制作高質(zhì)量小鼠胃組織石蠟切片的方法優(yōu)化

李 璐 李汝佳 李 琛 朱少平

（1.廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，廣東 湛江 524023；2.廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，廣東 湛江 524023；3.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 湛江 524001；4.廣東醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)教研室，廣東 湛江 524023）

0 引言

胃（stomach）呈囊狀膨大，空虛時(shí)呈收縮狀態(tài)，內(nèi)面可見縱行的皺襞。進(jìn)食后，由于肌組織舒張，胃腔擴(kuò)張，皺襞消失，可暫時(shí)貯存食物。由于胃組織結(jié)構(gòu)致密層次多，有較強(qiáng)的柔韌性和硬度，在制作高質(zhì)量的石蠟切片過程中常見腺體結(jié)構(gòu)不完整，黏膜各層次間隙大組織結(jié)構(gòu)不清晰，平滑肌層肌束分離以及皺襞收縮脆裂較嚴(yán)重等現(xiàn)象。筆者在工作中通過多次試驗(yàn)有效解決了這些問題，通過在制片方法上進(jìn)行一些改進(jìn)，獲得了良好的成像效果。采用健康C57BL/6小鼠胃部組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作（其和人類的胃在層次結(jié)構(gòu)和組織學(xué)特點(diǎn)上都相似），Heidenhain Susa固定液固定，切片時(shí)蠟帶直接展片，最后四氫呋喃透明、脫蠟，蘇木素染色液和伊紅染液滴染。改進(jìn)后的胃組織切片最大限度保持與活體組織相近的完整結(jié)構(gòu)，核質(zhì)著色均勻，制片時(shí)間縮短，值得推廣，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

購買健康C57BL/6小鼠30只，3月齡，體質(zhì)量量30 g士3.5g，雌雄各半，北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號SCXK（京）2019-0008。小鼠隨機(jī)分為對照組，實(shí)驗(yàn)組和常規(guī)組，每組各10只。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

Heidenhain Susa固定液（氯化汞4.5 g，氯化鈉0.5 g，三氯醋酸2 g，蒸餾水8Oml，37%甲醛溶液20m1，冰醋酸4 m1），放置于棕色試劑瓶內(nèi)。10%福爾馬林溶液（30%甲醛10ml，蒸餾水90ml）。0.5%鹽酸乙醇液（濃鹽酸0.5 ml，70%乙醇溶液100 m1）。四氫呋喃分析純AR（成都科隆化學(xué)品有限公司）。蘇木精染色液，伊紅染液，環(huán)保型浸蠟脫蠟透明液，環(huán)保封片膠，購自北京索萊寶科技有限公司，高效切片石蠟（上海華永石蠟有限公司），粘附載玻片（25×75mm）（江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司）。Leica RM2245電動(dòng)進(jìn)樣切片機(jī)，DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

2 方法

2.1 取材

小鼠禁食4h，2.5%戊巴比妥腹腔注射麻醉，蒸餾水浸濕小鼠胸部、腹部皮毛，將小鼠仰臥于解剖盤，解剖剪剪開腹腔，在胃賁門處和幽門處用止血鉗夾住，小解剖剪剪下整個(gè)胃，剪尖向上沿著胃小彎剪開，生理鹽水洗去胃內(nèi)的殘存食物。

2.2 固定

在對照組A和實(shí)驗(yàn)組B中，采用連續(xù)擺動(dòng)超聲震蕩處理，震蕩頻率90次/min，將小鼠胃組織迅速放入Susa固定液中固定10h，待組織完全固定后，直接進(jìn)行脫水。常規(guī)組C不采用振蕩處理，10%福爾馬林溶液常規(guī)固定10 h，固定后的胃組織置于廣口瓶內(nèi)，瓶口用紗布纏繞包扎，將瓶子放置于自來水管下方，流水緩慢地由水龍頭經(jīng)膠皮管注入瓶內(nèi)進(jìn)行沖洗，水量以組織塊在水中稍有移動(dòng)為準(zhǔn)。

2.3 脫水與透明

對照組A和實(shí)驗(yàn)組B均無水洗，對照組A，放入95%乙醇液中脫水1h，用環(huán)保型透明液常規(guī)方法透明，實(shí)驗(yàn)組B，放入95%乙醇溶液：四氫呋喃1∶1混合液1h、四氫呋喃1h，投入四氫呋喃-石蠟1∶2混合液（石蠟熔點(diǎn)6O℃）30 min。常規(guī)組C，采用常規(guī)脫水方法：70%乙醇溶液、80%乙醇溶液、90%乙醇、95%乙醇溶液、100%乙醇溶液，每級各2h，環(huán)保型透明液透明0.5h。見表1。

表1 脫水與透明不同時(shí)間點(diǎn)比較

2.4 浸蠟與包埋

完全透明后的胃組織標(biāo)本放置于石蠟I（熔點(diǎn)48℃～55℃）1.5h，石蠟II（55℃～60℃）1h，石蠟包埋（58℃～60℃）。對照組A和實(shí)驗(yàn)組B置于6O℃恒溫震蕩儀中連續(xù)擺動(dòng)震蕩，震蕩頻率120次/min。浸蠟時(shí)用預(yù)熱的小鑷子分別將對照組A、實(shí)驗(yàn)組B和常規(guī)組C的胃組織放入包埋框內(nèi)包埋。常規(guī)組浸蠟時(shí)不使用震蕩處理。

2.5 切片

對照組A和實(shí)驗(yàn)組B，Leica RM2245電動(dòng)進(jìn)樣切片機(jī)，萊卡一次性刀片，切片刀的刀刃與蠟塊豎直平面之間夾角為5°，胃組織切片厚度4微米（μm），蠟帶分別裱在粘附載玻片上。將切片放置在60℃的電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行展片，10min后胃組織自然展開貼附于載玻片上，烤箱內(nèi)干燥2h。常規(guī)組C常規(guī)切片，水浴展片，攤片機(jī)水溫40℃借助水溫和水的張力，組織蠟帶平展后，用解剖小鑷子將石蠟切片一個(gè)個(gè)分開裱在粘附載玻片上，控去粘附載玻片上的水分，放入烤箱內(nèi)干燥2h。通過對比，對照組A，實(shí)驗(yàn)組B和常規(guī)組C三者組織切片形態(tài)結(jié)構(gòu)基本相同，而相比于傳統(tǒng)水浴展片法，采用石蠟直接展片法大大縮短了展片時(shí)間。

2.6 染色

載玻片傾斜20°角放人立式染色缸中，對照組A使用環(huán)保型脫蠟液脫蠟、實(shí)驗(yàn)組B使用四氫呋喃分析純AR浸泡10min脫蠟，對照組A和實(shí)驗(yàn)組B組，梯度乙醇水化至下行70%乙醇溶液，蒸餾水浸洗3 min，蘇木精染液滴染15min，自來水洗去浮色，1%鹽酸乙醇溶液分色2S，0.5氨水（pH值7.5）藍(lán)化30S，自來水水洗，光鏡下觀察細(xì)胞核的分色質(zhì)量，流水沖洗10min，伊紅染液染胞質(zhì)30S，90、95、100%梯度乙醇速洗，每級乙醇各3min，四氫呋喃分析AR透明、環(huán)保封片膠封片。此過程除水洗和藍(lán)化在室溫下進(jìn)行，其余步驟放置在56℃恒溫震蕩儀中，震蕩速度95次／min進(jìn)行。常規(guī)組C采用常規(guī)方法染色，染色過程中不使用恒溫振蕩儀振蕩，環(huán)保型脫蠟液脫蠟，透明。

2.7 判斷標(biāo)準(zhǔn)合格標(biāo)準(zhǔn)

低倍鏡下完整呈現(xiàn)黏膜各層（見圖2）。不合格標(biāo)準(zhǔn)：低倍鏡下不能完整呈現(xiàn)黏膜各層或黏膜腺體呈圓環(huán)狀橫切面外觀（見圖5，圖6）。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS18.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用秩和檢驗(yàn)分析。＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

用LEICA Q550IW圖像分析系統(tǒng)對小鼠胃組織石蠟切片染色結(jié)果進(jìn)行顯微鏡下觀察（染色結(jié)果見圖1～圖6）。

3.1 總體結(jié)果

對照組A和實(shí)驗(yàn)組B，優(yōu)質(zhì)片84張（70%）、中等片36張（30%）、無次等片及不合格片；對照組無優(yōu)質(zhì)片，中等片12張（20.04%），次等片28張（46.71%），不合格片20張（33.33%）。實(shí)驗(yàn)組B切片，結(jié)構(gòu)完整程度好，著色優(yōu)于對照組A。見表2。

表2 各組制片等級結(jié)果比較

3.2 染色效果

實(shí)驗(yàn)組，第1組（圖1、圖3）和第2組（圖2、圖4）。圖1，肉眼觀察，胃外部形態(tài)完整，腔面高低不平，藍(lán)紫色為黏膜，外表層較平滑。藍(lán)紫色黏膜層靠近腔面，表面高低不平形成胃小區(qū)，粉色為胃壁其他結(jié)構(gòu)。圖2，低倍鏡觀察，①黏膜，②黏膜下層，③肌層；圖3，圖4高倍鏡觀察，箭頭①上皮，箭頭②胃小凹，箭頭③胃底腺，箭頭④主細(xì)胞，位于腺體部和底部，呈藍(lán)紫色柱狀形，細(xì)胞核為圓形，箭頭⑤壁細(xì)胞體較大，呈圓形或三角形，細(xì)胞質(zhì)染成紅色，位于細(xì)胞中央圓形的細(xì)胞核，有時(shí)在一個(gè)細(xì)胞中可見雙核。

圖1 肉眼觀察

圖2 胃底（4×10）

圖3 胃黏膜層（10×10）

圖4 胃黏膜層（40×10）

對照組（見圖5，見圖6），圖5，低倍鏡觀察，腺體結(jié)構(gòu)模糊、黏膜各層次組織結(jié)構(gòu)不清晰、層次間隙過大，平滑肌層肌束分離以及收縮皺褶脆裂較嚴(yán)重。圖6，高倍鏡觀察，核質(zhì)染色模糊不清晰。

圖5 胃底（4×10）

圖6 胃黏膜層（40×10）

4 討論

由于胃組織結(jié)構(gòu)致密層次多，有較強(qiáng)的柔韌性和硬度，在石蠟切片制作過程中常見各層組織結(jié)構(gòu)不清晰、層次間隙過大，平滑肌層肌束分離以及收縮皺褶脆裂等現(xiàn)象。我們采用改良Heidenhain Susa固定液在組織固定后，無需流水沖洗，直接投入95%乙醇溶液，進(jìn)行固定，可以大大縮短標(biāo)本處理時(shí)間。

本實(shí)驗(yàn)對固定、脫水、透明這三個(gè)步驟進(jìn)行了改良，對照組，實(shí)驗(yàn)組，常規(guī)組。對照組，使用Heidenhain Susa固定液固定、直接投入95%乙醇溶液脫水、環(huán)保型透明液透明，與常規(guī)實(shí)驗(yàn)相比較，縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間、透明效果較好。實(shí)驗(yàn)組在進(jìn)行固定、脫水、透明的步驟更改時(shí)，（即使用Heidenhain Susa固定液固定、無需水洗直接投入95%乙醇溶液脫水、四氫呋喃分析AR透明），縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，透明效果較好、組織無破碎、核質(zhì)染色均勻。對照組和實(shí)驗(yàn)組使用蠟帶展片，相對與常規(guī)實(shí)驗(yàn)切片更平坦、清晰。

Susa固定液能迅速均勻的浸透組織標(biāo)本內(nèi)部，滲透力強(qiáng)，收縮硬化小，完整的保存細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)。固定時(shí)，進(jìn)行超聲震蕩，因?yàn)閷⒐潭▌┲械臉?biāo)本處于一定的震蕩頻率下，標(biāo)本表面所形成的層流就會被破壞而表現(xiàn)為湍流狀態(tài)，相對增加固定劑對標(biāo)本的滲透速度。超聲震蕩、恒溫控制技術(shù)可以促使胃組織及有機(jī)溶劑或預(yù)熔石蠟高速震蕩，出現(xiàn)周期性的縮張活動(dòng)，以有機(jī)溶劑代替組織內(nèi)水分，并促使預(yù)熔石蠟浸入組織內(nèi)時(shí)間縮短，最大限度控制固定、脫水、浸蠟等操作時(shí)間，縮短標(biāo)本制作的時(shí)間。四氫呋喃具有脫水透明的效果，使組織收縮程度小，整塊組織不用切割修整直接包埋。乙醇是常用的脫水、脫脂劑，乙醇分子中的極性基團(tuán)羥基（-OH）可以與組織細(xì)胞內(nèi)的水形成氫鍵將水置換出來從而起到脫水作用。組織脫水應(yīng)逐步進(jìn)行，順序顛倒會影響脫水效果；在無水乙醇中不可以放置時(shí)間太長，會引起組織過硬，使切片的時(shí)候組織破碎；更換脫水劑時(shí)，浸泡時(shí)間需減去吸水過程中所耽誤的時(shí)間，以免脫水不足；脫水必須在有蓋的玻璃瓶中進(jìn)行，防止吸收空氣中的水分和酒精揮發(fā)，保證脫水徹底。標(biāo)本脫水時(shí)振蕩對脫水時(shí)間的確定也有影響，振蕩可促進(jìn)標(biāo)本固定。

浸蠟期間更換一至兩次新蠟液，可以徹底去除透明劑成分，保證標(biāo)本浸蠟的質(zhì)量。此過程操作動(dòng)作要迅速，因?yàn)槿萜鲀?nèi)的液體石蠟容易凝固，相對縮短浸蠟時(shí)間，半凝固的石蠟不具備置換透明劑和浸透標(biāo)本的作用。注意包埋框的內(nèi)面應(yīng)干凈平滑，邊緣沒有向內(nèi)凸起的棱角，不要使蠟液凝固，用半凝固的石蠟進(jìn)行標(biāo)本包埋，石蠟內(nèi)部會產(chǎn)生許多小氣泡影響石蠟對組織結(jié)構(gòu)的支撐性。蠟帶直接展片無需在生物組織攤片機(jī)中水展片使蠟帶組織在水中更容易破損。染色時(shí)使用單獨(dú)滴染（HE染色），試劑不重復(fù)使用，保證每張切片都使用新鮮試劑。每張切片染色時(shí)采用滴染式操作，與傳統(tǒng)的浸染式操作相比，避免了標(biāo)本與試劑之間相互污染。同時(shí)，保證了染色效果的均一性，無傳統(tǒng)染色中染色到后期深淺不一的現(xiàn)象。

綜上，經(jīng)過結(jié)合Heidenhain Susa固定液固定、四氫呋喃透明和蠟帶展片，既可縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，也避免人為因素和其他因素，提高了快速石蠟切片的質(zhì)量穩(wěn)定性，有利于快速石蠟切片的質(zhì)量控制工作。