一株大菱鲆源殺鮭氣單胞菌非典型株的分離鑒定及毒力基因型

王鶴，王文豪，黃華，劉曉丹，張麗文，楊濤，胡樂彬，李戰(zhàn)軍

(1.煙臺市海洋經(jīng)濟研究院，山東 煙臺 264006；2.煙臺宗哲海洋科技有限公司，山東 煙臺 264006；3.山東省漁業(yè)發(fā)展和資源養(yǎng)護總站，山東 煙臺 264003)

大菱鲆Scophthalmusmaximus隸屬于鰈形目Pleuronectiformes鰈亞目Pleuronectoidei鲆科Bothidae菱鲆屬Scophthalmus，原產(chǎn)于大西洋，是底棲型冷水魚類[1]。自1992年中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所從英國將其引入中國后，隨著規(guī)?；绶N繁育技術的突破與工廠化養(yǎng)殖模式的創(chuàng)建，大菱鲆養(yǎng)殖在黃渤海三省一市沿岸迅速發(fā)展，大菱鲆亦被譽為中國海水養(yǎng)殖良種引進的典范[2]。但隨著集約化養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，細菌性病害日益嚴重，給大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴重經(jīng)濟損失。據(jù)報道，可感染大菱鲆發(fā)病的病原菌主要有鰻弧菌[3]、哈維氏弧菌[4]、嗜水氣單胞菌[5]、遲緩愛德華氏菌[6]和副乳房鏈球菌[7]等，可引起大菱鲆體表潰瘍、皮下及肌肉充血出血、腹水、器官壞死等病征。

癤瘡病(furunculosis)是養(yǎng)殖鮭鱒常見的細菌病，病原為氣單胞菌科Aeromonadaceae氣單胞菌屬Aeromonas的殺鮭氣單胞菌Aeromonassalmonicida。殺鮭氣單胞菌是一種嗜冷、無動力和兼性厭氧革蘭氏陰性菌，廣泛分布于海、淡水中[8]，該菌除感染鮭鱒魚類外，還可感染鯉科Cyprinidae、鰻鱺科Anguillidae[9]、鰨科Pleuronectidae[10]和鲆科[11]等魚類。自1992年首次從西班牙養(yǎng)殖大菱鲆中分離到殺鮭氣單胞菌以來[12]，該菌感染大菱鲆的報道日漸增多[13-14]，中國也有大菱鲆感染引起癤瘡病的相關報道[11,15]。目前，已得到公認的殺鮭氣單胞菌有5個亞種[16]：殺鮭亞種A.salmonicidasubsp.salmonicida、殺日本鮭亞種A.salmonicidasubsp.masoucida、無色亞種A.salmonicidasubsp.achromogenes、史氏亞種A.salmonicidasubsp.smithia和溶果膠亞種A.salmonicidasubsp.pectinolytica。在中國，引起大菱鲆癤瘡病的病原多為殺鮭氣單胞菌無色亞種，尚未見殺日本鮭亞種感染養(yǎng)殖大菱鲆發(fā)病的報道。

2020年，在對山東省煙臺市大菱鲆主產(chǎn)區(qū)常規(guī)病害監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)，某養(yǎng)殖場大菱鲆有體色發(fā)黑、腹部膨大的患病個體，解剖發(fā)現(xiàn)，患病個體腹腔有淡紅色腹水、腸腫脹、脾腫大和腎壞死。本研究中，以自然發(fā)病大菱鲆為試驗材料，分離純化獲得一株優(yōu)勢菌BHAS-1，通過臨床癥狀觀察、生理生化鑒定和序列比對分析等方法，鑒定其為殺鮭氣單胞菌殺日本鮭亞種。本研究中首次報道了中國殺鮭氣單胞菌殺日本鮭亞種對養(yǎng)殖大菱鲆的自然感染致病，通過對分離菌株開展毒力基因檢測、藥敏試驗等，以期為該菌引起的非典型癤瘡病的有效防控提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用無典型癤瘡病癥狀的大菱鲆樣品于2020年10月采自山東省煙臺市某深井海水室內(nèi)流水養(yǎng)殖車間，養(yǎng)殖水溫為17 ℃左右，患病個體體質(zhì)量為83.4～433.3 g，平均體質(zhì)量為248.3 g。試驗用健康大菱鲆購自煙臺宗哲海洋科技有限公司。

水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(muller hinton，MH)、腦心浸液培養(yǎng)基(brian heart infusion，BHI)、革蘭氏染色試劑盒和生理生化鑒定管等均購自北京陸橋技術股份有限公司；藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司；細菌基因組提取試劑盒、PCR擴增相關試劑購自寶生物(大連)有限公司；試驗引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離純化 取有典型病征的瀕死個體，首先進行體表、鰓等組織的寄生蟲檢查，然后用體積分數(shù)為75%的乙醇擦拭腹部，用無菌工具解剖，取肝、腎、脾等組織。經(jīng)無菌水沖洗、研磨后，在BHI瓊脂平板劃線，28 ℃下倒置培養(yǎng)24～48 h，觀察記錄菌落形態(tài)特征，取優(yōu)勢菌純化2～3次后，用終體積分數(shù)為40%的甘油保種，-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌株鑒定 采用革蘭氏染色法對菌株染色觀察，并應用生理生化鑒定管測定菌株生理生化特性。按照細菌基因組DNA提取試劑盒要求提取純化菌株DNA。分別使用16S rRNA通用引物(27F:5′AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3′，1 492R:5′GG- TTACCTTGTTACGACTT 3′)、DNA促旋酶B亞基基因(gyrase B，gyrB)特異性引物(F: 5′TCCGGCGGTCTGCACGGCGT 3′，R: 5′TTGTCCGGGTTGTACTCGTC 3′)和毒力陣列蛋白基因(又稱A層蛋白基因，virulence array protein A,vapA)特異性引物(F: 5′ACAGTGCACCGAAGGTTGAT 3′，R: 5′ACGGCAGAGCTTGTCTACCT 3′)進行擴增。

1.2.3 人工回歸感染試驗 將保存?zhèn)溆玫姆蛛x株活化后在BHI平板培養(yǎng)24～48 h，用質(zhì)量分數(shù)為0.9%的滅菌生理鹽水洗脫純培養(yǎng)物制成菌懸液，平板計數(shù)。將菌懸液分別制成4.1×107、4.1×108、4.1×109、4.1×1010CFU/mL 4個梯度濃度。選擇個體大小與患病個體接近的健康大菱鲆作為回歸感染對象，在車間暫養(yǎng)1周后，隨機分為5組，每組10尾，每尾腹腔注射梯度菌懸液0.1 mL，對照組注射相同體積的無菌生理鹽水。人工感染后養(yǎng)殖水溫為(17±0.5)℃，每天換水30%并記錄發(fā)病、死亡情況，取瀕死病魚的內(nèi)臟器官再次分離鑒定病原菌。按照改良寇氏法[17]計算半致死濃度。

1.2.4 毒力基因檢測 用PCR檢測分離菌株的氣溶素(aer)、封閉條帶毒素(zot)、DNA酶(dna)、絲氨酸蛋白酶(ser)、磷脂酶(lip)、S層蛋白(sp)、熱不穩(wěn)定性細胞興奮性腸毒素(alt)、細胞毒性腸毒素(act)、熱穩(wěn)定性細胞興奮性腸毒素(ast)、胞外蛋白酶(epa)、鞭毛蛋白(fla)和彈性蛋白酶(ahyB)等12個毒力相關基因的攜帶情況[18]，各毒力基因引物序列、退火溫度及目的片段大小見表1。PCR體系同“1.2.2節(jié)”，采用10 g/L瓊脂糖電泳檢測，紫外凝膠成像拍照后，將與預期目的片段大小一致的PCR擴增產(chǎn)物進行測序驗證。

表1 各毒力基因PCR引物、退火溫度和目的產(chǎn)物長度Tab.1 Primer sequence, annealing temperature and product sizes of virulence genes

1.2.5 藥敏試驗 參照美國臨床檢驗標準委員會(CLSI)推薦的紙片擴散法(Kirby-Bauer, K-B)操作標準進行抗生素藥物敏感性測試。按照麥氏比濁法將分離株制成濃度為1.0×108CFU/mL的菌懸液，均勻涂布于MH平板后，貼藥敏紙片，28 ℃下培養(yǎng)24 h后,根據(jù)菌落生長情況測定抑菌圈。測試用抗生素共計10類22種，每種藥物設置3個重復。依據(jù)CLSI[19]標準判定藥物敏感性，標準未涵蓋部分參照楊移斌等[20]的判定標準。

2 結果與分析

2.1 病原菌分離鑒定

2.1.1 病原菌分離與形態(tài)學觀察 在瀕死病魚體表、鰓和內(nèi)臟處均未觀察到寄生蟲感染。在內(nèi)臟組織中分離獲得多株形態(tài)、大小一致的優(yōu)勢菌，取脾組織獲得的優(yōu)勢菌命名為BHAS-1。該菌株在BHI平板上形成圓形、細小、白色的微隆起菌落，生長速度較為緩慢，菌落表面光滑濕潤、邊緣整齊，直徑為0.6～1.0 mm；在5%羊血(體積分數(shù)，下同)平板上菌落略大，24 h未發(fā)生溶血(圖1A)，72 h左右可見明顯的β溶血環(huán)(圖1B)；革蘭氏染色后顯微鏡檢為紅色、桿狀細菌(圖1C)。

A—5%羊血培養(yǎng)基中菌落形態(tài)(24 h，未發(fā)生溶血)；B—5%羊血培養(yǎng)基中菌落形態(tài)(72 h，β溶血)；C—革蘭氏染色顯微觀察。A—colony morphology cultured with 5% sheep blood plate, no hemolysis occurred after 24 h; B—colony morphology cultured in 5% sheep blood plate in 72 h with β hemolysis; C—observation with microscope.圖1 分離株BHAS-1的菌落形態(tài)及革蘭氏染色形態(tài)Fig.1 Colony morphology and micro-morphology of stain in strains BHAS-1

2.1.2 生理生化反應 該菌株在6.5%的NaCl中不能生長，無運動性，氧化酶反應、VP反應(Voges Proskauer,VP)、甲基紅反應呈陽性，不產(chǎn)生吲哚，不能利用鳥氨酸、賴氨酸脫羧，精氨酸雙水解呈陽性，不能利用苯丙氨酸脫氨，可以利用葡萄糖、麥芽糖、半乳糖、鼠李糖、山梨糖、蜜二糖、蔗糖和木糖產(chǎn)酸，具β-半乳糖苷酶活性，可以還原硝酸鹽，不能利用甘露糖、阿拉伯糖、阿拉伯醇、肌醇、枸櫞酸和苦杏仁苷，不能水解七葉靈和尿素。該菌株與殺鮭氣單胞菌殺日本鮭亞種、殺鮭亞種和無色亞種的部分生理生化指標見表2。

表2 BHAS-1的生理生化特性Tab.2 Physiological biochemical characteristics of BHAS-1

2.2 分子特征鑒定

擴增菌株BHAS-1的16S rRNA、gyrB和vapA基因，分別獲得1 452、1 073、1 652 bp的序列。

在線BLAST比對結果顯示：BHAS-1的16S rRNA序列與A.salmonicidasubsp.salmonidaATCC 33658株及A.salmonicidasubsp.masoucidaNBRC 13784株的同源性較高，一致性分別為99.84%和99.65%；BHAS-1的gyrB序列與A.salmonicidasubsp.masoucidaRFAS1株及A.salmonicidasubsp.salmonidaSL1株的同源性較高，一致性分別為99.62%和99.53%；BHAS-1的vapA序列與A.salmonicidasubsp.masoucidaRZ6S-1株同源性最高，一致性為99.63%，與其他亞種一致性均低于99%。分別基于殺鮭氣單胞菌不同亞種、溫和氣單胞菌A.sobria、中間氣單胞菌A.media、嗜水氣單胞菌A.hydrophila等菌株的16S rRNA、gyrB、vapA基因序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果顯示，在16S rRNA和gyrB系統(tǒng)發(fā)育樹中，BHAS-1與殺鮭氣單胞菌不同亞種聚為一支，而在vapA系統(tǒng)發(fā)育樹中，該菌株與殺日本鮭亞種單獨聚為一支，而殺鮭亞種則另外聚為一支(圖2)。

圖2 基于16S rRNA、gyrB和vapA基因序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strains BHAS-1 based on 16S rRNA,gyrB and vapA genes sequence

2.3 人工回歸感染試驗

人工感染2 d后，部分大菱鲆出現(xiàn)體表及鰭間紅斑潰瘍、腹部膨大和肛門紅腫等癥狀，解剖可見部分病魚腹水、肝充血、腸腫脹、脾腫大和腎壞死且內(nèi)有乳白色膿液等癥狀，與自然感染發(fā)病個體的癥狀相似，發(fā)病個體典型癥狀見圖3。最高濃度組注射后第3天開始出現(xiàn)死亡，死亡高峰在第5～7天，第9天時全部死亡；次高濃度組第4天開始出現(xiàn)死亡，第14天時累計死亡率為90%，對照組無死亡，各濃度組累計死亡情況詳見圖4。根據(jù)各濃度組死亡情況，采用改良寇氏法計算LD50為1.62×108CFU/mL。從人工感染發(fā)病魚體再次分離病原菌，可得到與BHAS-1形態(tài)、生理生化結果一致的菌株，因此，認為分離株BHAS-1是引起大菱鲆上述癥狀的致病菌。

用線支撐連接其墻板頂部、框架梁，把已經(jīng)預留好的U型插口，選擇鋼筋從上部內(nèi)側插入，同時連接好鋼筋和梁，選擇現(xiàn)澆混凝土。架起梁主筋，以柱箍筋為支撐，并且套住已經(jīng)掰開的箍筋，依據(jù)自下而上的方式。此方式操作方便快捷、施工簡單，可以確保構件滿足抗震需求，上端錨起到固定連接作用，下端只是用來限位連接。

A—鰭間紅斑潰瘍；B—腸腫脹；C—肛門紅腫；D—脾、腎腫大。A—body surface scabies; B—intestinal enlargement; C—red and swollen anus; D—enlarged kidney and spleen.圖3 人工感染BHAS-1菌大菱鲆主要癥狀Fig.3 Main symptoms of challenged with BHAS-1 turbots

圖4 人工回歸感染累計死亡曲線Fig.4 Accumulative death number of turbot experimentally infected with strains BHAS-1

2.4 分離菌株的毒力基因型

經(jīng)PCR擴增檢測，BHAS-1攜帶的毒力基因片段長度全部與目的片段長度一致，毒力基因型為aer+-zot+-dna+-ser+-lip+-sp+-alt+-act+-ast+-epa+-fla+-ahyB+(圖5)。

M—DNA分子質(zhì)量標準；1～12分別為aer、zot、dna、ser、lip、sp、alt、act、ast、epa、fla、ahyB基因。M—DNA marker; 1-12，aer，zot，dna，ser，lip，sp，alt,act,ast,epa,fla and ahyB genes.圖5 分離株BHAS-1毒力基因的PCR檢測Fig.5 PCR products of the virulence genes from the isolated strains BHAS-1

2.5 藥敏試驗結果

菌株BHAS-1對10類22種測試抗生素的敏感性存在差異，對頭孢曲松、頭孢拉定、頭孢哌酮、慶大霉素、諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、四環(huán)素、鹽酸多西環(huán)素、紅霉素、多黏菌素B和呋喃唑酮等7大類13種抗生素類藥物敏感，僅從測試抗生素來看，藥物敏感率為59.09%；對青霉素、卡那霉素、磺胺異惡唑、復方新諾明、萬古霉素、利福平和氯霉素等6類7種抗生素耐藥，耐藥率為31.82%；對氨芐西林和鏈霉素2種抗生素中度敏感，中介率為9.09%(表3)。

表3 分離株BHAS-1對10類22種抗生素的敏感性Tab.3 Sensitivity of strains BHAS-1 to 22 kinds of antimicrobial drugs

3 討論

3.1 殺鮭氣單胞菌亞種的鑒定

氣單胞菌是一類水生革蘭氏陰性桿菌，廣泛分布于海水和淡水動物及其環(huán)境中。其中，嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌和殺鮭氣單胞菌是重要的水生動物致病菌[21]。殺鮭氣單胞菌是已知的最古老的病原菌之一，自1984年作為一個雜交組從嗜水氣單胞菌復合物中分離以來，陸續(xù)有5個亞種被認定，其中包括4個嗜冷亞種(殺鮭亞種、殺日本鮭亞種、無色亞種、史氏亞種)及1個嗜常溫亞種(溶果膠亞種)[22]。不同亞種的形態(tài)學和生理生化特性略有差異，根據(jù)色素產(chǎn)生能力、溶血性和能否發(fā)酵糖等亞種特性，通常將無性系種群——殺鮭亞種稱為典型株(typical)，其他亞種及不符合亞種特征的菌株稱為非典型株(atypical)[23]。

根據(jù)Gulla等[24]提出的以發(fā)生溶血，在色氨酸酵母培養(yǎng)基中可產(chǎn)生棕色水溶性色素，產(chǎn)生吲哚反應，水解明膠、七葉靈，可利用阿拉伯糖、甘露糖等作為殺鮭氣單胞菌典型株的判定標準，本研究中分離獲得的BHAS-1株不能同時具備上述特征，系非典型株。與典型株的高度同質(zhì)化不同，非典型株種類較多且異質(zhì)化程度高，亞種特性差異較大[25]。本研究中，分離株的吲哚反應、甘露糖發(fā)酵兩項結果與相關文獻結果不同，推測出現(xiàn)偏差可能與宿主來源、菌株變異和環(huán)境適應等因素有關。分離株生理生化指標出現(xiàn)與模式株不同結果的報道較多[10-11,17]，僅依靠生理生化特性不能對殺鮭氣單胞菌非典型株進行準確鑒別，需要其他手段輔助。

不少學者嘗試通過擴增各類基因鑒別殺鮭氣單胞菌不同亞種。呂俊超等[11]應用16S rRNA對分離的殺鮭氣單胞菌鑒定時，分離株與無色亞種聚成一個分支，確定分離株為殺鮭氣單胞菌無色亞種。但更多學者分離的菌株與多個亞種聚在一起[10,17,20]，無法通過該基因直接鑒定到亞種水平，需結合其他測試結果綜合判斷，gyrB[11]、ropD[10]、fstA[26]、dnaJ[27]和recA[27]等基因亦是如此。由此可見，上述基因在殺鮭氣單胞菌種內(nèi)高度保守，不能直接用于亞種鑒別，僅可作參考。本研究中得到與上述結論一致的結果，分離株BHAS-1在以16S rRNA和gyrB序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹中與多個亞種聚為一支，只能得出與殺日本鮭亞種、殺鮭亞種和無色亞種最為接近的結論。近年來，應用vapA對殺鮭氣單胞菌進行亞種分類的報道漸多，除溶果膠亞種外，其他亞種均具有明顯不同的A層結構[24]，許氏平鲉[27]、大菱鲆[28]、鱖魚[29]來源的分離株均應用該基因?qū)崿F(xiàn)了亞種水平的有效鑒別。本研究中，擴增測序了分離株的vapA基因片段并構建系統(tǒng)發(fā)育樹，分離株與殺日本鮭亞種單獨聚為一支，通過該系統(tǒng)發(fā)育樹可以判斷分離株系殺日本鮭亞種。vapA在殺鮭氣單胞菌種內(nèi)的高度變異，使得快速、準確鑒別不同亞種或非典型株成為可能，且該基因表現(xiàn)出一定的宿主特異性[24]。

3.2 殺鮭氣單胞菌非典型株感染的臨床癥狀與感染途徑

有研究認為，殺鮭氣單胞菌典型株一般以引起魚類癤瘡為主要病征，而非典型株則以皮膚潰瘍或非典型癤瘡為主[30]，癥狀主要表現(xiàn)為鰓部、漿膜和鰭基部充血、敗血等[31]。在國外已有多種殺鮭氣單胞菌非典型株感染大菱鲆致病的報道[28,32]，國內(nèi)僅有無色亞種[1,11,15,33]感染報道。無色亞種感染大菱鲆表現(xiàn)為鰭基部、口周和鰓部出血，腹腔腹水，組織病理主要發(fā)生在鰓、皮膚、肌肉、腎臟、脾臟和心臟等組織，肝臟可檢出病原菌，但無明顯組織病變，腸無病變[32]。值得注意的是，該研究中，人工感染癥狀與自然感染并不完全一致，人工感染未觀察到自然感染發(fā)病大菱鲆出現(xiàn)的肝臟、腎臟充血[32]。中國報道的大菱鲆無色亞種感染則有皮下出血[11]、典型化膿癤瘡癥[15]和紅斑潰瘍癥[33]等不同表現(xiàn)。由此可見，殺鮭氣單胞菌非典型株致病臨床表現(xiàn)與病理特征存在差異，即使同一亞種感染亦有不同臨床癥狀，這可能與感染菌株毒力特征、宿主反應等有關。本研究中,以自然感染發(fā)病大菱鲆為對象，從無典型癤瘡病癥的瀕死大菱鲆內(nèi)臟分離到一株優(yōu)勢菌，經(jīng)生理生化和分子生物學鑒定，判定為殺鮭氣單胞菌殺日本鮭亞種?；貧w感染試驗中，急性死亡病例未出現(xiàn)明顯癤瘡，慢性感染死亡有體表、鰭間紅斑潰瘍的病例，病理特征主要表現(xiàn)為腸道腫脹、脾腫大和腎壞死。鑒于無色亞種感染的不同臨床表現(xiàn)，本研究中分離株感染出現(xiàn)的表觀特征是否是殺日本鮭亞種的主要感染癥狀，仍需更多數(shù)據(jù)支撐。

除此之外，不同感染方式下的臨床癥狀與半致死濃度均有差異。Han等[27]用殺日本鮭亞種人工感染許氏平鲉時發(fā)現(xiàn)，肌肉注射比腹腔注射癥狀更明顯且較嚴重，肌肉注射時注射部位出現(xiàn)明顯潰瘍，而腹腔注射部位僅發(fā)紅無潰瘍，腹腔注射的半致死濃度可高于肌肉注射10倍甚至100倍。浸泡感染所需濃度更高，且致死率低[34]，在確定腹腔注射半致死濃度為105CFU/mL時，用100倍濃度浸泡攻毒，并不能引起大菱鲆感染或死亡[32]。在本研究的人工感染預試驗中，用1010CFU/mL的BHAS-1株浸泡大菱鲆24 h，受試動物無發(fā)病和死亡，魚組織中不能分離到病原菌，用同樣濃度腹腔注射，24 h內(nèi)致死率為100%(數(shù)據(jù)未列出)，這說明殺鮭氣單胞菌致病與感染途徑密切相關。研究表明，殺鮭氣單胞菌典型株可通過體表損傷、鰓和腸上皮細胞3條途徑入侵魚體[35]。Du等[34]研究殺日本鮭亞種對大西洋鮭感染的致病機理時得出類似結論，認為上述3條途徑亦是殺日本鮭亞種最有可能的感染途徑，致病菌通過鰓、皮膚、腸道進入魚體定植后，通過血液循環(huán)或鰓、皮膚、腸上皮進入脾、肝和腎等器官，引發(fā)全身感染。值得注意的是，該研究中，在人工感染后未發(fā)病存活的魚體內(nèi)仍能檢出細菌的存在[34]，提示在環(huán)境惡化時，致病菌可能會再次迅速繁殖，引起魚體感染或死亡。

3.3 殺鮭氣單胞菌的毒力基因與致病力

細菌的毒力因子是決定其致病力的重要因素之一，殺鮭氣單胞菌的毒力因子按功能可分為外毒素、胞外酶、黏附因子、抗藥基因、分泌系統(tǒng)、鐵攝取系統(tǒng)和群體效應7大類[17,23]。外毒素是某些細菌繁殖過程中分泌到菌體外的細菌毒素，常見的外毒素有氣溶素、溶血素和腸毒素等[36]。蛋白酶、脂肪酶和甘油磷脂-膽固醇?；D移酶等蛋白類胞外產(chǎn)物在殺鮭氣單胞菌致病性中也發(fā)揮著重要作用，這些酶能夠幫助細菌破壞并溶解宿主蛋白，導致宿主結構損傷，一些酶之間還可能產(chǎn)生協(xié)同作用[37]。氣單胞菌的主要黏附因子分為菌毛黏附素和非菌毛黏附素兩類，許多黏附因子的毒性由其外膜蛋白產(chǎn)生，如脂多糖、鞭毛蛋白和S層蛋白等[38]。本研究中，選取外毒素、黏附因子和胞外酶3類毒力因子，檢測到分離株BHAS-1攜帶5種外毒素(alt、act、ast、aer、zot)、5種胞外酶(epa、lip、dna、ser、alyB)和2種黏附因子(fla和sp)。

鑒于毒力基因數(shù)量、類型與致病力間的關系[39]，提示本研究中的分離株BHAS-1具有較強的致病力，但實際上BHAS-1的半致死濃度為1.62×108CFU/mL，并未表現(xiàn)出強毒株的致病能力。有研究證實，僅依據(jù)毒力因子的存在不足以預測殺鮭氣單胞菌在大菱鲆中的致病力，毒力基因不能作為決定毒力的唯一因素[40]，菌株致病能力除與毒力基因的種類數(shù)量有關外，還可能與其他因素有關，如溫度。溫度是影響致病力的重要因素，Wang等[28]通過28 ℃下連續(xù)傳代培養(yǎng)，獲得殺鮭氣單胞菌殺日本鮭亞種野生株R26S-1的衍生突變株R26S，衍生突變株LD50是野生株的10 000倍以上，毒力明顯減弱。通過基因組測序進一步分析發(fā)現(xiàn)，衍生突變株毒力減弱可能與T3SS(type three secretion system)分泌系統(tǒng)相關質(zhì)粒缺失有關。該系統(tǒng)在殺鮭氣單胞菌等革蘭氏陰性菌的毒力發(fā)揮中起重要作用[41]，結構蛋白在高溫應激下發(fā)生堿基缺失或插入重排，進而導致細菌種群中選擇衍生出弱毒株[42]。本研究中的分離純化均在28 ℃下進行，分離株BHAS-1是否因連續(xù)高溫傳代導致了某些基因突變，進而衍生為弱毒株，還有待進一步驗證。

此外，對細菌毒力因子開展深入研究對于細菌檢測及病害防控具有重要意義。Beaz-Hidalgo等[26]和Keeling等[22]分別依據(jù)殺鮭氣單胞菌fstA和vapA兩種特異性靶基因，建立了PCR和實時熒光定量PCR檢測方法；Chapela等[43]建立了殺鮭氣單胞菌、鰻弧菌V.anguillarum和海洋屈撓桿菌Tenacibaculummaritimum多重PCR，上述方法對殺鮭氣單胞菌的檢測最高靈敏度可達(5±0) fg，實現(xiàn)了基于保守毒力基因的病原菌快速檢測；缺少Ⅲ型分泌系統(tǒng)的弱毒株則可作為減毒活疫苗的候選[29]。

3.4 殺鮭氣單胞菌的藥物敏感性與病害防控策略

國內(nèi)曾有學者對不同來源的殺鮭氣單胞菌分離株進行抗生素敏感性測試，結果略有差異。呂俊超等[11]曾對2007年分離獲得的大菱鲆源殺鮭氣單胞菌無色亞種db14進行30種抗生素的耐藥測試，分離株對23種抗生素耐藥，對其中16種具有完全抗性；楊移斌等[20]對來源于斑點叉尾鮰的無色亞種ry01的藥敏結果顯示，該分離株對測試19種抗生素中的11種高度敏感，僅對磺胺異惡唑、利福平等7種藥物耐受；周紅霞等[10]測試來源于半滑舌鰨的殺鮭氣單胞菌對環(huán)丙沙星和恩諾沙星、諾氟沙星等8種藥物敏感，對利福平、氟苯尼考和硫酸新霉素等6種抗生素耐藥。盡管致病菌分離來源不同，但殺鮭氣單胞菌對喹諾酮類和β-內(nèi)酰胺類藥物表現(xiàn)較為敏感，對磺胺類和利福霉素類藥物普遍耐受。本研究中也得到一致的結論，分離株對22種抗生素耐藥表現(xiàn)不一致，整體耐藥率低于35%，對β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類和四環(huán)素類藥物較為敏感。在殺鮭氣單胞菌病防控中推薦交替使用鹽酸多西環(huán)素和恩諾沙星，謹防長期單一用藥產(chǎn)生耐藥。

盡管對分離株的藥物敏感性試驗可以較為直觀地確定敏感藥物，但對口服給藥來說，藥物代謝受其他多種因素影響，具體劑量仍需進一步驗證。De Ocenda等[44]研究了靜脈注射和口服兩種給藥方式下大菱鲆對氟苯尼考的藥代動力學，提出針對殺鮭氣單胞菌感染的最佳給藥方案：口服，初始劑量為30 mg/kg，而后調(diào)整劑量為18 mg/kg并持續(xù)給藥6次。在疫苗研究應用中，對大菱鲆接種鮭鱒魚商品化多價疫苗13周后,大菱鲆并未出現(xiàn)明顯免疫保護效果[32]。盡管在大菱鲆中該疫苗可以誘導殺鮭氣單胞菌細胞產(chǎn)生顯著的抗體反應，但對胞外產(chǎn)物并無作用，病原菌仍可對養(yǎng)殖大菱鲆構成潛在威脅，鮭鱒疫苗并不能對大菱鲆產(chǎn)生同樣的免疫保護作用，需針對不同對象開發(fā)專用疫苗。Yan等[45]基于殺鮭氣單胞菌殺日本鮭亞種研制了大菱鲆專用疫苗，12、24周時免疫保護率均可達84%以上，效果顯著，但該研究指出，此疫苗可能對其他亞種無效。經(jīng)過抗生素選擇，長期單一用藥可能導致病原菌產(chǎn)生耐藥，甚至多重耐藥，在生產(chǎn)中應有針對性地選擇敏感藥物，注重交替使用，重點研發(fā)并應用大菱鲆專用疫苗、中草藥類免疫增強劑等綠色防治手段，從源頭減低病害發(fā)生率。

4 結論

1)本研究從患非典型疥瘡病大菱鲆脾臟獲得一株無運動能力、β溶血的殺鮭氣單胞菌非典型株。

2)在分子鑒定中，對比16S rRNA、gyrB、vapA基因擴增、BLAST序列比對結果，表明應用vapA基因可有效鑒別殺鮭氣單胞菌不同亞種，據(jù)此確定分離株為殺鮭氣單胞菌殺日本鮭亞種。

3)在殺鮭氣單胞菌引起的非典型疥瘡病防治中，推薦交替使用水產(chǎn)用鹽酸多西環(huán)素粉和恩諾沙星粉，并分別執(zhí)行750度日和500度日的休藥期。