中間球海膽己糖激酶基因克隆及高溫-酸化脅迫對其表達(dá)影響的初步研究

武博瓊， 崔東遙， 焦仁和， 宋堅(jiān)， 湛垚垚， 常亞青

（大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023）

全球變暖（global warming）是指因溫室效應(yīng)而造成溫度上升的氣候變化現(xiàn)象[1]。就占地球表面積71%的海洋而言，海洋升溫（ocean warming）和海洋酸化（ocean acidification）是全球變暖引發(fā)的主要不良現(xiàn)象[2-3]。據(jù)聯(lián)合國政府間氣候變化專門委員會（Intergovernmental Panel on Climate Change，IPCC）的預(yù)測模型推測，到2100年，海洋表面溫度將升高1.8～4.0 ℃，而海水表層pH 將下降至7.8 左右。調(diào)查顯示，自20 世紀(jì)90年代初以來，海洋變暖的速度增加了一倍，其中，2020年海水平均溫度是現(xiàn)代海洋觀測記錄以來最高的一年[4]。此外，野外研究證實(shí)，目前全球海水酸化的實(shí)際速度遠(yuǎn)高于工業(yè)革命前2 500萬年間海水pH的自然變化幅度[5-7]。海水是海洋生物賴以生存的重要介質(zhì)。研究證實(shí)，海洋升溫和酸化會對海洋生物的生長、繁殖、發(fā)育、代謝、群體規(guī)模甚至食物鏈產(chǎn)生復(fù)雜而深刻的影響[8]，其中，對海洋生物能量代謝的影響逐漸成為近年來的關(guān)注熱點(diǎn)。

己 糖 激 酶（hexokinase，HK）是 糖 酵 解（glycolysis）過程的第1個限速酶，是生物體能量收支的重要調(diào)控開關(guān)[9]，研究證實(shí)，己糖激酶的活力常受到環(huán)境因素的干擾。汝玉濤[10]研究發(fā)現(xiàn)，長光照培育下的柞蠶（Antheraea pernyi）蛹脂肪體中的己糖激酶活力呈上升趨勢，為蛹蛻皮過程提供更多的能量。朗德鵝（Anser anser）在填飼后期肝臟中HK基因的相對表達(dá)顯著增加，可促進(jìn)葡萄糖向脂肪酸轉(zhuǎn)化，加快脂肪肝的形成[11]。在海洋生物研究領(lǐng)域，馬氏珠母貝（Pinctada martensii）HK基因在低溫脅迫條件下的相對表達(dá)呈先上升后下降的趨勢，表明HK基因可能參與馬氏珠母貝對低溫脅迫的響應(yīng)過程[12]。郭彪等[13]研究顯示，凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）在溫度驟升時，肝胰腺中的HK 酶活力先升高后恢復(fù)至起始水平，表明凡納濱對蝦可能通過調(diào)控HK 酶活力以適應(yīng)急性高溫脅迫。但是，目前就棘皮動物HK基因?qū)Ｑ蟓h(huán)境變化響應(yīng)規(guī)律及模式的研究尚未見報(bào)道。

為研究棘皮類動物中HK基因的序列信息和表達(dá)規(guī)律，初步了解環(huán)境變化對棘皮動物體內(nèi)HK基因表達(dá)及酶活力的影響，本研究以寒溫帶海膽種類——中間球海膽（Strongylocentrotus intermedius）為研究對象，利用cDNA 末端快速擴(kuò)增（rapidamplification of cDNA ends, RACE）技術(shù)獲得中間球海膽HK基因的全長cDNA 序列（SiHK）并利用生物信息學(xué)軟件分析其序列特征。腸和性腺組織擔(dān)負(fù)著海膽食物消化、生殖和儲能等重要功能[14]，且性腺是有較高營養(yǎng)價值的可食用部位，研究表明，海膽性腺中多不飽和脂肪酸含量占總脂肪酸含量的54.1%[15]。因此，本研究重點(diǎn)研究高溫-酸化脅迫下，中間球海膽性腺和腸組織中SiHK基因的相對表達(dá)量以及總SiHK酶活力的變化，為深入研究棘皮動物體內(nèi)HK基因的生物學(xué)功能提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)以中間球海膽為研究對象，購自大連旅順龍王塘養(yǎng)殖場，隨機(jī)選取240 只平均殼徑（3.5±0.1）cm、平均體質(zhì)量（20.2±2.5）g 且健康、活力較好的海膽，于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)7 d 后開始試驗(yàn)。暫養(yǎng)期間在自然海水條件下進(jìn)行養(yǎng)殖，投喂海帶（Saccharina japonica），每隔2 d進(jìn)行1次全量換水。

選擇平均體質(zhì)量（25.4±3.3）g 且健康、活力好的中間球海膽，于冰上取管足、圍口膜、齒間肌、體腔液、腸和性腺6個組織，做好標(biāo)記后，在液氮中迅速冷凍，凍存于-80 ℃，用于后續(xù)的基因克隆和組織表達(dá)分析。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

按照參考文獻(xiàn)[16]的方法對海水進(jìn)行酸化處理。根據(jù) IPCC 對海洋 2100年 pH 的預(yù)測[17]，試驗(yàn)以自然海水為對照（CK），設(shè)置3個試驗(yàn)組，試驗(yàn)組分別為高溫海水組（HC，ΔT=+3.0 ℃）、酸化海水組（LO，Δ pHNBS=-0.5）和高溫酸化海水組（HO，ΔT=+3.0 ℃，ΔpHNBS=-0.5）。每個試驗(yàn)組設(shè)置6 次平行組，每個平行組10只海膽。試驗(yàn)期間，利用pH計(jì)（PH838，SMART，中國香港）和水質(zhì)儀（YSI6 920，YSI，美國）實(shí)時監(jiān)測各試驗(yàn)組海水的pHNBS、鹽度和溫度?？倝A度(total alkalinity，TA)依據(jù)pH 滴定法進(jìn)行測定。運(yùn)用SWCO2 軟件(http://neon.otago.ac.nz/research/mfc/people/keith_hunter/software/software.htm/)根據(jù)測定的海水pH、鹽度、溫度和總堿度計(jì)算出各組二氧化碳分壓（partial pressure of carbon dioxide，pCO2）。

試驗(yàn)持續(xù)60 d，期間各試驗(yàn)組海水參數(shù)如表1所示。試驗(yàn)期間，每天投喂海帶1次，日換水量為總水量的1/2，每2 d進(jìn)行1次全量換水，換水時及時清除殘餌及糞便；為避免海水pH的劇烈波動，換水前后需對溫度、pHNBS、鹽度、總堿度和二氧化碳分壓等海水參數(shù)進(jìn)行檢測，待穩(wěn)定后再開始試驗(yàn)。

表1 各試驗(yàn)組的海水參數(shù)Table1 Seawater parameters of each treatment

1.3 中間球海膽SiHK基因克隆

按照RNA 提取試劑盒（普洛麥格公司）說明書提取中間球海膽各組織中的總RNA。5’RACE及 3’RACE 的反轉(zhuǎn)錄參照 Smarter RACE cDNA 試劑盒（Clontech，美國）說明書進(jìn)行，獲得cDNA 模板，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。根?jù)中間球海膽轉(zhuǎn)錄組文庫獲得SiHK基因的核心片段和引物設(shè)計(jì)原則，使用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物（表2）。PCR 擴(kuò)增體系（10 μL）：含有1 μL cDNA，上下游引物各0.4 μL，Buffer 1 μL，LA-Taq酶0.2 μL，dNTP 0.8 μL，ddH2O 6.2 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切取目的條帶，使用柱式DNA 膠回收試劑盒（生工生物工程，上海）進(jìn)行回收。將回收的PCR 產(chǎn)物與pEASY?-T1 克隆載體（全式金，北京）連接，轉(zhuǎn)化到Trans1-T1 噬菌體抗性的感受態(tài)細(xì)胞（全式金，北京）中；向轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞中加入含0.1%氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃搖菌培養(yǎng)1 h 后，涂平板，于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)12 h，挑取單一菌落至LB 液體培養(yǎng)基中繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)；取1 μL 培養(yǎng)的菌液為模板，通過菌落PCR 篩選陽性克隆，送至生工生物工程上海有限公司進(jìn)行測序。

1.4 中間球海膽SiHK序列的生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN 6.0軟件對獲得的中間球海膽SiHK基因的3’和5’端序列與核心片段序列進(jìn)行拼接組裝，最終得到SiHK基因的全長cDNA 序列。利用 BLAST（BLASTX，http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對SiHK基因核苷酸及其所編碼氨基酸序列進(jìn)行相似性分析；使用ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder）軟件確定SiHK基因的開放閱讀框（open reading frame，ORF）；利用 EXPASY Proteomics Server（http://www.expasy.org）軟件對SiHK基因編碼的蛋白序列進(jìn)行理化性質(zhì)分析；利用SMART（http://smart.emblheidelberg.de/）和 PSIRED v3.3（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）軟件預(yù)測SiHK 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域和二級結(jié)構(gòu)；利用SWISSMODEL（https://swissmodel.expasy.org/）預(yù)測SiHK 蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)；應(yīng)用DNAMAN 6.0 軟件對SiHK基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對；利用MEGA 7.0 軟件，基于鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建15種生物HK氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

高校應(yīng)加強(qiáng)對就業(yè)指導(dǎo)模式的改革與創(chuàng)新。高校的任務(wù)不僅是讓學(xué)生獲得知識，也應(yīng)保障學(xué)生職業(yè)生涯的良好發(fā)展，這符合學(xué)生和學(xué)校共同的利益。構(gòu)建學(xué)生高校命運(yùn)共同體，能讓學(xué)校切實(shí)重視學(xué)生就業(yè)能力的提升工作，將就業(yè)指導(dǎo)深化、細(xì)化。同時，應(yīng)針對不同階段的學(xué)生實(shí)施不同的就業(yè)指導(dǎo)內(nèi)容和指導(dǎo)方式，幫助學(xué)生進(jìn)行職業(yè)認(rèn)知、職業(yè)選擇與職業(yè)規(guī)劃，為學(xué)生提供完善的就業(yè)服務(wù)。

1.5 qRT-PCR 檢測中間球海膽SiHK 基因的相對表達(dá)規(guī)律

采用LightCycler96 實(shí)時熒光定量PCR 儀（Roche Life Science，德國）進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)程序?yàn)槿椒〝U(kuò)增反應(yīng)，具體參照說明書進(jìn)行。從實(shí)驗(yàn)室前期獲得的中間球海膽轉(zhuǎn)錄組文庫中篩選出目的基因的核心片段，利用Premier 5 設(shè)計(jì)引物（表2），選用在中間球海膽組織中穩(wěn)定表達(dá)的β-actin作為內(nèi)參基因，并對引物的特異性和擴(kuò)增效率進(jìn)行檢測。反應(yīng)體系（20 μL）：2 μL cDNA，上下游引物各 0.8 μL，2×SYBR?PremixEx TaqTMⅡ 10 μL，ddH2O 6.4 μL。熒光定量 PCR 反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；反應(yīng)后進(jìn)行熔解曲線分析，以排除非特異性擴(kuò)增的污染。采用 2-ΔΔCT法[19]計(jì)算SiHK基因的相對表達(dá)量。

表2 本研究中使用的引物Table 2 Primers used in this study

1.6 中間球海膽組織總SiHK酶活力測定

分別取中間球海膽性腺和腸組織樣品各1.0 g，液氮研磨后，按1∶9（質(zhì)量體積比）加入無菌海水，4 ℃、2 500 r·min-1離心10 min后留取上清液。

總蛋白含量的測定按照總蛋白（total protein，TP）測定試劑盒說明書（南京建成生物工程研究所，南京）進(jìn)行，將樣品和所加試劑混勻，靜置10 min，于 595 nm 處，1 cm 光徑，雙蒸水調(diào)零，測定各管吸光值（OD 值）。計(jì)算公式如下,標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為 0.563 g prot·L-1。

總SiHK 酶活力的測定按照已糖激酶試劑盒說明書（南京建成生物工程研究所，南京）進(jìn)行，利用Epoch 酶標(biāo)儀（Biotek,美國）測定反應(yīng)底物吸光值，根據(jù)說明書中公式，記錄在340 nm波長下20 s時的初始吸光度A1 和320 s 時的吸光度A2，計(jì)算公式如下。

式中，ε 為 NADH 在 340 nm 處摩爾吸光系數(shù)（6.22×103L·mol-1·cm-1）；d為比色皿光徑（cm）；V反總為反應(yīng)體系總體積（L）；Cpr為上清液蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（mg·mL-1）；V樣為加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL）；T為催化反應(yīng)時間（min）。

1.7 數(shù)據(jù)分析處理

采用Excel 2016 和Origin 8.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和圖表繪制，采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 中間球海膽SiHK基因的全長cDNA序列

如圖1 所示，中間球海膽SiHK基因的cDNA序列全長2 041 bp，編碼476個氨基酸，起始密碼子（ATG）位于序列的第103 堿基處，終止密碼子（TGA）位于序列的第1 533 堿基處。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，SiHK基因編碼蛋白（SiHK）的理論等電點(diǎn)（pI）為6.44，蛋白分子質(zhì)量52.72 kD。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示（圖2），SiHK 的氨基酸序列中含有 COG5026 結(jié)構(gòu)域，共包含 17個 α-螺旋、13個β-折疊和31個無規(guī)則卷曲，相對于仿刺參HK 的二級結(jié)構(gòu)，中間球海膽和紫球海膽（Strongylocentrotus purpuratus）的 HK 在二級結(jié)構(gòu)上更為相似，2 種海膽蛋白序列中存在43個氨基酸殘基的差異，中間球海膽SiHK 蛋白序列較紫球海膽HK 蛋白序列多1個無規(guī)則卷曲、少1個α-折疊。三維結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示（圖3），SiHK 與人（Homo spains）HK 蛋白（PDB 登錄號：1cza.1）的相似性為43.34%，具有較為相似的三維結(jié)構(gòu)，存在2個磷酸基團(tuán)識別位點(diǎn)及其與周圍蛋白構(gòu)成的酶活性中心，磷酸基團(tuán)識別位點(diǎn)與蛋白質(zhì)通過鹽橋相連接。

圖1 中間球海膽SiHK的核苷酸序列及其所編碼的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequence of SiHK in Strongylocentrotus intermedius

圖2 中間球海膽SiHK二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及其與紫球海膽、仿刺參HK的二級結(jié)構(gòu)比較Fig.2 Secondary structure prediction and comparison of hexokinase between

圖3 中間球海膽SiHK蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)Fig.3 3D structure prediction of SiHK

圖4 中間球海膽SiHK氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of deduced amino acid sequences of SiHK

2.2 中間球海膽SiHK基因的組織表達(dá)及酶活力

2.2.1SiHK基因表達(dá)和酶活力 如圖5 所示，SiHK基因在6 種中間球海膽組織中均有表達(dá)，且具有較為明顯的組織特異性，其相對表達(dá)量由高到低依次為：性腺＞腸＞齒間?。緡谀ぃ竟茏悖倔w腔液，其中，SiHK基因在中間球海膽性腺組織中的相對表達(dá)量最高，在腸組織中的相對表達(dá)量次之，而在體腔液中的相對表達(dá)量最低。

酶活力檢測結(jié)果（圖5）顯示，6 種中間球海膽組織中的總SiHK 酶活力差異較大，其中，在體腔液中總SiHK 酶活力最高，顯著高于其他組織；管足次之；腸和性腺中總SiHK酶活力最低。

圖5 中間球海膽不同組織SiHK基因表達(dá)量和總SiHK酶活力Fig.5 Relative expression of SiHK and total SiHK activities in different tissues of Strongylocentrotus intermedius

2.2.2 高溫-酸化對中間球海膽腸組織和性腺組織中SiHK基因表達(dá)和酶活力的影響 經(jīng)過60 d高溫-酸化脅迫后，中間球海膽性腺與腸組織中SiHK基因在不同處理下的相對表達(dá)量和SiHK 酶活力變化如表3和圖6所示。

表3 高溫和酸化對SiHK基因表達(dá)和總SiHK酶活力影響的雙因素方差分析Table 3 Two-way ANOVA of effects of high temperature-acidification stress on relative expression and total enzyme activities of SiHK

在腸組織中，海水升溫條件下，SiHK基因的相對表達(dá)量和總SiHK酶活力較對照顯著上升；在海水酸化條件下，SiHK基因的相對表達(dá)量較對照顯著升高，總SiHK 酶活力于對照差異不顯著；在受到高溫和海水酸化雙因素脅迫后，中間球海膽腸組織中SiHK基因的相對表達(dá)量較對照極顯著上升，總SiHK酶活力與對照組無顯著差異。

在性腺組織中，在海水升溫的條件下，SiHK基因的相對表達(dá)量與對照差異不顯著，總SiHK酶活力較對照顯著下降，其中，總SiHK 酶活力呈現(xiàn)顯著下降趨勢；在海水酸化條件下，與自然海水組相比，中間球海膽性腺組織中SiHK基因的相對表達(dá)量和總SiHK酶活力與對照差異不顯著；當(dāng)受到高溫和酸化雙因素脅迫后，中間球海膽性腺組織中SiHK基因的相對表達(dá)量和總SiHK 酶活力與對照組相比呈現(xiàn)極顯著下降趨勢。

3 討論

3.1 中間球海膽SiHK基因的序列特征

本研究利用RACE 技術(shù)獲得了中間球海膽SiHK基因的全長cDNA 序列，對序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該序列的核苷酸序列與紫球海膽SiHK的核苷酸序列相似度較高，達(dá)到91.13%，可能是在物種進(jìn)化過程中，其編碼序列在種屬特異性進(jìn)化中發(fā)生了不同的堿基替換等，與前人研究結(jié)果一致[19-20]。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)顯示，相對于仿刺參HK 的二級結(jié)構(gòu)，中間球海膽和紫球海膽的HK在二級結(jié)構(gòu)上更為相似，由此表明，棘皮動物中的HK 在蛋白結(jié)構(gòu)上存在一定的種屬特異性。對蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明，中間球海膽的SiHK 與人HK 在三維結(jié)構(gòu)上的相似度為43.34%，由此表明，HK 在漫長的進(jìn)化過程具有較強(qiáng)的保守性。此外，系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，中間球海膽SiHK 與紫球海膽的HK 具有較近的親緣關(guān)系，與仿刺參HK 也具有較高的同源性，表明雖然棘皮動物HK 在蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)上存在一定的種屬特異性，但整體而言又具有一定的保守性。

3.2 高溫-酸化脅迫下中間球海膽腸和性腺組織SiHK基因和SiHK酶的響應(yīng)模式

不同種類棘皮動物對海水酸化的響應(yīng)存在種屬差異。研究表明，長期生活于酸化海水（pH 7.03）中的馬糞海膽（Hemicentrotus pulcherrimus）生長速度緩慢，發(fā)育遲緩，其殼徑、腸重、口器重及體質(zhì)量均受到顯著影響[21]；Stumpp等[22]發(fā)現(xiàn)在酸化海水（pH 7.70±0.02）中培育的紫球海膽，雖然其早期發(fā)育階段的代謝率增強(qiáng)，但是其個體發(fā)育卻比較緩慢；仿刺參可通過改變能量代謝、降低鈣化率以適應(yīng)海水酸化脅迫[23]；海蛇尾（Amphiura filiformis）通過提高肌肉分解速度以適應(yīng)海水酸化脅迫[24]。

糖酵解是生物體各組織細(xì)胞中普遍存在的代謝反應(yīng)過程[25]，己糖激酶（HK）是糖酵解過程中的第1個限速酶。本研究對中間球海膽SiHK基因的表達(dá)量及總SiHK 酶活力進(jìn)行分析，結(jié)果表明，SiHK基因表達(dá)量及總SiHK 酶活力在中間球海膽管足、圍口膜、齒間肌、體腔液、腸和性腺組織中均有表達(dá)，但存在明顯的組織特異性，與己糖激酶在大鼠不同組織的表達(dá)具有相似性[26]。值得注意的是，在同一組織中，SiHK基因的相對表達(dá)量與總SiHK 酶活力呈相反趨勢，如SiHK基因在腸和性腺組織中的相對高表達(dá)量較高，而總SiHK酶活力較低，可能是由于在腸和性腺組織中SiHK主要以尚未激活的酶原形式存在。體腔液是海膽的防御中樞和體液循環(huán)中樞，肩負(fù)抵御病原微生物、環(huán)境刺激及維持滲透壓平衡等重任，對于能量的需求較大，而己糖激酶催化的糖酵解活動是機(jī)體內(nèi)糖類產(chǎn)能的共同途徑，因此，體腔液中較高的SiHK酶活力在一定程度上反映了中間球海膽體腔液中糖類分解代謝活動活躍。

海水升溫和海洋酸化會影響和改變海洋生物的能量代謝水平和分配方式[20,27]。本研究發(fā)現(xiàn)，高溫-酸化脅迫60 d后，在中間球海膽的腸和性腺組織中，SiHK基因的相對表達(dá)量和總SiHK 酶活力也較對照組發(fā)生了變化，且這種改變具有一定的組織特異性。

當(dāng)海水溫度上升3 ℃時，中間球海膽腸組織中SiHK基因的相對表達(dá)量和總SiHK 酶活力顯著升高。研究顯示，當(dāng)外界溫度在一定的溫度范圍內(nèi)升高時，機(jī)體內(nèi)的酶活力會隨著溫度的升高而增強(qiáng)，進(jìn)而提高機(jī)體的代謝水平以應(yīng)對不良環(huán)境[28]。中間球海膽的適宜生長溫度為18～22 ℃，水溫超過23 ℃可造成中間球海膽大量死亡[29]。由此推測，當(dāng)海水升溫時，中間球海膽可能通過上調(diào)腸組織中SiHK基因的表達(dá)量來提高己糖激酶活力，從而提高糖酵解的效率，轉(zhuǎn)化吸收更多的能量來維持機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，與沙蔥螢葉甲（Galeruca daurica）成蟲HK基因上調(diào)表達(dá)響應(yīng)高溫脅迫一致[30]。當(dāng)海水pH 較自然海水降低0.5 時，中間球海膽腸組織中SiHK基因的相對表達(dá)量和總SiHK酶活力也呈顯著上升趨勢，推測中間球海膽可能通過加快腸組織中糖代謝來獲得大量能量以適應(yīng)海水酸化脅迫。研究表明，海水酸化脅迫可引起中間球海膽丙酮酸激酶（pyruvate kinase,PK）活力顯著提高。己糖激酶和丙酮酸激酶均為糖酵解代謝的關(guān)鍵酶，由此表明，海水酸化對海膽的糖代謝和產(chǎn)能過程產(chǎn)生一定的影響。當(dāng)受到高溫和酸化雙因素脅迫后，中間球海膽腸組織中SiHK基因的相對表達(dá)量極顯著高于對照組。與溫度相比，海水pH 可能是影響中間球海膽腸組織中糖代謝關(guān)鍵酶表達(dá)的主要因素，且海水升溫可在一定程度上緩解海水酸化對海膽代謝酶造成的影響。童歡等[31]的研究顯示，在酸化條件下，40 ℃水體中微生物的活力高于35 ℃，表明溫度的升高有利于減緩酸化對微生物的影響，與本研究結(jié)果相一致。在高溫-酸化脅迫下，中間球海膽腸組織中總SiHK酶活力較對照組差異不顯著，表明高溫和酸化對中間球海膽腸組織中總SiHK 酶活力具有協(xié)同抑制作用，與常亞青等[29]和Zhan 等[32]的研究結(jié)果相似。綜上所述，高溫-酸化脅迫會抑制中間球海膽的糖代謝活動。

當(dāng)海水溫度升高3 ℃時，中間球海膽性腺組織中SiHK基因的相對表達(dá)量較對照組略有下降，但差異不顯著，而總SiHK 酶活力顯著降低，說明高溫對中間球海膽性腺中糖酵解途徑的影響可能不是依靠下調(diào)SiHK基因的相對表達(dá)量，而是通過降低總SiHK酶活力。值得注意的是，這一結(jié)果與腸組織中SiHK基因的表達(dá)量和總SiHK 酶活力的檢測結(jié)果不同，由此表明，即使在同一種生物體內(nèi)，不同器官對外界脅迫的響應(yīng)策略也會有所不同。當(dāng)海水pH 較自然海水降低0.5 時，中間球海膽性腺組織中SiHK基因的相對表達(dá)量顯著降低，但總SiHK 酶活力較對照組差異不顯著。且高溫和酸化雙因素脅迫下，中間球海膽性腺組織中SiHK基因的相對表達(dá)量和總SiHK 酶活力變化趨勢與單因素脅迫時略有不同，由此表明，即使是同種生物的同一器官，對不同脅迫因素的響應(yīng)策略也不盡相同。當(dāng)受到高溫-酸化脅迫后，中間球海膽性腺組織中SiHK基因的相對表達(dá)量較對照極顯著降低，且SiHK酶活力較對照組也極顯著降低，表明升溫和酸化對中間球海膽性腺組織中SiHK基因的相對表達(dá)量和總SiHK 酶活力具有協(xié)同抑制作用，顯著降低了中間球海膽性腺中糖酵解代謝的速率。研究顯示，海水高溫和海水酸化可引起馬糞海膽和梅氏長海膽（Echinometra mathaei）性腺發(fā)育緩慢[20,33]，本研究證實(shí)高溫-酸化雙重脅迫顯著抑制了中間球海膽性腺中糖酵解代謝中第1個限速酶的相對表達(dá)和酶活力。綜上所述，未來在高溫-酸化雙重壓力下，寒溫帶海膽的發(fā)育可能更為遲緩，生存和繁殖可能會面臨更大的挑戰(zhàn)。