一方面，不同物種的Hsp70基因在進化過程中發(fā)生了多態(tài)性變異，所編碼的Hsp70家族蛋白在氨基酸組成、亞細胞定位和底物偏好性等方面產生了差異，這些差異對不同Hsp70的分子內變構機制的動態(tài)性和復雜性的影響程度尚不明確，對其功能多樣性的影響也不確定。

3)Hsp70參與水生動物抗逆/病的生理過程和響應機制尚未被揭示。近年來，關于Hsp70家族蛋白在模式生物和人類的細胞周期調控、細胞凋亡、免疫調節(jié)、抗生物脅迫和抗非生物脅迫等多種生理(抗逆)過程中的機制已取得一定進展。但對于包括水生動物在內的農業(yè)動植物，Hsp70所介導或參與的主要細胞分子通路及調控網絡等生理或抗脅迫應答機制尚不明確。在水生動物、畜禽動物、農作物中，有關Hsp70的研究大多數(shù)集中于基因測序，檢測Hsp70基因在不同條件下的表達水平差異，以及Hsp70基因過表達或被敲低(除)后的性狀變化，尚限于相關性結果，極少見有關Hsp70參與水生動物抗逆/病生理過程的報道。缺乏對生理或抗逆過程的完整通路及分子機制的認識，限制了對Hsp70的應用。

6.2 未來重點研究方向

針對分子伴侶Hsp70變構機制及其應用研究中存在的問題，今后可從以下方面開展相關工作。

1)加強對Hsp70在原位環(huán)境中變構機制的研究。采用高靈敏度或高分辨率技術，如冷凍電子斷層成像術、單分子熒光共振能量轉移和核磁共振等，以天然蛋白為底物，研究Hsp70在細胞原位環(huán)境中的精準變構機制。

2)深入開展水生動物Hsp70變構機制的研究。目前，已報道了多種水生動物的Hsp70基因序列信息，在此基礎上，首先選取一些主要養(yǎng)殖物種，并結合結構生物學、分子生物學和分子遺傳學等技術，研究其Hsp70蛋白結構及變構機制，這不僅有助于加深和擴展對Hsp70整體變構景觀和進化特點的認識，也有利于更好地應用Hsp70。

3)開展Hsp70參與水生動物抗逆/病的分子通路和作用機制研究。解析不同生理、逆境條件下，水生動物主要養(yǎng)殖物種的Hsp70與上下游分子的互作機制和調控方式，進而掌握這些動物中Hsp70對不同生理、脅迫條件的響應規(guī)律，為應用Hsp70提供理論依據(jù)。

4)拓展Hsp70在水生動物應用方面的研究。Hsp70在未來可以應用于水生動物的多個方面，首先可能會在以下幾方面獲得突破：一是育種方面，篩選Hsp70基因單核苷酸多態(tài)性DNA標記應用于水生動物抗逆/病育種，以降低育種成本及加快育種速度；二是免疫強化方面，在掌握Hsp70對于水生動物免疫活性調節(jié)規(guī)律的基礎上，一方面拓展試驗對象，探索聯(lián)用已有的益生菌等免疫強化劑共同制備飼料或投入品，在養(yǎng)殖過程中增強水生動物抗逆/病能力，特別是非特異性免疫抗逆/病性，從而減輕水產養(yǎng)殖過程中疾病的發(fā)生，另一方面，Hsp70或可作為抗原載體，強化與之配合使用的抗原免疫原性，有利于提高相關疫苗的免疫效果；三是發(fā)揮其抑制細胞凋亡的功能，Hsp70具有應用于水生動物保鮮及運輸過程中的潛力，從而減少藥品或投入品的使用，有利于食品安全；四是Hsp70可以作為藥物靶點應用于抗某些病原微生物感染的藥物開發(fā)。

綜上所述，Hsp70的變構機制特性及其諸多功能特點，使其具有較大的潛在應用空間和優(yōu)勢，其單核苷酸多態(tài)性可作為分子標記用于促進抗逆/病育種，并具有作為抗逆/病誘導劑、免疫強化劑或疫苗組分的應用潛力，這將有利于減輕對抗生素等藥物的依賴，以及減輕抗藥性等不良影響，有助于提高水產養(yǎng)殖過程中水生動物的產量并改進質量。