過(guò)繼性T細(xì)胞治療在非小細(xì)胞肺癌中的研究進(jìn)展*

顏次慧 任秀寶

T 細(xì)胞是獲得性抗腫瘤免疫的重要細(xì)胞亞群。T細(xì)胞通過(guò)其表面的T 細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）特異性識(shí)別主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）分子與腫瘤抗原形成的MHC-抗原肽復(fù)合物（peptide-MHC complex，pMHC），啟動(dòng)針對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷功能。TCR 包括αβ和γδ 兩種異源二聚體，其中TCRαβ 占TCR 總量的95%以上。TCR 以非共價(jià)鍵與CD3 二聚體CD3γε、CD3δε 和CD3ζζ 形成TCR-CD3 復(fù)合物。通過(guò)CD3 亞基的免疫受體酪氨酸激活基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM），TCR 活化信號(hào)向下游傳遞，T 細(xì)胞活化、增殖，并分泌炎癥因子（IL-2、TNF-α、IFN-γ）、殺傷因子（穿孔素、顆粒酶）以及死亡配體（TNF 相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體TRAIL 和FasL），從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞裂解死亡，并引發(fā)旁觀者免疫反應(yīng)。然而，腫瘤往往處于免疫逃逸狀態(tài)。這種狀態(tài)，一方面是由于具有腫瘤特異性識(shí)別能力的T 細(xì)胞無(wú)法浸潤(rùn)至腫瘤內(nèi)部（冷腫瘤）；另一方面是即使T 細(xì)胞進(jìn)入腫瘤內(nèi)部，由于TCR 信號(hào)的反復(fù)刺激和免疫抑制微環(huán)境的影響，導(dǎo)致T 細(xì)胞免疫檢查點(diǎn)等免疫抑制分子的表達(dá)升高，分泌細(xì)胞因子的功能下降，細(xì)胞走向耗竭[1]。免疫檢查點(diǎn)抑制劑能夠逆轉(zhuǎn)耗竭T 細(xì)胞前體細(xì)胞，使其再次活化發(fā)揮抗腫瘤免疫功能，但僅對(duì)少數(shù)腫瘤患者有效。尋找提高T 細(xì)胞數(shù)量、增強(qiáng)其抗腫瘤功能的新型免疫治療方法是目前抗腫瘤免疫治療研究的難點(diǎn)與熱點(diǎn)。

過(guò)繼性T 細(xì)胞免疫治療通過(guò)體外富集、擴(kuò)增腫瘤特異性T 細(xì)胞，將其回輸至自體患者體內(nèi)，以達(dá)殺傷腫瘤的目的。擴(kuò)增的T 細(xì)胞既可來(lái)自于腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs）,也可來(lái)自經(jīng)基因改造的外周血T 細(xì)胞，如嵌合抗原受體T 細(xì)胞（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）、T 細(xì)胞受體工程化T 細(xì)胞（T-cell receptor engineering T cell，TCR-T）。過(guò)繼性T 細(xì)胞治療最早應(yīng)用于同種異體造血干細(xì)胞移植治療白血病，能夠顯著降低患者復(fù)發(fā)率。自1998年開(kāi)展TILs 治療轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤的臨床研究，2006年以黑色素瘤抗原-1（melanoma antigen recognized by T cells 1，MART-1）作為靶抗原的TCRT 用于惡性黑色瘤治療。2008年，以CD20 作為靶標(biāo)的CAR-T 在惰性B 細(xì)胞淋巴瘤和套細(xì)胞淋巴瘤治療中顯現(xiàn)潛在治療效果。近年來(lái)，在消化道腫瘤、腦膠質(zhì)瘤等實(shí)體腫瘤中報(bào)道了過(guò)繼性T 細(xì)胞療法[2-3]。多項(xiàng)過(guò)繼性T 細(xì)胞治療非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的臨床試驗(yàn)也正在招募或開(kāi)展當(dāng)中。本文將對(duì)TILs、CAR-T、TCR-T 細(xì)胞治療NSCLC 的最新進(jìn)展進(jìn)行綜述，重點(diǎn)闡述各種治療方法面臨的挑戰(zhàn)和今后潛在發(fā)展策略，以期為優(yōu)化臨床研究設(shè)計(jì)和開(kāi)展新型NSCLC 免疫治療提供思路。

1 過(guò)繼性T 細(xì)胞的生物學(xué)特征

1.1 TILs

TILs 是存在于腫瘤微環(huán)境中的異質(zhì)性免疫細(xì)胞群體。在免疫抑制的腫瘤微環(huán)境中，抗原提呈細(xì)胞難以浸潤(rùn)至腫瘤組織內(nèi)部，而且腫瘤細(xì)胞MHC-I 分子表達(dá)缺失，造成腫瘤抗原提呈受抑，TILs 難以激活。即使腫瘤抗原被提呈至T 細(xì)胞，由于PD-1、TIM3 等免疫檢查點(diǎn)分子表達(dá)上調(diào)誘導(dǎo)了免疫抑制信號(hào)，TILs仍不能被有效活化，或是在剛活化后即發(fā)生活化誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，或向耗竭轉(zhuǎn)變[1]。TILs 包含的腫瘤特異性T 細(xì)胞比例遠(yuǎn)高于外周血等其他非腫瘤組織，TILs具有多克隆型，且更大比例的靶向主干（truncal）新抗原，是理想的過(guò)繼性T 細(xì)胞治療的細(xì)胞來(lái)源[4]。TILs一旦脫離免疫抑制微環(huán)境，在TCR 活化信號(hào)與細(xì)胞因子的聯(lián)合作用下，可大量擴(kuò)增至1010，滿(mǎn)足臨床細(xì)胞回輸?shù)囊骩5]。TILs 擴(kuò)增方案主要包括3 個(gè)步驟：1）使用高濃度IL-2 從腫瘤組織中富集TILs；2）鑒定篩選腫瘤特異性反應(yīng)的TILs；3）快速大量擴(kuò)增篩選后的TILs（圖1）。整個(gè)TILs 分離擴(kuò)增過(guò)程需要6～8 周。

1.2 CAR-T

CAR-T 是經(jīng)基因改造使特異性抗原識(shí)別特征改變的T 細(xì)胞。CAR-T 細(xì)胞無(wú)MHC 限制性，拓寬了基因改造T 細(xì)胞的應(yīng)用范圍。CARs 是一段合成的融合蛋白，由胞外靶抗原結(jié)合域、鉸鏈區(qū)、跨膜結(jié)合域、胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域4 部分構(gòu)成。胞外靶抗原結(jié)合域由抗原特異性單克隆抗體scFv （重鏈和輕鏈可變區(qū)通過(guò)柔性接頭連接構(gòu)成的單鏈可變片段） 構(gòu)成。ScFv與抗原表位的親和力特征是影響CAR 識(shí)別抗原、激活T 細(xì)胞的重要指標(biāo)。鉸鏈區(qū)位于胞外，為來(lái)源于免疫球蛋白、CD28、CD8 的多肽片段，其功能是克服空間位阻，以利于scFv 與抗原表位結(jié)合?？缒そY(jié)合域的作用是將CAR 錨定在T 細(xì)胞膜上，也影響CAR 表達(dá)水平、穩(wěn)定性及胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域在CAR 結(jié)合抗原表位時(shí)直接啟動(dòng)T 細(xì)胞活化。

CAR-T 的發(fā)展過(guò)程伴隨著CARs 胞內(nèi)區(qū)結(jié)構(gòu)的不斷改進(jìn)與優(yōu)化（圖2）。第一代CARs 的胞內(nèi)區(qū)僅包含CD3ζ 鏈，增殖活性低，細(xì)胞毒性作用持續(xù)時(shí)間短。為克服這此缺點(diǎn)，第二和三代CARs 在胞內(nèi)區(qū)增加了1 或2 個(gè)共刺激分子（CD28、4-1BB、ICOS、CD27、OX40 和DAP10）[6]。第四代CARs 旨在對(duì)CAR-T 進(jìn)行調(diào)節(jié)，如增加自殺基因以減少腫瘤清除后CAR-T細(xì)胞對(duì)正常組織的損傷，或增加誘導(dǎo)IL-12、IL-15 等細(xì)胞因子生成的基因，以增強(qiáng)CAR-T 的殺傷功能和體內(nèi)長(zhǎng)期生存能力[7]。隨著傳統(tǒng)CRISPR-Cas9 系統(tǒng)以及新型編輯方法在CARs 設(shè)計(jì)中的應(yīng)用，下一代CARs 將更加精準(zhǔn)地將治療和調(diào)控基因插入至特定基因位點(diǎn)，生產(chǎn)更加安全、有效、生存持久、以及應(yīng)用通用型的CAR-T[8]。目前臨床獲批以及臨床試驗(yàn)中應(yīng)用最多的為第二代CARs，少量第三代CARs 也已進(jìn)入臨床研究階段。2017年，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)首個(gè)CAR-T 細(xì)胞療法。2021年，中國(guó)相繼批準(zhǔn)2 款針對(duì)CD19 抗原的CAR-T 療法。

1.3 TCR-T

TCR-T 的制備過(guò)程包括：鑒定篩選具有良好抗腫瘤反應(yīng)的T 細(xì)胞，克隆其TCR，并插入逆轉(zhuǎn)錄或慢病毒載體，利用病毒感染待回輸患者的外周血T 細(xì)胞，擴(kuò)增T 細(xì)胞，進(jìn)行回輸。腫瘤相關(guān)抗原包括組織分化抗原（tumor associated antigen，TAAs）、癌癥-睪丸抗原（cancer-testis antigens，CTAs）、基因突變產(chǎn)生的腫瘤新抗原（neoantigens）、病毒抗原、表觀改變的抗原以及存在于非轉(zhuǎn)化的腫瘤血管和間質(zhì)的抗原。腫瘤新抗原僅在腫瘤中表達(dá)，CTAs 在特定腫瘤中表達(dá)，且只在睪丸、胎盤(pán)等少數(shù)免疫豁免的正常組織中表達(dá)。因此，腫瘤新抗原和CTAs 又稱(chēng)為腫瘤特異性抗原（tumor specific antigens，TSAs）。

TAAs 是早期最常用使用的TCR-T 靶抗原，如癌胚抗原（CEA），黑色素細(xì)胞分化抗原PMEL（gp100）、MART-1、酪氨酸酶、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1 和2 等。但由于TAAs 也在正常組織中少量表達(dá)，因此在發(fā)揮抗腫瘤作用的同時(shí)往往導(dǎo)致脫靶效應(yīng)。NY-ESO-1屬于CTAs，其在多種腫瘤組織中表達(dá)，正常組織中僅有睪丸組織表達(dá)，是腫瘤免疫治療的理想靶抗原。與以TAAs 作為靶標(biāo)的TCR-T 比較，NY-ESO-1-TCRT 治療導(dǎo)致的嚴(yán)重不良反應(yīng)發(fā)生率顯著降低，NYESO-1 已成為目前TCR-T 臨床研究最常用的靶抗原之一[9]。

TILs 來(lái)自腫瘤組織的多克隆型T 細(xì)胞群體，CAR-T 和TCR-T 的抗原特異性來(lái)自基因改造，三者密切關(guān)聯(lián)，針對(duì)TILs 新抗原和特異性克隆型的篩選為開(kāi)展CAR-T 和TCR-T 的研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

2 過(guò)繼性T 細(xì)胞治療在NSCLC 中的臨床應(yīng)用

2.1 TILs

根據(jù)NSCLC 腫瘤與間質(zhì)部位TILs 的分布密度，將NSCLC 的免疫亞型分為炎癥型、免疫豁免型、免疫沙漠型3 類(lèi)，分別占44.0%、37.1%、18.9%[10]。NSCLC 的TILs 中包含腫瘤特異性T 細(xì)胞[11]。NSCLC患者腫瘤取材較為方便可行。31%～40% 的晚期NSCLC 患者可能發(fā)生鎖骨上轉(zhuǎn)移，40%以上的患者可能發(fā)生胸膜轉(zhuǎn)移，通過(guò)穿刺或胸腔鏡即可獲取腫瘤組織。而且，65%的晚期NSCLC 患者肺CO 彌散容量≥50%，能夠耐受TILs 回輸前的非清髓性淋巴細(xì)胞清除預(yù)處理以及回輸中和之后的高劑量IL-2 持續(xù)給藥。以上條件為T(mén)ILs 應(yīng)用于NSCLC 治療提供了前提條件。

目前，TILs 應(yīng)用于NSCLC 治療的研究較少，已在Clinicaltrial.gov 注冊(cè)的臨床研究包括：NC T03215810、NCT03903887、NCT02133196、NCT0461 4103、NCT03645928、NCT04919616。一項(xiàng)晚期NSCLC 患者在nivolumab 單藥治療進(jìn)展后接受TILs 聯(lián)合nivolumab 的1b 期單臂臨床研究（NCT03215810），共納入20 例患者，嚴(yán)重不良反應(yīng)發(fā)生率低于17%，13例患者可進(jìn)行療效評(píng)估（客觀反應(yīng)3 例），共11 例患者腫瘤負(fù)荷下降，中位最佳腫瘤縮小率35%[12]。TILs中存在識(shí)別腫瘤突變的特異性T 細(xì)胞，且此特異性T細(xì)胞在對(duì)治療反應(yīng)的患者來(lái)源的TILs 中比例較高；TILs 回輸后，特異性T 細(xì)胞在外周血的比例增加，且可長(zhǎng)期存在[12]?；剌敗澳贻p”狀態(tài)TILs 可提高抗腫瘤療效，但對(duì)NSCLC 的作用尚待研究。以上結(jié)果表明TILs 聯(lián)合PD-1 抗體治療晚期NSCLC 的可行性，顯示潛在抗腫瘤作用，有望成為轉(zhuǎn)移性肺癌的治療新策略。

2.2 CAR-T

CARs 以MHC 非限制性的方式識(shí)別表面抗原，除表面抗原外，CARs 還能識(shí)別糖類(lèi)和糖脂。將條件性調(diào)控信號(hào)活化和清除CARs 的反應(yīng)元件加入CARs 結(jié)構(gòu)中可在保證CAR-T 療效的同時(shí)降低不良反應(yīng)的發(fā)生。針對(duì)CD19 的CAR-T 已在血液腫瘤中取得成功，但CAR-T 治療實(shí)體腫瘤仍面臨挑戰(zhàn)。

目前處于肺癌CAR-T 細(xì)胞基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)階段的靶抗原包括表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、人表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）、間皮素（mesothelin，MSLN）、前列腺干細(xì)胞抗原（prostate stem cell antigen，PSCA）、黏蛋白1（mucin 1，MUC1）、CEA、酪氨酸激酶樣孤兒受體1（receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1，ROR1）、PD-L1和CD80/CD86。EGFR 屬于生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶ErbB 家族成員。EGFR 在NSCLC 原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移灶中高表達(dá)，是抗體依賴(lài)的免疫治療的重要靶點(diǎn)。在一項(xiàng)二代EGFR-CAR-T 治療復(fù)發(fā)和難治EGFR 陽(yáng)性NSCLC 患者的Ⅰ期臨床研究（NCT01869166）中，共入組11 例患者，所有患者未發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)，并均進(jìn)行了療效評(píng)價(jià)，其中2 例部分緩解和5 例疾病穩(wěn)定患者維持時(shí)間達(dá)2～8 個(gè)月[13]。基因修飾T 細(xì)胞多采用逆轉(zhuǎn)錄或慢病毒感染的方式將外源基因插入T細(xì)胞基因組中。在一項(xiàng)利用PiggyBac（PB）轉(zhuǎn)座子制備EGFR-CAR-T 的Ⅰ期臨床研究（NCT03182816）中，共納入9 例EGFR 陽(yáng)性的晚期復(fù)發(fā)或難治性NSCLC患者，中位無(wú)病生存和總生存時(shí)間分別為7.13 個(gè)月和15.63 個(gè)月，結(jié)果表明經(jīng)PB 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)修飾改造EGFR-CAR-T 細(xì)胞治療EGFR 陽(yáng)性NSCLC 患者安全可行，值得進(jìn)一步研究[14]。HER2 也是CAR-T 肺癌治療的潛在靶點(diǎn)，但1 例個(gè)案報(bào)道結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移至肺和肝臟患者在接受HER2-CAR-T 回輸15 min 內(nèi)發(fā)生呼吸窘迫癥，與正常肺上皮表達(dá)HER2 相關(guān)[15]。MSLN是細(xì)胞黏附糖蛋白，促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。MSLN 在60%的肺腺癌中表達(dá)，但不表達(dá)于正常肺組織[16]。在一項(xiàng)MSLN-CAR-T 治療晚期惡性腫瘤的Ⅰ期臨床研究（NCT01583686）中，納入肺癌、胰腺癌、惡性間皮瘤、宮頸癌和卵巢癌患者共15 例，嚴(yán)重不良發(fā)生率為40%（6/15），1 例維持疾病穩(wěn)定達(dá)3.5 個(gè)月。多項(xiàng)MSLNCAR-T 治療肺癌的臨床研究（NCT02414269、NCT-02580747）正在進(jìn)行中。MUC1 為跨膜糖蛋白，PSCA 為糖基磷脂酰肌醇錨定細(xì)胞表面蛋白，兩者均在NSCLC中高表達(dá)。針對(duì)PSCA聯(lián)合MUC1的CAR-T治療NSCLC PDX 小鼠模型，顯示協(xié)同抗腫瘤作用[17]。目前尚無(wú)兩者臨床研究結(jié)果的報(bào)道。CD80/CD86 與CTLA4 結(jié)合阻斷T 細(xì)胞活化，CD80/CD86 在肺癌細(xì)胞中表達(dá)，是解除T 細(xì)胞早期活化抑制的理想靶分子。然而，CD80/CD86 也表達(dá)于免疫細(xì)胞。因此，使用靶向CD80/CD86 的CAR-T 可能導(dǎo)致自體免疫損傷。

2.3 TCR-T

目前，TCR-T 臨床治療研究涉及的腫瘤包括肺癌、宮頸癌、鼻咽癌、頭頸部腫瘤、乳腺癌、尿路上皮癌等。作為靶蛋白的腫瘤相關(guān)靶抗原包括MAGE-A4、NYESO-1、KK-LC-1 等，針對(duì)病毒相關(guān)腫瘤的治療多采用EBV、HPV E7 和E6 抗原。

NY-ESO-1 免疫原性高且表達(dá)特異，是肺癌TCRT 治療研究最多的靶抗原。NY-ESO-1 在NSCLC 中的表達(dá)率為11.8%～28.1%，且遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和Ⅲ～Ⅳ期患者腫瘤組織NY-ESO-1 的表達(dá)高于非遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和Ⅰ～Ⅱ早期患者[18]。一項(xiàng)研究招募了4 例HLA-A2陽(yáng)性轉(zhuǎn)移NSCLC 患者，腫瘤組織均表達(dá)NY-ESO-1，接受非清髓性淋巴細(xì)胞清除預(yù)處理后回輸NY-ESO-1 特異性HLA-A2 的TCR-T，并皮下注射IL-2 維持14 天，患者耐受良好，未出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)，2 例患者對(duì)治療有反應(yīng)（NCT02457650）[19]。其他TCR-T 治療NSCLC 的臨床研究正在進(jìn)行中（NCT03029273、NC T02588612、NCT03778814、NCT04639245、NCT051 94735、NCT03970382）。

TILs、CAR-T、TCR-T 治療NSCLC 各具優(yōu)勢(shì)。在臨床及轉(zhuǎn)化研究中，需深入探索療效與不良反應(yīng)發(fā)生的預(yù)測(cè)標(biāo)記物，篩選患者進(jìn)行適合的過(guò)繼性T 細(xì)胞治療，以達(dá)最佳療效。

3 過(guò)繼性T 細(xì)胞治療的困境與未來(lái)方向

CAR-T 和TCR-T 均以特定抗原為靶點(diǎn)，可能造成脫靶效應(yīng)及嚴(yán)重不良反應(yīng)發(fā)生，而且不同瘤種間和腫瘤內(nèi)部的異質(zhì)性、免疫編輯和抗原逃逸機(jī)制往往導(dǎo)致針對(duì)單一靶標(biāo)治療效果差。CAR-T 的腫瘤浸潤(rùn)能力較差，難以進(jìn)入實(shí)體腫瘤內(nèi)部發(fā)揮功能。CAR-T 引起的細(xì)胞因子釋放綜合癥（cytokine-release syndrome，CRS）、神經(jīng)毒性和嚴(yán)重感染可能危及生命[20]。TCRT 的內(nèi)源性TCRα、β 鏈競(jìng)爭(zhēng)外源TCR，使具有腫瘤特異性的外源TCR 在T 細(xì)胞表面的表達(dá)量較低，T 細(xì)胞難以有效活化[21]。今后的研究將重點(diǎn)聚焦在選擇新因子擴(kuò)增TILs、利用高通量測(cè)序鑒定、篩選腫瘤新抗原特異性TILs；尋找最佳CAR-T 和TCR-T 靶抗原、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)靶抗原表達(dá)、優(yōu)化外源基因表達(dá)；過(guò)繼性T細(xì)胞聯(lián)合免疫調(diào)節(jié)因子等方面。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

雖然過(guò)繼性T 細(xì)胞在NSCLC 治療中的研究起步較晚，但臨床研究結(jié)果顯示了初步療效和潛在治療前景。未來(lái)過(guò)繼性T 細(xì)胞治療將向個(gè)體化、精準(zhǔn)化和新型聯(lián)合治療方向發(fā)展，以期在提高療效的同時(shí)避免脫靶效應(yīng)和嚴(yán)重不良反應(yīng)發(fā)生，使過(guò)繼性T 細(xì)胞真正成為治療NSCLC 的有利工具。