鹽脅迫對藥用蒲公英生長特性及有效成分積累與離子吸收分配效應的影響

朱 瑜，谷 巍,2*，邱蓉麗，湯俊杰，劉夢雪，郎培蕾

(1. 南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210023；2. 江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023)

藥用蒲公英(Taraxacum officinale)為菊科蒲公英屬多年生草本植物，以干燥全草入藥，具有清熱解毒、消腫散結、利尿通淋等功效，其有效成分主要包括酚酸類，如綠原酸、咖啡酸、菊苣酸等[1]，其中菊苣酸為2020年《中華人民共和國藥典》規(guī)定的蒲公英藥材質控成分[2]。藥用蒲公英植株較大、產(chǎn)量高、生長迅速及抗逆性強，已成為中藥材市場的主流栽培品，在全國大部分地區(qū)均有種植[3]，然而在我國東北、西北以及東部沿海蒲公英主產(chǎn)區(qū)存在不同程度的土壤鹽漬化問題，為蒲公英生長帶來不利影響[4]。研究表明，蒲公英屬植物具有一定的耐鹽性，但過度鹽脅迫會抑制蒲公英生長[5]。

鹽漬土通常含有大量 Na+、Cl–、K+、Ca2+、Mg2+、CO32–和 SO42–等，其中 Na+和 Cl–含量最高、毒害最大[6]，不僅形成滲透脅迫，造成離子失衡，還限制植物對其他離子的吸收，造成營養(yǎng)虧缺[7]。此外，Na+毒害促進體內活性氧(ROS)大量積累形成氧化脅迫，破壞植物細胞正常的膜結構[8]，如葉綠體膜結構(葉綠體雙層膜解體，類囊體腫脹、排布混亂甚至解體)，影響植物光合同化能力[9]，最終限制植物生長發(fā)育。植物可以通過調節(jié)陽離子(Na+、K+、Ca2+、Mg2+)的吸收和運輸來維持離子穩(wěn)態(tài)，這是植物抵抗逆境的策略[10]。次生代謝調節(jié)也是植物應對環(huán)境脅迫的適應機制，次生代謝物如酚酸類、黃酮和萜類等非植物正常生長所需物質能作為抗氧化物質[11]、植物抗毒素[12]或信號分子[13]等提高植物抗逆性，而這些次生代謝物通常又是藥用植物的主要有效成分，是評價藥材品質的重要指標[14]。因此，本文對不同濃度鹽脅迫下藥用蒲公英生長特性、有效成分積累以及離子吸收分配效應進行研究，以探究藥用蒲公英對鹽脅迫的響應機制，為藥用蒲公英的栽培提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

藥用蒲公英取自南京中醫(yī)藥大學藥苑，并由南京中醫(yī)藥大學谷巍教授鑒定。

1.2 試驗設計

選取大小均勻、飽滿的供試藥用蒲公英種子，播種于直徑25 cm塑料花盆，每盆裝3.5 kg干燥園土(風干搗碎，過60目篩)。于人工氣候室培養(yǎng)，光/暗周期12 h / 12 h，晝夜溫度25/20±2 ℃，光照強度125 μmol·m–2·s–1，相對濕度 60%。當幼苗長至 3～4片真葉時，間苗。培養(yǎng)60 d后進行鹽脅迫處理[15]。向盆中噴灑不同濃度NaCl溶液，設置3個NaCl濃度梯度，使土壤NaCl含量分別為0.1%、0.2%、0.4%，以不作任何處理為對照(CK)，每組設置5個重復。托盤中滲出的水及時返盆，防止鹽分流失，每 2 d用稱重法補充蒸發(fā)所損失的水分(約200 mL)。處理24 d后，收集樣品進行相關指標測定和電鏡觀察。

1.3 指標測定

1.3.1 生物量測定

每處理組選取長勢一致的藥用蒲公英，洗凈根部泥土，將地上和地下兩部分用電子天平稱量鮮重，計算根冠比。于105 ℃殺青15 min后，70 ℃烘干至恒重，稱量地上和地下部分干重，兩者之和為全株干重。用LI-3000C葉面積儀(美國Li-Cor公司)測量總葉面積，計算葉面積比率(LAR)：葉面積比率=總葉面積(cm2)/植株干重(g)。

1.3.2 葉片相對含水量、葉綠素含量和凈光合速率測定

葉片相對含水量(RWC)測定參照Tounsi等[16]的方法；葉綠素含量測定參照李合生[17]的方法；用LI-6400XT便攜式光合儀測定凈光合速率(Pn)。

1.3.3 葉綠體超微結構觀察

在Bejaoui等[18]的方法上稍作修改。將藥用蒲公英同一葉位的同一部位(避開主脈)切成 0.5 mm ×3 mm小塊，2.5%戊二醛固定，0.1 mol·L–1磷酸緩沖液(pH 7.4)漂洗數(shù)次。用1%鋨酸室溫固定2 h，再經(jīng)0.1 mol·L–1磷酸緩沖液(pH 7.2)漂洗數(shù)次。經(jīng) 30%～100%乙醇梯度脫水后，環(huán)氧樹脂滲透包埋。用Leica UC7超薄切片機切片，厚度80 nm。經(jīng)醋酸雙氧鈾室溫染色，用Tecnai G 20 Twin透射電鏡在80.0 kV下拍照觀察。

1.3.4 離子含量測定及離子選擇性運輸能力計算

將藥用蒲公英樣品根、葉分開，用去離子水沖洗干凈后烘干粉碎，過80目篩。稱取0.2 g樣品粉末，加入6 mL硝酸消解。趕酸至剩余約1 mL，用超純水定容至50 mL。以6 mL硝酸不加樣品為對照。利用電感耦合等離子體質譜儀(NexION350D)測定不同鹽脅迫下藥用蒲公英根、葉中Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Cu2+和 Zn2+含量。

根據(jù)袁軍偉等[19]的方法計算不同器官對離子運輸選擇性系數(shù)(SX,Na)：SX,Na=庫器官[X/Na+]/源器官[X/Na+]，其中X 為K+、Ca2+和Mg2+中任意一種離子，其值越大表示源器官抑制Na+、促進X向庫器官運輸?shù)哪芰υ綇姟?/p>

1.3.5 菊苣酸含量測定

將藥用蒲公英洗凈曬干，打粉過 80目篩，按照《中國藥典》(2020年)的方法制備供試品溶液[2]。稱取菊苣酸對照品12.110 mg，用80%甲醇溶解定容至10 mL，配制成濃度1.211 mg·mL–1菊苣酸對照品溶液。利用Waterse2695高效液相進行含量測定，采用乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)進行梯度洗脫，流速 1 mL·min–1，進樣量 10 μL，檢測波長328 nm。色譜柱為 C18色譜柱(ZORBAX SB，Agilent)，柱溫35 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS25軟件的One-way Anova進行差異顯著性分析、LSD方法進行多重比較、Spearman相關性分析，采用GraphPad Prism 8軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫對藥用蒲公英生長特性的影響

如圖1所示，藥用蒲公英葉片和根系的生長隨著鹽脅迫濃度的升高受到抑制。CK組與0.1% NaCl處理的藥用蒲公英葉面積大，葉片鮮綠，且根系發(fā)達。0.2%和0.4% NaCl處理的藥用蒲公英葉片褪綠發(fā)黃，葉緣卷曲干枯，葉面出現(xiàn)褐色枯斑，且根系短小。

圖1 鹽脅迫下藥用蒲公英葉片與根系的形態(tài)變化Fig. 1 Morphological changes of leaves and roots of Taraxacum officinale under salt stress

如表1所示，0.1% NaCl處理的植株干重、葉面積比率和根冠比與 CK組無顯著差異(p>0.05)，但0.2%和0.4% NaCl處理的干重、葉面積比率均顯著下降，根冠比隨著鹽濃度的升高而升高，葉面積比率顯著降低而根冠比顯著升高，說明高鹽脅迫改變藥用蒲公英的生物量分配。Pn隨著鹽脅迫的加重呈下降趨勢，同時藥用蒲公英葉片總葉綠素含量隨著鹽脅迫濃度的升高而顯著降低，表明鹽脅迫顯著降低了藥用蒲公英光合能力。葉綠素含量降低也是葉片黃化褪綠的原因。在非鹽脅迫下，藥用蒲公英葉片相對含水量達 87.07%，葉片鮮嫩柔軟。鹽脅迫下，葉片相對含水量逐步降低且與 CK組差異顯著(p<0.05)，其中0.1% NaCl處理較CK降低7.5%，葉片鮮嫩柔軟，而0.2%和0.4% NaCl處理分別較CK降低22.4%和41.9%，葉片厚而干硬發(fā)脆。說明在0.2%和0.4% NaCl脅迫下藥用蒲公英葉片出現(xiàn)明顯的水分虧缺。

表1 鹽脅迫下藥用蒲公英的生長和生理指標Table 1 Growth and physiological indexes of Taraxacum officinale under salt stress

2.2 鹽脅迫對藥用蒲公英葉綠體超微結構的影響

由圖2可見，CK組藥用蒲公英葉綠體呈紡錘形，外膜完整，基質片層排列緊密，基粒片層垛疊整齊有序；0.1% NaCl處理組葉綠體呈紡錘形，外膜完整，基質片層排列較緊密，但在基質片層之間可觀察到細微的空隙，基粒片層垛疊整齊有序；0.2%NaCl處理組葉綠體出現(xiàn)腫脹，外膜完整，基質片層間出現(xiàn)較大片空隙，排列混亂，基粒垛疊變少，葉綠體中出現(xiàn)若干大的淀粉粒；0.4% NaCl處理組葉綠體腫脹，外膜部分溶解，基質片層完全紊亂，基粒垛疊全部消失，葉綠體中出現(xiàn)較大淀粉粒。此外，0.4% NaCl處理組還能觀察到短粒狀和球形線粒體，但部分線粒體外膜破裂，說明高鹽脅迫對藥用蒲公英葉綠體膜結構造成顯著損傷，光合同化產(chǎn)物在葉綠體中積累，向外運輸受阻。

圖2 不同濃度鹽脅迫下藥用蒲公英葉綠體超微結構Fig. 2 Ultrastructure of chloroplast of Taraxacum officinale under salt stress

2.3 鹽脅迫對藥用蒲公英根和葉離子吸收、運輸和分配的影響

2.3.1 鹽脅迫對根、葉離子含量的影響

圖3顯示不同濃度鹽脅迫下藥用蒲公英根和葉中離子含量的變化情況。0.1% NaCl處理組的藥用蒲公英葉片Na+含量較低，為1.17 mg·g–1，與 CK組無顯著差異；0.2%和0.4% NaCl處理組的葉片Na+含量較 CK 組顯著升高，分別達 10.26 mg·g–1和18.03 mg·g–1。鹽脅迫未對藥用蒲公英根 Na+含量造成顯著影響。CK組和0.1% NaCl處理組的根Na+含量顯著高于葉Na+含量，0.2%和0.4% NaCl處理組的根 Na+含量顯著低于葉。由此可知，低鹽脅迫藥用蒲公英葉片積累Na+較少，高鹽脅迫促進Na+在葉片大量富集，而根Na+含量不受鹽脅迫影響。

圖3 鹽脅迫下藥用蒲公英根和葉離子含量的變化Fig. 3 Changes of ion contents in roots and leaves of Taraxacum officinale under salt stress

藥用蒲公英根和葉的 K+含量整體表現(xiàn)為葉>根。隨著鹽濃度升高，葉K+含量呈先升后降的趨勢，其中 0.1% NaCl處理組的葉 K+含量顯著升高，達51.4 mg·g–1，0.2%和 0.4% NaCl處理組葉 K+含量較0.1% NaCl處理組顯著下降。藥用蒲公英根、葉的Ca2+和Mg2+含量整體表現(xiàn)為葉>根。葉Ca2+和Mg2+含量隨鹽濃度升高呈下降趨勢。不同濃度鹽脅迫并未對根K+、Ca2+和Mg2+含量造成顯著影響。

藥用蒲公英中各微量元素含量整體表現(xiàn)為：Fe2+>Mn2+>Zn2+>Cu2+。根和葉的 Fe2+含量整體表現(xiàn)為根>葉，隨著鹽脅迫加劇，根Fe2+含量顯著降低，但葉Fe2+含量與CK組無顯著差異。根和葉中Mn2+含量整體表現(xiàn)為葉>根，隨著鹽脅迫加劇，葉 Mn2+含量呈降低趨勢，而根Mn2+含量無顯著變化。各處理的根Cu2+含量與葉無顯著差異，0.4% NaCl處理的根、葉Cu2+含量較其他處理顯著下降。各處理Zn2+含量整體表現(xiàn)為葉>根。0.1% NaCl處理根、葉Zn2+含量與CK組無顯著差異，0.2%和0.4% NaCl處理的根、葉Zn2+含量顯著下降。

2.3.2 鹽脅迫下根和葉K+/Na+、Ca2+/Na+和Mg2+/Na+比值的變化

K+/Na+、Ca2+/Na+和 Mg2+/Na+的比值是衡量植物離子平衡破壞程度的指標。如表2所示，不同處理組藥用蒲公英根的 K+/Na+、Ca2+/Na+和 Mg2+/Na+比值變化小，差異不顯著。0.1% NaCl處理的葉K+/Na+、Ca2+/Na+和Mg2+/Na+比值與CK無顯著差異，而0.2%和0.4% NaCl處理的葉K+/Na+、Ca2+/Na+和Mg2+/Na+比值較CK顯著下降。

表2 鹽脅迫下藥用蒲公英根和葉K+/Na+、Ca2+/Na+和Mg2+/Na+比值的變化Table 2 Changes of K+/Na+, Ca2+/Na+ and Mg2+/Na+ ratios of different parts of Taraxacum officinale under salt stress

2.3.3 鹽脅迫對離子根至葉選擇性運輸?shù)挠绊?/p>

離子運輸選擇性系數(shù)反映植物根系對K+、Ca2+和 Mg2+向葉片選擇性運輸?shù)哪芰?，其值越大說明根向地上部分運輸Na+能力越弱，其抗鹽性越強[20]。由表3可知，0.1% NaCl處理藥用蒲公英根到葉SK,Na、SCa,Na和 SMg,Na升高(P<0.05)，分別為 CK 的1.986、1.246和1.147倍。隨著鹽脅迫濃度升高，SK,Na、SCa,Na和SMg,Na均顯著降低。其中0.2% NaCl處理的 SK,Na、SCa,Na和 SMg,Na分別較 CK 組降低90.0%、89.0%和89.2%；0.4% NaCl處理的SK,Na、SCa,Na和 SMg,Na分別較 CK 降低 92.7%、95.6%和94.1%。說明低鹽脅迫明顯增強根到葉片K+選擇性運輸?shù)哪芰?，而高鹽脅迫減弱根到葉 K+、Ca2+和Mg2+選擇性運輸?shù)哪芰Γ虻厣喜糠诌\輸Na+的能力增強。

表3 鹽脅迫下藥用蒲公英根-葉離子選擇性運輸?shù)淖兓疶able 3 The changes of ion selective transport from root to shoot of Taraxacum officinale under salt stress

2.4 藥用蒲公英生長特性與Na+含量的相關性分析

由表4可知，葉片生理指標(葉面積比率、凈光合速率、總葉綠素含量和葉片相對含水量)之間呈現(xiàn)極顯著正相關(P<0.001)。葉片 Na+含量與葉片生理指標呈極顯著負相關，與根冠比呈極顯著正相關。根 Na+含量與生長特性指標間無顯著相關。說明葉片Na+含量與葉片生長狀態(tài)緊密相關。

表4 藥用蒲公英生長特性與Na+含量的相關性分析Table 4 Correlation analysis of growth characteristics and Na+ content of Taraxacum officinale

2.5 鹽脅迫對藥用蒲公英菊苣酸含量的影響

菊苣酸含量為藥用蒲公英的質控成分，各處理藥用蒲公英的菊苣酸色譜檢測如圖4。不同濃度鹽脅迫下藥用蒲公英菊苣酸含量有不同程度變化，0.1% NaCl處理組菊苣酸含量與CK無顯著差異，0.2%和0.4% NaCl處理的菊苣酸含量顯著降低，分別為CK的65.4%和52.6%，說明高鹽脅迫降低了藥用蒲公英有效成分菊苣酸的積累(圖5)。

圖4 標準品及樣品色譜圖Fig. 4 Chromatogram of standard and samples

圖5 鹽脅迫對藥用蒲公英菊苣酸含量的影響Fig. 5 Effects of salt stress on the content of cichoric acid of Taraxacum officinale

3 結論與討論

鹽脅迫是限制植物生長發(fā)育的主要環(huán)境因子之一[21]。不同植物或植物不同器官的鹽敏感性不同使得植物生物量的分配在鹽脅迫下發(fā)生變化[22—23]。本實驗中，高鹽脅迫顯著提高藥用蒲公英根冠比，表明提高根冠比是植物應對鹽脅迫的方式之一[23]，另一方面高鹽脅迫降低葉面積比率，表明高鹽脅迫下單位生物量的葉面積減小，限制葉片對光能的利用[24]。鹽脅迫對植物的危害包括早期滲透脅迫和緩慢積累Na+形成的離子脅迫[25]。本研究中，葉片Na+含量與葉片生理指標顯著相關。低鹽脅迫下根和葉Na+含量較低，雖未對藥用蒲公英的生物量造成顯著影響，但葉片相對含水量降低，表明低鹽脅迫對藥用蒲公英形成一定的滲透脅迫；而高鹽脅迫下葉片Na+大量積累，葉片相對含水量大幅降低，表明高鹽脅迫對藥用蒲公英造成滲透脅迫和離子脅迫。在高鹽脅迫下，藥用蒲公英葉片黃化褪綠，凈光合速率顯著下降，從光合系統(tǒng)的角度分析，一方面鹽脅迫降低葉綠素含量導致參與光能吸收傳遞與轉化的葉綠素分子減少；另一方面，由于 Na+大量積累導致離子穩(wěn)態(tài)失衡產(chǎn)生大量活性氧形成氧化脅迫，對葉綠體膜結構造成損傷——類囊體基粒和基質片層排列紊亂甚至解體[26]。此外，在高鹽脅迫下葉綠體中大型淀粉粒的沉積，可能是由于光合能力下降，使得光合產(chǎn)物以淀粉的形式積累并抑制淀粉向外運輸[27]。綜上，藥用蒲公英葉片 Na+過度積累，對葉片生長發(fā)育有抑制作用，是葉片形態(tài)出現(xiàn)受害癥狀的原因。

離子吸收分配的改變是植物對鹽脅迫的響應。鹽脅迫下大量 Na+內流經(jīng)非選擇性陽離子通道進入細胞，導致靜息電位以下的膜電位去極化，從而激活K+外流通道促進K+排出[28]，同時Na+通過競爭性結合K+在細胞質代謝中吸收位點及活性位點，阻礙植株對 K+的吸收[29]。因此，增強 K+吸收維持較高的K+/Na+是植物適應鹽脅迫的重要機制。本實驗低鹽脅迫對藥用蒲公英造成滲透脅迫，葉片K+含量升高以及根向葉片 K+選擇性運輸能力(SK,Na)的增強，有助于調節(jié)滲透勢，緩解滲透脅迫[30]。而高鹽脅迫下由于 Na+大量富集打破葉片中K+/Na+平衡，抑制K+吸收，根向葉片 K+選擇性運輸能力(SK,Na)減弱，導致鹽害加重。根中K+和Na+含量以及K+/Na+不受鹽脅迫影響，說明藥用蒲公英根的離子平衡較穩(wěn)定。

Ca2+是植物細胞膜的構成成分，起著維持細胞膜結構和功能的作用。Mg2+是植物生長必需的營養(yǎng)元素，也是合成葉綠素分子組分之一。研究表明，Na+對 Ca2+和 Mg2+的吸收有拮抗作用，這是由于高濃度Na+置換細胞膜中Ca2+和Mg2+，且Na+濃度增加降低Ca2+和Mg2+離子活度，導致植物Ca2+和Mg2+含量降低[31]。本研究中，低鹽脅迫下藥用蒲公英葉片能維持較高的Ca2+/Na+和Mg2+/Na+；而高鹽脅迫下葉片 Na+含量增幅明顯高于 Ca+和 Mg2+的降幅，說明 Ca2+/Na+和 Mg2+/Na+比值下降主要是 Na+大量增加造成的。Na+富集抑制葉片對 Ca2+和 Mg2+的吸收，破壞離子平衡，此外Mg2+虧缺還影響葉綠素合成。相反，藥用蒲公英根Ca2+/Na+和Mg2+/Na+不受鹽脅迫影響，說明根部離子平衡穩(wěn)定，保證了根部正常生理活動。

Fe2+、Mn2+、Cu2+和Zn2+為植物生長所需的微量元素，參與多種生命活動。不同濃度鹽脅迫下植物對不同微量元素的吸收分配方式各異[32—33]。本研究中，F(xiàn)e2+在藥用蒲公英根中分布較多，且Fe2+含量隨鹽濃度升高而降低。研究表明，F(xiàn)e是氮還原性同化途徑中一系列還原酶的金屬輔因子[34]，鹽分通過抑制植物鐵載體的釋放而降低植物從土壤中獲取 Fe2+的能力[35]，推測鹽脅迫可能抑制藥用蒲公英根系對Fe2+的吸收，根部固氮能力下降，導致植物生物量降低。Mn在葉綠體PSII供體側區(qū)域形成錳簇，參與光合放氧[36]，本研究中葉片Mn2+含量隨鹽濃度升高而下降，說明Mn虧缺可能抑制藥用蒲公英光合作用中光反應的光合放氧，導致其光合能力下降。Cu和Zn是Cu/Zn SOD的金屬輔基，負責清除光合電子傳遞過程中形成的超氧化物和生理代謝產(chǎn)生的活性氧[37]。植物鋅指蛋白是一類龐大的轉錄因子家族，在植物生長發(fā)育、逆境脅迫應答以及信號轉導中發(fā)揮重要的調控作用[38]。本研究中，0.2%和0.4% NaCl處理的藥用蒲公英根、葉 Zn2+含量大幅下降，Cu2+含量在0.4% NaCl處理下顯著下降，表明高鹽脅迫下微量礦質元素的減少可能是影響藥用蒲公英生長代謝的原因之一。

菊苣酸是藥用蒲公英的次生代謝產(chǎn)物之一，其合成和積累與生長環(huán)境密切相關。一般過度鹽脅迫降低植物次生代謝產(chǎn)物的含量[39]。本研究中，低鹽脅迫下藥用蒲公英菊苣酸含量與CK組無顯著差異，但高鹽脅迫下菊苣酸含量顯著下降，說明0.2% NaCl以上濃度的鹽脅迫超出藥用蒲公英承受范圍，導致植株次生代謝紊亂，菊苣酸含量降低。

綜上所述，藥用蒲公英生長和有效成分積累受低鹽脅迫(0.1% NaCl)影響較小，植物通過維持較高的 K+/Na+和 Ca2+/Na+，增加 SK,Na、SCa,Na和 SMg,Na保證K+、Mg2+和Ca2+的向上運輸，提高耐鹽性。高鹽脅迫(≥0.2% NaCl)下，由于大量Na+在地上部分積累，導致離子失衡，形成離子毒害，破壞葉片正常的生理代謝和葉綠體超微結構，藥用蒲公英的生長及有效成分積累均受到抑制。