李 陽(yáng),安 琪,宋 悅,屈沙沙,范 剛, ,任婧楠,潘思軼
(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院/環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北武漢 430070;2.果蔬加工與品質(zhì)調(diào)控湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)),湖北武漢 430070)
柑橘類水果是世界上消費(fèi)最多的水果之一,其包括柑、橘、柚、橙、檸檬等多個(gè)品種,營(yíng)養(yǎng)全面,栽培廣泛,深受消費(fèi)者的喜愛(ài)。柑橘生理落果,又稱柑橘落果,是由于植物生理原因而凋落的,落果的高峰期集中在每年的五月到六月,分兩次進(jìn)行。第一次落果時(shí)間短而集中,落果量大,約占總量的98%;第二次落果數(shù)量較少,果實(shí)較大。柑橘落果曬干后可作藥用,具有破氣消積,化痰除痞,理氣健脾等功效。有研究表明,未成熟落果的藥用作用比已成熟果實(shí)更強(qiáng),且第一次生理落果中的有效活性物質(zhì)含量高于第二次落果。
柑橘落果中含有多種營(yíng)養(yǎng)成分,如類黃酮化合物(flavonoids)、檸檬苦素(limonin)、生物堿類物質(zhì)等,黃酮類化合物按其結(jié)構(gòu)可分為黃烷酮類(flavanone)、黃酮類以及多聚甲氧基黃酮類三大類。黃烷酮類主要包括橙皮苷(hesperidin)、柚皮苷(naringin)、蕓香柚皮苷(narirutin)、新橙皮苷(neohesperidin)等;黃酮類包括木犀草素(luteolin)、香葉木素(diosmetin)、槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)等;多聚甲氧基黃酮類化合物可以被看作柑橘分類的標(biāo)識(shí)物,是柑橘屬植物中的特有成分。類黃酮化合物在柑橘落果活性物質(zhì)中占據(jù)很大比例,具有抗癌、抗炎抑菌、抗增殖、神經(jīng)保護(hù)以及降血糖等功效,被廣泛應(yīng)用于食品科學(xué)、化學(xué)以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,近年來(lái)越來(lái)越多地受到消費(fèi)者的關(guān)注。檸檬苦素是柑橘果實(shí)中最常見(jiàn)的檸檬苦素類化合物之一,也是柑橘屬植物苦味的主要來(lái)源。目前已被人們發(fā)現(xiàn)的檸檬苦素類化合物大約有三百余種,根據(jù)其結(jié)構(gòu)大致分為檸檬苦素苷元(limonin aglycones)、降解性檸檬苦素類似物(degraded limonoids)以及糖苷型檸檬苦素類似物(limonoid glucosides)三類,具有抗腫瘤、鎮(zhèn)靜、調(diào)節(jié)人體內(nèi)膽固醇水平以及除蟲(chóng)殺蟲(chóng)等功效。辛弗林(synephrine)是存在于蕓香科柑橘屬植物枳實(shí)、枳殼、陳皮等多種中藥材中的一種生物堿,具有提高新陳代謝,增加熱量消耗,強(qiáng)心護(hù)心,調(diào)節(jié)血壓和調(diào)節(jié)胃腸平滑肌,促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)等方面的作用。
柑橘落果率高,座果率低,每年雖產(chǎn)生大量落果,但僅有少數(shù)能得到利用,大多柑橘落果腐爛地中,不僅加重了環(huán)境負(fù)擔(dān),且造成了嚴(yán)重的資源浪費(fèi)。本研究從全國(guó)各柑橘主要產(chǎn)區(qū)湖北宜昌、湖南懷化、廣東潮州、廣西南寧、福建漳州、浙江衢州等地分別收集了柑、橙、柚三種柑橘屬植物的第一次生理落果,并選取其中具有代表性的六種有效活性成分(川陳皮素、橘皮素、橙皮苷、柚皮苷、檸檬苦素、辛弗林)作為定量檢測(cè)指標(biāo),采用HPLC 法測(cè)定其含量,旨在選取有效活性成分含量豐富的柑橘落果品種,為將來(lái)從中進(jìn)一步提取活性成分并將其應(yīng)用到各方面奠定基礎(chǔ)。
本試驗(yàn)選取柑橘屬植物中的柑、橙、柚作為研究對(duì)象,由于各產(chǎn)地氣候差異,柑橘第一次生理落果時(shí)間有所不同,故本實(shí)驗(yàn)的原料采集日期自4 月底開(kāi)始,至6 月初結(jié)束,分別從湖北宜昌、湖南懷化、廣東潮州、廣西南寧、福建漳州、浙江衢州等柑橘主要產(chǎn)區(qū)收集,具體品種見(jiàn)下表1;川陳皮素、橘皮素、橙皮苷、柚皮苷、檸檬苦素以及辛弗林對(duì)照品(HPLC 級(jí))
表1 柑橘落果品種Table 1 Citrus young fruit cultivars
均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司,HPLC≥98%;乙腈、甲醇 色譜純,購(gòu)自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;十二烷基磺酸鈉(SDS)色譜純,購(gòu)自武漢市偉琪博星生物科技有限公司;磷酸 分析純,購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。
Waters-e2695 高效液相色譜儀 美國(guó)沃特世公司;DHG-06-100B 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 武漢海聲達(dá)儀器設(shè)備有限公司;MM400 冷凍混合球磨機(jī)Retsch 公司;YB-300 高速多功能粉碎機(jī) 永康市速鋒工貿(mào)有限公司;Milli-Q 超純水機(jī) 貝徠美生物科技有限公司;KQ-300DE 超聲波清洗機(jī) 昆山市超聲儀器有限公司;SHZ-D(III)循環(huán)水式多用真空泵上海力辰邦西儀器科技有限公司;JE203 電子天平上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司。
1.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取橙皮苷、柚皮苷、川陳皮素、檸檬苦素、辛弗林對(duì)照品20 mg,置于25 mL 容量瓶中,加甲醇溶液,定容,搖勻,得各對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。分別精密吸取1、3、5、7 mL 對(duì)照品儲(chǔ)備溶液于10 mL 容量瓶中,用甲醇定容,即得各濃度對(duì)照品溶液。橘皮素:精密稱取橘皮素對(duì)照品20 mg,置于25 mL 容量瓶中,加甲醇溶液,定容,搖勻,得橘皮素對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。分別精密吸取0.5、1、1.5、2、2.5 mL 橘皮素對(duì)照品儲(chǔ)備溶液于10 mL容量瓶中,用甲醇定容,得到各濃度對(duì)照品溶液。
1.2.2 供試品溶液的制備 將不同品種落果置于60 ℃烘箱烘干至恒重,用高速粉碎機(jī)打成粉末,過(guò)60 目篩,精確稱取1.0 g,置于具塞錐形瓶中,加入25 mL 甲醇,密塞,稱定質(zhì)量,超聲處理30 min 后取出,放冷至室溫,稱定質(zhì)量,補(bǔ)齊質(zhì)量,搖勻過(guò)濾,取續(xù)濾液,過(guò)0.22 μm 濾膜,即得供試品溶液。
1.2.3 色譜條件 色譜柱為Global Chromatography C柱,規(guī)格:250 mm×4.6 mm,5 μm;柱溫:30 ℃;流速為1.0 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL。川陳皮素、橘皮素:流動(dòng)相為超純水(A)-乙腈(B),梯度洗脫,條件為0~15 min,40%~55% B;15~20 min,55%~70% B;20~30 min,70%~80% B;檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm。橙皮苷、柚皮苷:流動(dòng)相為超純水(A)-乙腈(B),等度洗脫,條件為80:20;檢測(cè)波長(zhǎng)為283 nm。檸檬苦素:流動(dòng)相為超純水(A)-乙腈(B),等度洗脫,條件為55:45;檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。辛弗林:流動(dòng)相為超純水(A)-乙腈(B),等度洗脫,條件為68:32,水中含0.05%十二烷基磺酸鈉和0.02%磷酸;檢測(cè)波長(zhǎng)為275 nm。
1.2.4 定性及定量方法 吸取最高濃度的各對(duì)照品溶液1 mL,用甲醇稀釋,分別定容至25 mL 容量瓶,放入紫外分光光度計(jì)中,在200~400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描,根據(jù)紫外吸收?qǐng)D譜中最大吸收波長(zhǎng)對(duì)活性成分進(jìn)行HPLC 法測(cè)定。隨后精密吸取各對(duì)照品溶液及供試品溶液10 μL,按“1.2.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析,每個(gè)樣品設(shè)置三個(gè)平行,使用外標(biāo)法,根據(jù)所得各活性成分保留時(shí)間以及峰面積計(jì)算各供試品溶液中川陳皮素、橘皮素、橙皮苷、柚皮苷、檸檬苦素以及辛弗林的含量。
利用Excel、SPSS Statistics 26 軟件對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。每組樣品設(shè)置三個(gè)平行,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。
2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)分別對(duì)川陳皮素、橘皮素、橙皮苷、柚皮苷、檸檬苦素以及辛弗林6 種物質(zhì)溶液進(jìn)行掃描,結(jié)果顯示川陳皮素與橘皮素兩種多甲氧基黃酮均在330 nm 附近有最大吸收波長(zhǎng);橙皮苷與柚皮苷均在283 nm 附近有最大吸收波長(zhǎng);檸檬苦素的最大吸收波長(zhǎng)出現(xiàn)在210 nm 處,辛弗林的最大吸收波長(zhǎng)為275 nm。故選擇上述波長(zhǎng)條件進(jìn)行高效液相色譜的檢測(cè),如圖1 所示。
圖1 各活性成分紫外吸收光譜圖Fig.1 UV absorption spectra of active components
2.1.2 流動(dòng)相的確定 為獲得較好的分離度,結(jié)合出峰時(shí)間、峰型等因素,參考文獻(xiàn)報(bào)道[19-22]稍作調(diào)整。最終確定選擇乙腈-水作為流動(dòng)相,取“1.2.2”項(xiàng)中的供試品溶液10 μL,注入液相色譜儀,記錄譜圖如下。由圖2 可知,A 圖中的1、2 號(hào)峰分別為川陳皮素與橘皮素,兩種多甲氧基黃酮的色譜峰分離度及峰型均較好,符合高效液相色譜定量分析的一般要求;B 圖中的3 號(hào)峰為橙皮苷色譜峰,同一波長(zhǎng)下沒(méi)有其余雜質(zhì)峰,峰型較好;C 圖中的4 號(hào)峰為柚皮苷色譜峰,同一波長(zhǎng)下沒(méi)有其余雜質(zhì)峰,分離度好,峰型標(biāo)準(zhǔn);D 圖中的5 號(hào)峰為檸檬苦素;E 圖中的6 號(hào)峰為辛弗林,可以看出峰與峰之間分離清晰,分離度均大于1.5,峰型標(biāo)準(zhǔn),如圖2 所示。
圖2 柑橘落果供試品溶液HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of the test solution of young Citrus fruit
2.2.1 線性關(guān)系、檢出限及定量限的考察 精密吸取“1.2.1”項(xiàng)下各濃度的對(duì)照品溶液10 μL 注入液相色譜儀,以濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸分析;取各單品對(duì)照品溶液,用甲醇稀釋,分別以信噪比S/N=3 和S/N=10 時(shí)對(duì)應(yīng)的物質(zhì)濃度為檢出限(LOD)和定量限(LOQ),結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示,各成分在各自線性范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系,決定系數(shù)均大于0.99,檢出限在0.05~0.12 μg/mL 范圍內(nèi),定量限在1.14~3.53 μg/mL 范圍內(nèi)。
表2 線性回歸方程Table 2 Linear regression equation
2.2.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取“1.2.1”項(xiàng)中所配制的不同濃度各對(duì)照品儲(chǔ)備液中濃度最高溶液10 μL,在上述“1.2.3”的色譜條件下,連續(xù)進(jìn)樣6 次,記錄川陳皮素、橘皮素、橙皮苷、柚皮苷、檸檬苦素和辛弗林的峰面積,計(jì)算其峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(n=6)。結(jié)果顯示各對(duì)照品溶液峰面積RSD 范圍為0.37%~0.79%,均≤2.0%,表明儀器具有較好的精密度。
2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取烘干粉碎后的同一品種落果樣品,按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備供試液,分別在0、2、6、10、12、24 h 進(jìn)樣,按照上述“1.2.3”項(xiàng)色譜條件測(cè)定川陳皮素、橘皮素、橙皮苷、柚皮苷、檸檬苦素以及辛弗林的峰面積,測(cè)定結(jié)果顯示以上物質(zhì)的RSD(n=6)分別為0.56%、0.33%、0.67%、0.71%、0.48%和0.36%,表明供試品溶液在室溫下24 h 內(nèi)穩(wěn)定。
2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一品種烘干粉碎后的落果樣品共6 份,每份1.0 g,精密稱定,按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備供試液,分別測(cè)定川陳皮素、橘皮素、橙皮苷、柚皮苷、檸檬苦素以及辛弗林的含量,計(jì)算得出它們的RSD(n=6)分別為1.44%、0.89%、0.59%、1.24%、1.17%和0.95%,表明該方法重現(xiàn)性良好。
2.2.5 加樣回收率試驗(yàn) 選取浙江衢州胡柚和湖北宜昌臍橙兩品種落果進(jìn)行加樣回收試驗(yàn),精密稱取已知含量的兩品種供試樣品共18 份,每份1.0 g,分別加入不同濃度的川陳皮素、橘皮素、橙皮苷、柚皮苷、檸檬苦素、辛弗林的對(duì)照品溶液適量,按供試品溶液的制備方法制備加樣供試液并按“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,計(jì)算加樣回收率。結(jié)果表明:川陳皮素的平均回收率為97.5%(RSD=0.6%)、橘皮素的平均回收率為97.3%(RSD=1.1%)、橙皮苷的平均回收率為99.4%(RSD=1.2%)、柚皮苷的平均回收率為100.8%(RSD=0.8%)、檸檬苦素的平均回收率為99.5%(RSD=1.1%)、辛弗林的平均回收率為98.0%(RSD=1.4%),表明該方法準(zhǔn)確可靠,結(jié)果見(jiàn)表3。
表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Test results of sample addition recovery
對(duì)照品溶液與供試品溶液各進(jìn)樣10 μL,每個(gè)樣品作三次平行,記錄峰面積。對(duì)于未在線性范圍濃度內(nèi)的樣品進(jìn)行稀釋或濃縮處理,測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。
由表4 可知,不同產(chǎn)地間柑品種落果中川陳皮素含量由高到低前6 位依次為浙江衢州>湖北宜昌>廣東潮州>云南麗江>廣西南寧>湖南懷化,與橘皮素和橙皮苷含量由高到低前6 位相同,只存在個(gè)別省份的順序差異。福建漳州、重慶與四川眉山三地落果中諸如多甲氧基黃酮、橙皮苷等黃酮類化合物的含量較少,由此可以推測(cè),在我國(guó)東部、中東部以及南部地區(qū)所種植的柑類落果中含有的黃酮類化合物含量較高,西南部柑類落果中黃酮類化合物含量較少。檸檬苦素在柑類落果中含量由高到低前6 位為浙江衢州>廣西南寧>廣東潮州>福建漳州>湖北宜昌>湖南懷化,均超過(guò)100 μg/g。辛弗林含量較高的柑品種主要集中在我國(guó)中東部以及南部的廣西、湖北等地。
表4 不同產(chǎn)地柑、橙、柚品種落果生理功能活性物質(zhì)含量Table 4 Contents of physiological functions and active substances in young fruits of mandarin orange,orange and pomelo varieties from different habitats
各產(chǎn)地橙品種中川陳皮素與橘皮素含量變化差異不大,橙皮苷含量由高到低為湖北宜昌>廣西南寧>重慶>浙江衢州>云南麗江>湖南懷化,檸檬苦素含量較高的產(chǎn)地集中在廣西南寧、湖北宜昌、江西贛南,含量超過(guò)100 μg/g,與譚潤(rùn)雅等的測(cè)定結(jié)果一致。辛弗林含量由高到低前6 位為重慶>福建漳州>湖南懷化>江西贛南>云南麗江>浙江衢州,推測(cè)在我國(guó)西南部以及東南部種植的橙品種落果中辛弗林的含量較高。
柚品種落果中含有豐富的柚皮苷,其中含量較高的品種主要集中在湖北宜昌、重慶、江西贛南以及福建漳州等地,含量均超過(guò)15000 μg/g。檸檬苦素含量較高的地區(qū)為福建漳州,廣西南寧以及湖北宜昌,均超過(guò)200 μg/g。柚皮苷和檸檬苦素是柑橘中起主要作用的苦味物質(zhì),由此可推測(cè),在我國(guó)中部以及東南部地區(qū)種植的柚子品種落果中的苦味物質(zhì)較多,東部及南部地區(qū)柚子落果中苦味物質(zhì)相對(duì)較少。
本研究選取我國(guó)不同產(chǎn)地柑橘主要產(chǎn)區(qū)的柑橘第一次生理落果為試驗(yàn)原料,采用HPLC 法進(jìn)行測(cè)定,分析結(jié)果表明,不同產(chǎn)地不同品種柑橘落果中黃酮類化合物、檸檬苦素以及生物堿辛弗林的含量差異顯著。
從總體來(lái)看,在所檢測(cè)的所有柑橘屬植物中,川陳皮素含量最高的是浙江衢州的柑品種落果,為359.63 μg/g,其次為湖北宜昌、云南麗江以及廣東潮州的柑品種落果。柑品種中川陳皮素的含量明顯高于橙品種。橘皮素含量最高的同樣為浙江衢州的柑,為222.14 μg/g。其次為湖北宜昌、云南麗江以及湖南懷化的柑品種落果,柑品種中橘皮素的含量普遍大于橙品種。柚品種中僅能檢出少量的多甲氧基黃酮,與趙梓燕的檢測(cè)結(jié)果一致。由于胡柚為柚與柑雜交栽培出的雜交柚品種,故其中多甲氧基黃酮的含量略高。除浙江衢州胡柚以外,其他的柚類落果中川陳皮素、橘皮素含量均在10 μg/g 以下。
橙皮苷含量最高的落果品種為湖北宜昌橙,為1485.73 μg/g,其次為廣西南寧的橙品種、柑品種以及浙江衢州的柑品種落果。柑品種與橙品種中橙皮苷的含量大致相同,沒(méi)有明顯差異。除在浙江衢州胡柚中檢測(cè)到少量橙皮苷以外,其余柚品種落果均不含橙皮苷。湖北宜昌柚中的柚皮苷含量最高,為20.97 mg/g,其次為重慶、江西贛南以及福建漳州的柚品種落果。柑品種、橙品種落果中均未檢出柚皮苷。
福建漳州的柚落果中檸檬苦素含量最高,為866.73 μg/g。其次為廣西南寧柚、浙江衢州柑以及廣西南寧的柑品種落果。廣西南寧的沃柑落果中辛弗林含量最高,為1004.14 μg/g。其次為湖北宜昌椪柑,福建漳州沃柑以及湖南懷化椪柑。柚品種落果中均未檢出辛弗林,柑品種中辛弗林含量普遍高于橙品種。
與張靜等的研究成果對(duì)比發(fā)現(xiàn),柑橘幼果中的川陳皮素、橘皮素兩類多甲氧基黃酮的含量顯著大于成熟柑橘果肉中的含量。柑品種落果中的川陳皮素含量與成熟柑橘果皮中含量近乎一致,柑、橙品種落果中的橘皮素含量與成熟柑橘果皮中含量近乎一致。橙皮苷的含量略小于成熟柑橘果肉中的含量;與蘇智先等的研究結(jié)果比較,柚類幼果中的柚皮苷含量普遍大于成熟柚果實(shí)中的柚皮苷含量,說(shuō)明隨著柚類果實(shí)的成熟,苦味物質(zhì)逐漸減少;與吳今人等的研究結(jié)果進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn),柑、橙、柚類幼果中檸檬苦素的含量普遍小于成熟柑橘果肉與果皮;與劉偉等的研究結(jié)果進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)柑、橙幼果中的辛弗林含量均小于成熟柑橘中的辛弗林含量。
黃酮類化合物的常規(guī)檢測(cè)方法例如紫外分光光度法等,只能測(cè)定總黃酮的含量,且實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)紫外吸收光譜測(cè)定的黃酮含量誤差較大,準(zhǔn)確度不高,可靠性差。本實(shí)驗(yàn)選用HPLC 法測(cè)定柑橘落果中的活性成分,既方便快捷,又具有較好的靈敏性、準(zhǔn)確度,還可同時(shí)測(cè)定多種物質(zhì),能夠滿足不同產(chǎn)地不同品種柑橘落果的測(cè)定要求。
從質(zhì)量評(píng)價(jià)角度來(lái)看,經(jīng)過(guò)現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí),黃酮類化合物如橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷等具有保護(hù)心血管健康、抗疲勞焦慮等功效;生物堿類化合物辛弗林可促進(jìn)胃腸動(dòng)力,松弛支氣管平滑肌,與《中國(guó)藥典》2015 年版所記載中功效相一致。故可以橙皮苷、柚皮苷以及辛弗林的含量作為評(píng)價(jià)柑橘落果質(zhì)量的標(biāo)志物。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,湖北宜昌的柑品種、橙品種、柚品種,廣西南寧的橙品種、柑品種以及重慶的柚品種落果的質(zhì)量較高,具有良好的藥理活性。從提取有效成分含量最大化的角度來(lái)看,在未來(lái)進(jìn)行柑橘落果中生理活性物質(zhì)的提取試驗(yàn)時(shí)選擇浙江衢州、廣西南寧的柑品種,湖北宜昌的橙品種,福建漳州以及湖北宜昌的柚品種預(yù)計(jì)可獲得較高的有效成分含量,能夠顯著凸顯提取效果。
柑橘生理落果資源豐富,采用HPLC 法測(cè)定不同產(chǎn)地柑橘落果中活性成分的含量,有助于對(duì)落果的針對(duì)性利用,爭(zhēng)取資源利用最大化,具有極大的工業(yè)化生產(chǎn)價(jià)值,另外對(duì)于減輕環(huán)境負(fù)擔(dān),減少污染等方面也具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。本實(shí)驗(yàn)僅探究了不同產(chǎn)地柑橘落果中活性成分含量的區(qū)別,至于造成以上差異的原因例如環(huán)境土壤、種植方式、氣候條件等外部因素還有待進(jìn)一步研究。