宮內生長受限湖羊新生羔羊的血漿代謝組學研究

孫玲偉， 何孟纖， 戴建軍， 吳彩鳳， 張德福， 林月霞

（上海市農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106）

我國綿羊和山羊的飼養(yǎng)量、出欄量、肉產量、皮產量和絨產量均居世界前列。原產于我國太湖流域的湖羊，具有易舍飼、早熟、四季發(fā)情、一年二胎且多羔等優(yōu)良性狀，越來越受到市場青睞[1]。生產中，往往由于其多胎性易造成妊娠期營養(yǎng)攝取不足，導致新生羔羊出現宮內生長受限（intrauterine fetal growth restriction, IUGR）[2]。IUGR是胎兒在母體內發(fā)育障礙的總稱，主要指新生兒的出生體質量低于同孕齡平均出生體質量的2個標準差或低于10%，主要表現為新生兒體質量和組織器官輕，肌肉系統(tǒng)、胃腸道系統(tǒng)或其他組織器官形態(tài)和功能發(fā)育不完善，不僅嚴重影響動物的健康，也給畜牧生產造成極大的損失[3]。IUGR一直是哺乳動物常見的產科并發(fā)癥之一，且多胎動物的發(fā)生概率高于單胎動物，生產中綿羊和豬的IUGR 現象尤為嚴重[4]。IUGR 新生羔羊往往自身體質較差、生命力弱，不僅增加羊場管理難度，也易引起母羊繁殖和飼料資源的浪費。針對IUGR，目前主要關注其對胎兒或新生兒組織器官的影響，或IUGR 的早期診斷和治療[5-6]。然而，新生兒的營養(yǎng)代謝是個復雜的動態(tài)系統(tǒng)，涉及多種物質的代謝進程，需要全景式地展現體內代謝變化，且IUGR 新生羔羊與健康羔羊間的代謝區(qū)別也尚需深入研究。

作為代謝組學的主要技術平臺之一，一維氫譜核磁共振（proton nuclear magnetic resonance spectra ，1H-NMR）能夠對生物的血液、尿液、乳汁等體液以及多種器官組織樣本進行分析，將正常生理狀態(tài)與病理狀態(tài)下多種小分子代謝物的表達差異進行分析，并對物質進行分離和鑒定，進一步通過生物信息學方法將研究中相關的外源性或內源性影響因素相結合，從而建立一定的生物學聯(lián)系[7]。1H-NMR 技術可以在同一時間得到多種分子信息，不僅檢測樣品需要量少，且具有良好的檢測重現性。目前，1H-NMR 已被廣泛應用于生物的代謝輪廓、藥物的作用機理、疾病的早期預防和診斷等多學科領域。Dessi 等[8]指出，新生兒的代謝異?？梢酝ㄟ^應用該技術全景式地闡釋代謝異常 過 程 。Sanz-Cortés 等[9]也 通 過1H-NMR 揭 示 了IUGR 新生兒臍靜脈血漿的特征性代謝變化。盡管已有許多關于新生兒的代謝組學研究報道，但有關綿羊新生IUGR 羔羊的血液代謝組較少。因此，本研究擬應用1H-NMR 技術分析IUGR 新生羔羊的血液樣品，旨在篩選IUGR 羔羊的特征性代謝物，從而全面了解IUGR 引起新生羔羊的機體代謝變化，對提高湖羊生產和繁殖性能具有積極的意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗在上海市永輝羊業(yè)有限公司開展，選?。?0.43±0.23）月齡和體質量（42.29±3.78）kg 的2～3 胎經產母羊，分別于 2021年 1—6月采集其分娩記錄以及新生活羔體質量，計算所有健康新生羔羊的平均體質量和標準差，以出生質量低于平均體質量2個標準差作為標準[10]選擇IUGR 羔羊。2018年7月，通過對適齡母羊進行同期發(fā)情與人工授精技術，隨機選取正常出生體質量羔羊（normal birth weight，NBW 組）和IUGR 羔羊（IUGR組）各7只。

1.2 樣品制備

新生羔羊按照體質量分為NBW組和IUGR組，在出生1 h 內采集其頸動脈血液樣品，于室溫、3 000 r·min-1離心 10 min 后，將分離的血漿樣品分裝后貯存于-80°C冰箱待測。

將樣品在室溫下解凍后，每份取400 μL 血漿樣品中加入重水 200 μL（含 0.05% TSP），渦旋震蕩 30 s，4 °C、12 000 r·min-1離心 10 min。最后取550 μL上清液至5 mm 核磁共振管，待樣品充分平衡后進行下一步檢測。

1.3 樣品1H NMR分析

將所有樣品應用600 MHz超導核磁共振譜儀（德國布魯克公司）采集數據。使用自旋回波模塊采集小分子信息，使用脈沖序列采用預飽和模塊壓制血漿樣品中的水峰[11]。檢測譜寬8 000 Hz，掃描64 次，弛豫延遲2 s，采集自由感應衰減信號96次，采樣間隔時間40 s。

1.4 1H-NMR數據處理

應用MestReNova 軟件對獲得的1H-NMR 譜進行傅里葉自動變換，對每個樣品進行相位和基線調整；對每個樣品的譜圖進行峰對齊，將TSP的化學位移定標（δ 0.00）[12]。通過 R 軟件包（http://cran.r-project.org/）進行自動積分，積分區(qū)間 δ 為0.40～8.50，以δ 0.002 為積分間距，去除殘余的水峰（δ 4.16～6.69）。最后，對譜圖進行分段積分，將其進行歸一化校正，用于下一步分析。

應用 SIMCA-P+軟件（V12.0 Umetrics AB，Umea,Sweden）對上述標準化處理的1H-NMR數據進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA），并進行驗證。

1.5 代謝物鑒定與通路分析

將數據導入Chenomx NMR Suite 軟件（Chenomx Inc.,Edmonton,Canada）進行譜圖歸屬，選定匹配好峰行和位移的化合物與商業(yè)數據庫（http://www.hmdb.ca 和 http://www.bmrb.wisc.edu）進行比對，確定檢測的代謝物。將篩選到的NBW組與IUGR 組差異代謝物在KEGG（https://www.kegg.jp/）數據庫進行代謝通路的檢索。

1.6 統(tǒng)計分析

采用SPSS 13.0 軟件對2 組新生羔羊體質量和1H-NMR 譜圖檢測的所有差異代謝物的峰面積平均值進行獨立樣本t檢驗。試驗結果以均值±標準誤（Mean±SEM）表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 IUGR新生羔羊體質量的變化

測定NBW 組羔羊體質量為（3.25±0.14）kg，IUGR 組體質量為（2.54±0.23）kg，IUGR 組新生羔羊的體質量比NBW 組羔羊低21.85%，說明2組新生羔羊體質量差異顯著（P＜0.05），符合IUGR的定義，可用于進行后續(xù)分析。

2.2 血漿樣品的1H-NMR譜圖分析

NBW 組和IUGR 羔羊血液樣品分別進行1H-NMR 譜的測定，經手動調相、基線校正和譜峰對齊及定標，得到血漿樣本的核磁圖譜。圖1為NBW組和IUGR組新生羔羊血漿樣品中具有代表性的1H-NMR 譜。譜圖中所有信號峰包含在δ 0.40～4.15和δ 6.70～8.50，為消除殘余水峰、尿素峰的影響，去掉δ 4.16～6.69 積分區(qū)間。其中，δ 6.70～8.50的區(qū)域是相對于δ 0.40～4.15的區(qū)域放大40倍以后的譜圖。

圖1 NBW組和IURG組血漿樣品代表性的600 MHz 1H-NMR圖譜Fig.1 Representative 600 MHz 1H NMR spectra of plasma samples from NBW and IURG groups

根據1H-NMR 化學位移譜庫、共享數據庫（KEGG、HMDB、METLIN）和組內自建數據庫，對2 組血漿樣品中所含代謝物進行歸屬和確認，共指認出32 種代謝物，主要包括糖類物質（α-葡萄糖、β-葡萄糖、乳酸、乙酸鹽、N-乙酰甘露糖胺、檸檬酸、異檸檬酸）、氨基酸類物質（亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、酪氨酸、N-乙酰半胱氨酸、1-甲基組氨酸、3-甲基組氨酸、苯丙氨酸、脲基丙酸、肌肽、甜菜堿、尿甘酸）和脂類物質（1-低密度脂蛋白/極低密度脂蛋白、3-羥丁酸、2-羥基異戊酸酯、磷酸膽堿、甲酸、肌酸、膽堿、甘油磷酸膽堿、2-異戊酸、丙酮、丙二酸）。

比較2 組代謝指紋波譜可見，某些化學位移值處波峰水平有明顯差異，表明2 組血漿代謝產物成分有明顯差異。由于檢測代謝物的峰值多，眼觀并不是分析不同組之間差異的有效手段，所獲取的信息非常有限。為了更完整地揭示2 組血漿樣品的變化，需釆用多變量統(tǒng)計方法對復雜的數據作進一步分析。

2.3 多元統(tǒng)計分析

2.3.1 PCA 分析 本研究首先將2 組1H-NMR 數據采用非監(jiān)督的多維統(tǒng)計方法進行建模，觀測樣品的總體代謝變化。PCA 分析后，獲得2個主成分，其中第1主成分（PC1）解釋原始數據中最大的變量，第 2 主成分（PC2）可以解釋第2 大變量，每個點表示1個樣本。PC1 和PC2 解釋率分別為50.29% 和18.11%，累計解釋率為68.40%。從PCA得分（圖2）可以看出，NBW 組和IUGR組樣本點明顯分離，分布區(qū)域完全分開，且具有分別向左上和右下分離的趨勢，代謝譜區(qū)別明顯。這說明2 組間差異在羔羊血漿代謝組層面得到一定體現，提示相對于健康新生羔羊，IUGR 羔羊的血液代謝譜發(fā)生了改變。為進一步放大各組間的差異，采用PLS-DA 找到與IUGR 發(fā)生密切相關的代謝產物。

圖2 NBW組和IUGR組新生羔羊血漿樣品的PCA得分Fig.2 PCA score of plasma form newborn lambs in the NBW group and the IUGR group

2.3.2 PLS-DA 分析 PLS-DA 是一種多因變量對多自變量的回歸建模方法，在代謝組學中主要用于回歸建模，是模型變量篩選的有效工具。相對于PCA 可以獲得更好的分類效果。利用PLS-DA采用PLS-DA 提取矩陣X（1H-NMR 數據）中的相關信息，預測變量Y（分組信息）的值，模型的模解釋度（R2Y）是84%，預測度（Q2）是64%。由圖3可見，2 組沿t[1]軸顯著分開，呈現最大化分離，而NBW組與IUGR組內部樣品比較集中，說明組內代謝差異較小。之后，對PLS-DA 模型進行500 次的排列驗證，Q2和R2的回歸線分別與y軸交點在負半軸和正半軸，且Q2和R2在最右端接近，說明該試驗的數據模型建立成功，即2組新生羔羊的血漿樣品的代謝物存在顯著差異。

圖3 2組新生羔羊血漿樣品的PLS-DA分析Fig.3 PLS-DA plot of newborn lambs in the NBW and the IUGR groups

2.4 差異代謝物與代謝通路分析

為進一步分析NBW組與IUGR組新生羔羊的血液代謝組差異，對與IUGR 疾病相關的差異代謝物進行篩選，獲得2 組間差異表達的代謝物共16個（表1）。與健康新生羔羊對比，IUGR 羔羊血漿中多個代謝物濃度發(fā)生改變，主要涉及脂代謝、氨基酸代謝、糖代謝等多條代謝通路。相較于NBW 羔羊，IUGR 羔羊血漿中多種脂代謝物均出現變化，主要包括低密度/極低密度脂蛋白（LDL/VLDL）、2-羥基異戊酸、膽堿、磷酸膽堿和甘油磷酸膽堿的表達上調，以及異戊酸的表達下調。IUGR 羔羊血漿中多種氨基酸和糖類含量均顯著降低，主要包括葡萄糖、乳酸、亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、酪氨酸、3-甲基組氨酸和N-乙酰半胱氨酸，進一步揭示IUGR 胎兒機體內氨基酸來源不足或利用增加。

表1 1H-NMR檢測的兩組間有顯著變化的代謝物峰強度Table 1 Peak intensity of significantly changed metabolites between the two groups based on 1H-NMR

3 討論

人類和動物流行病學研究證實，由于胎兒在母體內出現營養(yǎng)失衡（營養(yǎng)不足/過多）或代謝紊亂引發(fā)IUGR，會對其出生后的兒童和成年時期產生持續(xù)的影響，例如出現糖尿病、心血管疾病、神經精神疾病的發(fā)病風險[13]。目前，臨床上IUGR預斷和治療方法皆存在不足，例如確診時間晚、準確性不高或治療效果差等，均會對母體和胎兒造成不利影響等。因此，掌握IUGR 的發(fā)生機制，從而獲得準確性高的診斷方法和治療方式非常重要。本研究應用代謝組學的1H-NMR 檢測平臺分析IUGR 新生羔羊的血液代謝組，結果顯示，與健康新生羔羊對比，IUGR羔羊血漿中多個代謝物濃度發(fā)生改變，主要涉及脂代謝、氨基酸代謝、糖和能量代謝等多條代謝通路。

3.1 脂代謝分析

宮內生長的胎兒需要將獲得的營養(yǎng)物質轉化為脂肪組織，以保證出生的存活；同時，也將脂類物質轉化為能量物質，為其在宮內生長代謝提供能源。以往研究證實，IUGR胎兒在宮內脂肪合成出現抑制，引發(fā)脂質代謝紊亂[15]。

LDL 和VLDL 分別是機體內運輸內源性甘油三酯和膽固醇的主要形式，IUGR胎兒的臍靜脈血中LDL/VLDL 含量均高于健康新生兒，主要原因可能是由于機體內營養(yǎng)不足，引發(fā)體內脂質被過度動員分解[16]。膽堿及其膽堿化合物（磷酸膽堿和甘油磷酸膽堿）是哺乳動物細胞雙層膜的主要組成物質，本研究中IUGR 組羔羊膽堿及其膽堿化合物含量升高，表明細胞對其攝取減少而堆積在血漿中，這些改變可能引起細胞膜損傷或細胞增殖合成減慢，進一步引發(fā)某些器官生長發(fā)育受限[17]。2-羥基異戊酸是一種有機酸，在機內氧化應激狀態(tài)下會升高，新生兒大腦發(fā)育異常與機體內2-羥基異戊酸的異常升高有關，也進一步提示，在IUGR新生羔羊可能會出現大腦發(fā)育異常[18]。

3.2 氨基酸代謝分析

氨基酸是胎兒生長發(fā)育的重要營養(yǎng)底物，一方面用于合成蛋白質進行供能，另一方面競爭性合成葡萄糖。宮內胎兒氨基酸物質的獲得主要通過胎盤和胎兒間存在氨基酸的水平梯度，由母體通過胎盤轉運至胎兒血液[19]。研究顯示，IUGR 胎兒由于機體內營養(yǎng)物質不足，胎兒會優(yōu)先動員自身體內氨基酸轉化為能量和糖類物質，以滿足自身的生長需求[20]。

亮氨酸、纈氨酸和丙氨酸屬于升糖氨基酸，也被證明機體通過額外補充，能夠促進胎兒宮內的葡萄糖水平[21]。亮氨酸是機體的必需氨基酸，在蛋白質和能量代謝、緩解氧化應激以及機體免疫力等方面具有重要作用。此外，機體內的亮氨酸也能通過胰島素依賴機制進一步增強葡萄糖攝取能力。Fowden 等[22]研究也表明，IUGR 仔豬中亮氨酸水平顯著降低。纈氨酸作為哺乳動物體內的主要支鏈氨基酸之一，其通過氧化分解而產生能量的效率比非支鏈氨基酸高[23]。丙氨酸是葡萄糖代謝途徑中的重要調節(jié)劑，也能夠作為原料通過丙酮酸轉化產生能量。本研究中IUGR組的纈氨酸和丙氨酸含量低于對照組，表明新生羔羊機體由于營養(yǎng)不良，過量分解氨基酸用于維持自身能量需求。作為酪胺、多巴胺、腎上腺素和去甲腎上腺素等多種蛋白質合成和能量產生的重要基質，酪氨酸在胎兒發(fā)育中調節(jié)神經系統(tǒng)功能，同時也在應激中具有一定作用[24-25]。本研究中酪氨酸含量的降低，說明羔羊由于IUGR阻礙了神經系統(tǒng)的發(fā)育。

目前，3-甲基組氨酸已經被證明與丙酸血癥等多種先天性代謝病相關，且其含量在臨床中也被作為肌肉蛋白質分解速率的指標[26]。以往的研究中也證實了通過檢測3-甲基組氨酸在羊水中的水平，可以作為人類IUGR的產前檢測指標[27]。

3.3 糖和能量代謝分析

糖類物質是哺乳動物胎兒在宮內發(fā)育的重要營養(yǎng)元素。葡萄糖是胎兒在宮內維持細胞能量代謝的重要原料，對胎兒組織器官的生長發(fā)育具有重要作用[28]。胎兒宮內生長發(fā)育所需的葡萄糖主要是通過母體和胎兒兩者中的葡萄糖含量梯度，完成母體-胎盤-胎兒的運輸。胎兒在生長發(fā)育過程中通過胎盤攝取的外源性葡萄糖含量不足時，會通過內源性葡萄糖生成系統(tǒng)，分解自身儲備的營養(yǎng)物質為糖原，以維持自身的葡萄糖含量[29]。乳酸是機體維持內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的信號分子，也是機體內能量平衡和組織含氧量的評價指標之一[30]。當機體內葡萄糖含量不足時，乳酸能夠由乳酸脫氫酶轉化為丙酮酸，之后通過糖異生途徑進一步轉化為葡萄糖，為機體提供能量。本研究結果說明，羔羊由于營養(yǎng)不良，已經出現體內糖代謝紊亂，且由于葡萄糖含量降低，大量的乳酸也被用于合成葡萄糖。

3.4 氧化應激代謝分析

哺乳動物因營養(yǎng)或其他外界因素導致體內氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡，機體會產生大量活性氧自由基，而過量的自由基蓄積導致機體無法清除時，會造成氧化應激。哺乳動物胎兒宮內生長發(fā)育不良不僅會引起糖類、脂類、氨基酸類等多種物質代謝的變化，也會引起胎兒的抗氧化能力下降[31]。張崇志等[32]報道，過IUGR會引發(fā)綿羊胎兒的氧化應激，影響其肝臟等組織器官的生長發(fā)育。本研究中，IUGR 羔羊血漿中N-乙酰半胱氨酸含量均顯著低于NBW 羔羊，而IUGR 組甜菜堿含量顯著高于NBW 組。N-乙酰半胱氨酸是L-半胱氨酸的衍生物，也是機體內形成抗氧化劑谷胱甘肽的前體，對細胞的抗氧化和抗炎癥均具有重要作用[33]。IUGR羔羊的N-乙酰半胱氨酸降低，說明機體由于IUGR，發(fā)生氧化應激增多，而N-乙酰半胱氨酸作為“抗氧化劑”被過多的消耗。以往研究也顯示，N-乙酰半胱氨酸的處理能夠改善由脂多糖誘導的小鼠胎兒IUGR，并提高胎兒存活率[34]。甜菜堿，又稱為N,N,N-三甲基甘氨酸，是機體內的甲基化供體，而胎兒的甲基化進程等表觀遺傳修飾能夠指導重構胚胎的正常發(fā)育[35]。本研究中，IUGR 組羔羊甜菜堿的血漿濃度顯著升高，可能影響了胎兒在宮內的生長發(fā)育及胎盤分化。

基于代謝組學技術的1H-NMR 檢測方法能夠全面反映健康羔羊與IUGR 羔羊的血液代謝輪廓。本研究通過檢測與數據的生物信息學分析結合，鑒別了IUGR 羔羊血液一些潛在的小分子代謝輪廓，為復雜的IUGR 發(fā)病機理與診療提供了新的方向。試驗結果顯示，IUGR羔羊的血液代謝主要涉及氨基酸、糖類、脂類物質等代謝通路。該結果有助于更好地理解IUGR 發(fā)生機理，并為進一步尋找IUGR診斷標示物提供了理論基礎。