基于GC×GC-TOF-MS法比較兩種不同香型白酒的揮發(fā)性香氣成分

程 偉，陳雪峰，陳興杰，潘天全，薛錫佳，周 端，付 歡

（1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021；2.安徽金種子酒業(yè)股份有限公司，安徽 阜陽 236023；3.陜西農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究院，陜西 西安 710021）

中國白酒經(jīng)過2 000多年的釀造歷史和發(fā)展，已逐漸形成12種香型[1-3]；其中，大曲清香型白酒通常以低溫大曲作為糖化發(fā)酵劑[4]，采用“兩遍清”釀造工藝，以地缸作為發(fā)酵容器，突出乙酸乙酯和乙酸乙酯為主體的花果樣香氣；復(fù)合香型白酒是由2種或2種以上基本香型復(fù)合所派生出來的白酒香型，具有工藝復(fù)雜、香氣復(fù)合、風(fēng)味層次多樣等特點(diǎn)。金種子馥合香白酒（屬于復(fù)合香型白酒）采用“多曲并用、高溫堆積、分層出醅、分類蒸酒”的釀造工藝，“泥底磚壁”窖池作為發(fā)酵容器，其主體香氣成分較為復(fù)雜，具有“香氣復(fù)合幽雅”的風(fēng)格特點(diǎn)[5]。頂空固相微萃取法（head space-solid phase microextraction，HS-SPME）作為白酒樣品前處理的有效方法，具有操作簡單快速等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于白酒香氣成分研究領(lǐng)域[6-7]。1985年，PHILLIPS J B等[8-9]發(fā)明了全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜（two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry，GC×GC-TOF-MS）技術(shù)，解決了一維氣相色譜（one-dimen-sional gas chromatography，1DGC）不能有效分離復(fù)雜樣品中眾多成分的問題，其分辨率和靈敏度均較高，峰容量也較大；因而，該技術(shù)在復(fù)雜樣品揮發(fā)性成分分離方面具有重要的應(yīng)用前景。

當(dāng)前，GC×GC-TOF-MS技術(shù)已應(yīng)用到酒類香氣成分的分離鑒定并取得了相應(yīng)的應(yīng)用效果[10-12]。然而，關(guān)于江淮地區(qū)復(fù)合香型白酒中揮發(fā)性香氣成分的GC×GC-TOF-MS分析報(bào)道較少，尤其是關(guān)于大曲清香型白酒和復(fù)合香型白酒中揮發(fā)性香氣成分的對比研究還鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用頂空固相微萃取結(jié)合全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜法（HS-SPME-GC×GC-TOF-MS）分別對大曲清香型白酒和復(fù)合香型白酒中的揮發(fā)性香氣成分進(jìn)行檢測并對比分析，有助于增進(jìn)對這2種香型白酒香氣特點(diǎn)及其特征成分的認(rèn)識，為明確復(fù)合香型白酒的香氣特點(diǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

復(fù)合香型白酒（金種子馥合香特級原酒，酒樣編號為FH，酒精度為63.5%vol）、大曲清香型白酒（特級原酒，酒樣編號為DQ，酒精度為65.2%vol）：安徽金種子酒業(yè)股份有限公司；氯化鈉、無水硫酸鈉（均為分析純）：中國醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Pegasus 4D全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜（GC×GCTOF-MS）儀：美國LECO公司；7890A氣相色譜儀：美國Agilent公司；57330-U手動SPME進(jìn)樣器、2 cm 50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭：美國Supelco公司；Mili-QAdvantage超純水系統(tǒng)：美國Millipore公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)酒樣的前處理

采用去離子水分別將酒樣FH和DQ的酒精度稀釋到10%vol，置于4 ℃密封避光保存。

1.3.2 頂空固相微萃取方法

參照GAO W J等[13]的方法，在萃取時(shí)間上略有調(diào)整；取5 mL實(shí)驗(yàn)酒樣加入20 mL的頂空瓶中，并加蓋密封，在50 ℃條件下恒溫15 min；隨后將萃取頭插入頂空瓶中再萃取30 min后，將萃取頭立即插入250 ℃的GC進(jìn)樣口解吸附5 min，按照設(shè)定參數(shù)進(jìn)行GC×GC-TOF-MS分析，相同條件下進(jìn)樣3次；萃取頭在每次使用前插入240 ℃的GC進(jìn)樣口解吸10 min。

1.3.3 GC×GC-TOF-MS儀器分析方法[14]

氣相色譜條件：第一維柱為DB-WAX色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm），進(jìn)樣溫度250 ℃，初始溫度40 ℃保留5 min，以5 ℃/min升至220 ℃，以20 ℃/min升至250 ℃，保留2.5 min；載氣為氦氣（He）（純度99.999 9%），流速1.0 mL/min，無分流，進(jìn)樣量0.5 μL。第二維柱為DB-17MS色譜柱（2 m×100 μm×0.10 μm），柱溫高于第一維柱5 ℃，調(diào)制解調(diào)器溫度始終保持高于第二維柱5 ℃，兩根色譜柱以串聯(lián)方式連接，全二維分析調(diào)制周期4.0 s。

質(zhì)譜條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，傳輸線溫度280 ℃；檢測器電壓1 365 V，采集質(zhì)譜掃描范圍35～500 amu、采集頻率100spectrum/s。

1.3.4 GC×GC-TOF-MS數(shù)據(jù)處理

采集的TOF-MS數(shù)據(jù)由美國LECO公司Chroma TOF工作站進(jìn)行處理，自動識別信噪比＞50的色譜峰并比對美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）14和Wiley 9質(zhì)譜庫，經(jīng)過人工解譜與同系物二維色譜出峰規(guī)律比對后，去除烷烴類等沒有風(fēng)味貢獻(xiàn)的化合物；再選擇相似度與反相似度均＞700，可能性＞4 000的化合物，在Chroma TOF軟件中建立保留指數(shù)計(jì)算方法；再確定化合物一維色譜柱保留指數(shù)，并與文獻(xiàn)報(bào)道的保留指數(shù)比對，選擇數(shù)值差異在50以內(nèi)的化合物作為鑒定結(jié)果[15]。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

采用WPS Office Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并對鑒定結(jié)果中主要香氣成分的種類和香氣感官特點(diǎn)進(jìn)行分類，采用Cytoscape 3.7.1軟件繪制關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 白酒揮發(fā)性香氣成分GC×GC-TOF-MS分析總離子流色譜圖

基于全二維氣相色譜的分離機(jī)理以及DB-WAX（30 m×250 μm×0.25 μm）色譜柱和DB-17MS（2 m×100 μm×0.10 μm）色譜柱的特性，本實(shí)驗(yàn)采用一維DB-WAX色譜柱搭配二維DB-17MS色譜柱，分別對2種不同香型白酒中的揮發(fā)性香氣成分進(jìn)行分離，2D總離子流色譜圖見圖1。

圖1 酒樣DQ（a）和FH（b）中揮發(fā)性香氣成分GC×GC-TOF-MS分析總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatograms of volatile aroma components in Baijiu samples DQ (a) and FH (b) analyzed by GC×GC-TOF-MS

由圖1可知，白酒中的揮發(fā)性香氣成分通過二維色譜獲得了一定的分離效果，但是仍然存在共流出現(xiàn)象，還有待于進(jìn)一步分析原因。采用該技術(shù)在樣品DQ和FH中檢測到的色譜峰分別為316個(gè)和729個(gè)，采用多級鑒定策略確認(rèn)了可信度較高的揮發(fā)性香氣成分分別為251種和341種，表明樣品FH中的揮發(fā)性香氣成分較DQ復(fù)雜。

2.2 GC×GC-TOF-MS法測定不同香型白酒的揮發(fā)性香氣成分

GC×GC-TOF-MS法測定2種不同香型白酒揮發(fā)性香氣成分類別及數(shù)量，結(jié)果見表1。由表1可知，酒樣DQ和FH中分別鑒定出可信度較高的揮發(fā)性香氣成分251種和341種；其中，酯類分別為56種和117種，醇類分別為54種和70種，有機(jī)酸類分別為38種和43種，醛、酮、縮醛類分別為30種和47種，揮發(fā)性含硫化合物分別為6種和14種，含氮化合物分別為6種和9種（酒樣FH中鑒定出吡嗪類7種），呋喃類分別為21種和16種，其他類化合物分別為40種和25種。

表1 酒樣DQ和FH中揮發(fā)性香氣成分類別及數(shù)量Table 1 Types and quantities of volatile aroma components in Baijiu samples DQ and FH

綜上表明，酒樣DQ和FH中的主要揮發(fā)性香氣成分包括酯類、醇類、酸類、醛酮類等化合物；其中，大部分的酯類具有瓜果樣香氣，醇類和酸類賦予酒體飽滿或醇厚的感官及滋味，醛酮類通常具有特殊香氣，各類揮發(fā)性香氣成分的復(fù)合及協(xié)同形成了酒樣DQ和FH不同香型白酒的獨(dú)特感官及風(fēng)格特征。由于含氮、含硫及呋喃類化合物通常具有特殊香氣或生理功能，且閾值較低，雖然在酒體中的種類或含量較少，但可能對酒體的香氣具有重要影響；因而，在鑒定出的揮發(fā)性香氣成分中著重對比分析了含氮、含硫和呋喃類化合物。

2.2.1 呋喃類化合物

呋喃類化合物是構(gòu)成許多天然食品香氣特征的重要成分，具有閾值低、香氣獨(dú)特等特點(diǎn)，包括呋喃酯類、呋喃醇類、酰基呋喃類、其他呋喃類化合物等。有研究表明，呋喃類化合物是醬香型白酒的重要呈香物質(zhì)和特征化合物[16]。GC×GC-TOF-MS法測定不同香型白酒中呋喃類化合物，結(jié)果見表2。由表2可知，酒樣DQ和FH中均鑒定出的呋喃類化合物有5種，分別是苯并呋喃、呋喃、2-甲基-呋喃、2-戊基-呋喃、糠醛；其中，苯并呋喃由稠合的雜環(huán)化合物組成，具有廣泛的生物作用，如抗菌、抗腫瘤和抗炎等[17]。酒樣FH中鑒定出特有的乙酸糠酯、2-乙基-5-甲基呋喃、5-甲基-呋喃醛、2-正戊基-呋喃等均具有特殊香氣，而酒樣DQ中未檢測到這幾種呋喃類化合物。呋喃類化合物是白酒中重要的呈香和功能性物質(zhì)，釀酒工藝及蒸餾環(huán)境是影響酒體中呋喃類化合物種類及含量的重要因素。

表2 酒樣DQ和FH中呋喃類化合物GC×GC-TOF-MS分析結(jié)果Table 2 Results of furan compounds in Baijiu samples DQ and FH analyzed by GC×GC-TOF-MS

續(xù)表

2.2.2 含硫化合物

揮發(fā)性含硫化合物在食品及酒精飲料中的含量極低，其具有香氣閾值極低、香氣獨(dú)特等特點(diǎn)，食品中含硫化合物的檢測具有較強(qiáng)的挑戰(zhàn)性[18]。GC×GC-TOF-MS法測定不同香型白酒中含硫化合物，結(jié)果見表3。由表3可知，酒樣DQ和FH中鑒定出的含硫化合物分別為6種和14種，在酒樣DQ中鑒定出的6種含硫化合物均在酒樣FH中被檢測到；另外，在FH中還檢測到特有的8種含硫化合物，均具有特殊香氣。酒樣FH中鑒定出的三甲基二硫具有冷薄荷氣味和辛香香氣，2-噻吩甲醛具有類似杏仁香氣，硫代丁酸甲酯具有乳酪、番茄、硫化物樣香氣[19]，該類香氣成分可能對酒樣FH復(fù)合香氣的形成具有重要作用。綜上可知，酒樣FH中鑒定出的8種特有含硫化合物均可作為區(qū)別于酒樣DQ的特殊香氣成分。

表3 酒樣DQ和FH中含硫化合物的GC×GC-TOF-MS分析結(jié)果Table 3 Results of sulfur compounds in Baijiu samples DQ and FH analyzed by GC×GC-TOF-MS

續(xù)表

酒樣FH的釀造采用“多曲并用”工藝，糧醅經(jīng)過“高溫堆積”過程，有利于耐高溫產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌菌群的代謝，促進(jìn)了原料中含硫蛋白質(zhì)的分解與轉(zhuǎn)化，可能產(chǎn)生對酒體香氣具有積極貢獻(xiàn)的含硫化合物。酒樣DQ釀造過程中采用低溫大曲、“兩遍清”工藝，其制曲溫度與糧醅發(fā)酵溫度均低于馥合香白酒，釀造體系中的霉菌及適宜中低溫的細(xì)菌菌群較為豐富；因而，其酒體中酯類和含硫化合物的含量和種類與馥合香白酒相比明顯較低，其酒體較為“醇凈”。

2.2.3 含氮化合物

白酒中的含氮化合物以吡嗪類為主，該類化合物通常具有特殊香氣，如2-甲基吡嗪具有烤面包、烤杏仁或炒花生似的香氣，2,5-二甲基吡嗪具有炒豆似的香氣，三甲基吡嗪具有咖啡香、烤面包香氣[20]。吡嗪類化合物對促進(jìn)白酒的香氣優(yōu)雅具有積極作用，該類物質(zhì)是醬香和芝麻香等香型白酒中的重要香氣成分和特征物質(zhì)[21-22]；其中，四甲基吡嗪具有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)及抑制血小板積聚、增強(qiáng)機(jī)體免疫等多種生物活性[23]。GC×GC-TOF-MS法測定不同香型白酒中的含氮化合物，結(jié)果見表4。由表4可知，酒樣DQ和FH中鑒定出的含氮化合物分別為6種和9種，包括在酒樣FH中檢測到特有的7種吡嗪類化合物；因此，該7種特有的吡嗪類化合物可作為酒樣FH區(qū)別于酒樣DQ的特殊香氣成分。

表4 酒樣DQ和FH中含氮化合物的GC×GC-TOF-MS分析結(jié)果Table 4 Results of nitrogen-containing compounds in Baijiu samples DQ and FH analyzed by GC×GC-TOF-MS

白酒中的吡嗪類物質(zhì)主要來源于美拉德反應(yīng)、微生物代謝、蛋白質(zhì)和氨基酸的熱分解等過程，具有特殊生物活性的吡嗪類物質(zhì)（如四甲基吡嗪）賦予中國白酒以健康功能[24]。酒樣FH的釀造采用高溫大曲、芝麻香麩曲和中溫大曲的分階段使用，其制曲、糧醅堆積與固態(tài)發(fā)酵溫度均明顯高于大曲清香型白酒，促進(jìn)了美拉德反應(yīng)的進(jìn)行，有利于產(chǎn)生和積累吡嗪類物質(zhì)；而且配糟發(fā)酵工藝也有利于吡嗪類物質(zhì)在酒體中的積累。對酒樣DQ的釀造而言，其制曲和發(fā)酵溫度均不高[25-26]，以及采用的“兩遍清”工藝均不利于吡嗪類物質(zhì)的產(chǎn)生與積累。

2.3 DQ與FH的主要香氣成分及其感官特征的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)

對酒樣DQ與FH鑒定結(jié)果中主要香氣成分及其感官特征進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以建立關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)見圖2。外圍區(qū)域相同顏色的各點(diǎn)代表香氣成分類別，內(nèi)部區(qū)域不同顏色的各點(diǎn)代表香氣感官屬性。由圖2可知，酒樣DQ中的水果氣、青草氣、甜氣等6種香氣感官屬性均可被GC×GC-TOF-MS香氣成分的鑒定結(jié)果解釋；酒樣FH香氣感官屬性中的香酯氣、水果氣、甜氣等9種香氣感官屬性均可被GC×GC-TOF-MS香氣成分的鑒定結(jié)果解釋。關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)果也表明，酒樣FH的香氣明顯比DQ豐富，F(xiàn)H的水果氣關(guān)聯(lián)成分明顯，這與FH中酯類物質(zhì)的種類明顯較DQ多有關(guān)。香氣成分及其感官特征關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，酒樣FH與DQ相比，具有“香氣復(fù)合幽雅”的風(fēng)格特點(diǎn)。

圖2 酒樣DQ（a）和FH（b）中主要揮發(fā)性香氣成分及其感官特征關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Associated network diagram of main volatile aroma components and sensory characteristics in Baijiu samples DQ (a) and FH (b)

本研究建立的酒體中主要揮發(fā)性香氣成分及其感官特征的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，但是并沒有進(jìn)行香氣成分的定量和酒樣的感官品評等，這雖然不能充分明確酒體中的關(guān)鍵或特征香氣成分，但在一定程度上反映了GC×GC-TOF-MS香氣成分鑒定結(jié)果的可信度。Pearson相關(guān)系數(shù)法可以評估2個(gè)連續(xù)變量之間的線性關(guān)系，因此采用Pearson分析建立酒樣DQ和FH的感官品評結(jié)果與香氣成分定量結(jié)果之間的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，對認(rèn)識酒樣DQ和FH的香氣特征具有重要意義，還有待于深入研究。

3 結(jié)論

由于原料、工藝、發(fā)酵容器及環(huán)境等因素的影響，導(dǎo)致不同香型白酒中香氣物質(zhì)及特征成分的差異，酒體的感官風(fēng)格也存在較大差異。本實(shí)驗(yàn)基于HS-SPME-GC×GC-TOFMS法分別檢測酒樣DQ和FH中的揮發(fā)性香氣成分，并進(jìn)行對比分析。結(jié)果表明：采用多級鑒定策略，分別在酒樣DQ和FH中確認(rèn)了可信度較高的揮發(fā)性香氣組為251種和341種，主要包括酯類、醇類、酸類、醛酮醛類，還包括呋喃類、含氮、含硫以及其他化合物；在FH中鑒定出特有的揮發(fā)性含硫化合物和吡嗪類化合物分別為8種和7種，其均具有特殊香氣或生物活性，均可作為區(qū)別于DQ的特殊香氣成分；采用香氣成分及其感官特征的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析方法，在一定程度上反映了GC×GC-TOF-MS香氣成分鑒定結(jié)果的可信度。本實(shí)驗(yàn)有助于增進(jìn)對大曲清香、復(fù)合香等香型白酒香氣特點(diǎn)及其特征成分的認(rèn)識，為明確酒樣DQ和FH中的香氣特點(diǎn)提供基礎(chǔ)。