槲皮素抑制腸道病毒71型感染的機制研究*

張亞婷，陳靜，張娟麗，徐丁

蘭州大學第二醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

腸道病毒71型（enterovirus 71，EV71）是一種無包膜的單正鏈RNA病毒，屬于小核糖核酸病毒科，是引起手足口病或皰疹性咽峽炎的主要病原體。自1967年在美國加利福尼亞州發(fā)現(xiàn)以來，在全球范圍內EV71已引起數(shù)次大規(guī)模流行，重癥病例多由其引起，且病情兇險，病死率高［1-2］。國內最嚴重的疫情發(fā)生在2010年，估計有170萬人感染，其中27 000例合并嚴重的神經系統(tǒng)并發(fā)癥，最終導致了905人死亡［3］。據統(tǒng)計，在國內因手足口病引起的死亡病例中，超過90%由EV71感染所致。隨著EV-71滅活疫苗的使用，過去幾年死亡率逐步下降。

目前尚無確切有效的治療手足口病的藥物［4］，臨床工作中，利巴韋林及Ⅰ型干擾素是最常用的用于治療EV71感染的藥物［5］，此外，一些化合物，如Rupintrivir［6-7］，在兩種細胞系中均表現(xiàn)出抗EV71的活性，但臨床應用尚不成熟。因此，研究有效的抗EV71病毒藥物具有重要的臨床意義。槲皮素是植物中分布最廣的黃酮類化合物之一，目前多項研究已經證實其能夠有效抑制多種逆轉錄病毒感染，如皰疹病毒Ⅰ型、呼吸道合胞病毒［8］、丙型肝炎病毒［9］；此外，也有體外抑制乙型肝炎病毒、甲型流感病毒H1N1和人2型登革病毒感染的研究［10-12］。為此，本實驗旨在研究槲皮素體外抗腸道病毒71的能力，并對其抗病毒機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 實驗材料腸道病毒71型（C4亞型）（甘肅省疾病控制中心臨床分離株）；人橫紋肌肉瘤細胞RD細 胞（Human rhabdomyosarcoma cells，RD細胞）（中科院上海細胞所），槲皮素（Sigma-Aldrich，批號：100081-201509），EV-A71 VP1抗體（臺灣Abnova公司，批號：MAB5667-M03），Toll樣受體7（Toll-Like Receptor 7，TLR-7）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase，GAPDH）及半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）抗體（均購自上海Cell Signaling Technology公司）。

1.2 主要實驗儀器PCR儀（Takara公司）；蛋白電泳儀，轉膜儀（Bio-Rad）。

1.3 實驗方法

1.3.1 TCID50測定病毒滴度將EV71病毒用細胞維持液從1×10-1～1×10-8做10倍系列稀釋，每個稀釋度設6個重復孔，將各稀釋度的病毒液取100μL接種于細胞生長良好的單層RD細胞的96孔細胞培養(yǎng)板中，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，觀察細胞病變程度并記錄。用Reed-Muench法計算感染RD細胞中具有細胞病變效應（cytopathic effect，CPE）的孔數(shù)，計算半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（tissue culture infective dose 50%，TCID50），即50%的細胞發(fā)生CPE時的病毒稀釋度。

1.3.2 槲皮素藥物毒性測定將槲皮素分別用細胞維持液稀釋為100、50、25、12、6、3μM 6個濃度，然后分別加入RD細胞已長成單層的96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100μL，每一濃度設置3個復孔，同時設立正常細胞對照組，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察48 h，MTT法測定細胞活力，50%的細胞發(fā)生病變時的藥物濃度為CC50。實驗重復3次。

1.3.3 槲皮素抗病毒活性實驗將處于對數(shù)生長期的RD細胞接種于96孔培養(yǎng)板上，37℃條件下用100 TCID50 EV71在槲皮素連續(xù)稀釋液中感染細胞，直到達到適當?shù)募毎∽冃?，在顯微鏡下觀察槲皮素對EV71誘導的CPE的影響，并記錄細胞形態(tài)。MTT法測定細胞活力，能夠有效抑制50%細胞感染病毒的藥物濃度為EC50，SIs按CC50∶EC50比值計算。

1.3.4 槲皮素抗病毒CPE實驗原理：被感染后細胞大多可引起細胞病變（感染細胞會出現(xiàn)變圓、壞死、破碎或者脫落），這與其他病毒的表現(xiàn)形式有所不同，無需染色便可直接在普通光學顯微鏡下觀察。因此我們通過比較相同條件下的MOI病毒感染下實驗組與對照組的細胞病變效應差異，便可直接看出槲皮素抗EV71病毒感染的能力。操作步驟：培養(yǎng)細胞在鋪板后24 h感染相同MOI病毒，實驗組加槲皮素，24 h后在鏡下觀察并拍照。

1.3.5 Western blot法檢測EV71病毒蛋白VP1表達情況RD細胞鋪于6孔細胞培養(yǎng)板，槲皮素預處理細胞2 h，接入病毒，培養(yǎng)24 h后，不同處理細胞樣品進行電泳并轉膜。加入一抗，4℃過夜，棄一抗，再加入辣根過氧化物酶標記的二抗于37℃條件下?lián)u床孵育2 h，化學發(fā)光系統(tǒng)成像拍照分析。

1.3.6 RT-PCR法檢測槲皮素對IL-6、IL-8及Caspase3的作用將不同實驗組處理的六孔板細胞接入相同MOI的EV71病毒，培養(yǎng)24 h后，棄去上清，以PBS洗細胞1次，每孔加入1 mL Trizol裂解，抽提細胞總RNA，并反轉錄為cDNA。PCR運行程序為：95℃4 min，94℃45 s，58℃45 s，72℃1 min，35個循環(huán)，72℃10 min。將PCR擴增產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，UVP凝膠成像系統(tǒng)拍照。引物系列見表1。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計學方法數(shù)據分析采用SPSS 17.0軟件包，計量資料以±s表示，采用t檢驗；計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 槲皮素體外抗病毒能力實驗

2.1.1 病毒毒力及槲皮素抑制病毒感染檢測RD細胞感染EV71病毒48 h后，鏡下觀察，病毒組細胞形態(tài)與正常對照組比較，細胞變圓、萎縮、脫落，細胞間連接斷裂甚或消失，出現(xiàn)細胞病變效應，進一步研究發(fā)現(xiàn)，相同MOI的EV71感染的RD細胞出現(xiàn)會明顯的CPE，而槲皮素處理（20μM）能夠明顯抑制病毒誘導的CPE，見圖1。

圖1 光學顯微鏡下各組細胞形態(tài)（x200）

2.1.2 病毒毒力及槲皮素細胞毒性試驗MTT法測定結果表明EV71對RD細胞的TCID50為10-4.5，槲皮素的細胞毒性效應通過細胞活力測定，結果表明，槲皮素對RD細胞具有較低的細胞毒性，MTT法檢測細胞活力，見圖2。并且在濃度達到100μM時未觀察到明顯的形態(tài)學細胞毒作用，50%細胞毒性濃度（CC50）值＞100μM，同時發(fā)現(xiàn)槲皮素在10～25μM之間均能夠有效抑制RD細胞感染EV71，在沒有槲皮素的情況下，相同MOI的EV71感染的RD細胞出現(xiàn)明顯的CPE，而槲皮素處理（12μM）能夠明顯抑制病毒誘導的CPE。

圖2 MTT法檢測不同處理組細胞活力

2.1.3 EV71病毒蛋白表達受槲皮素抑制情況將不同實驗組［RD細胞組、RD+EV71組、RD+EV71+槲皮素組（5μM）、RD+EV71+槲皮素（10μM）及RD+EV71+槲皮素（20μM）］，相同MOI病毒感染RD細胞，在槲皮素處理實驗組中，病毒蛋白表達量明顯低于其余組，并且槲皮素對于病毒抑制具有劑量依賴性，在20μM時EV71在細胞中的復制受到明顯抑制，見圖3。

圖3 Western blot檢測病毒VP1蛋白電泳圖

2.2 槲皮素抑制EV71機制研究

2.2.1 槲皮素對TLR-7（toll樣受體7）表達的影響針對上述不同實驗組，Western blot檢測TLR-7表達水平，結果發(fā)現(xiàn)，EV71病毒感染可明顯誘導TLR7蛋白表達，但槲皮素處理組不影響TLR7表達水平，見圖4。

圖4 槲皮素處理對TLR-7表達的影響

2.2.2 槲皮素處理對IL-6、IL-8及Caspase3的作用病毒產量及IL-6隨著槲皮素濃度的增加而下降，提示槲皮素能夠通過抑制TL-6誘導的細胞毒性效應，同時具有劑量依賴性，見圖5。EV71感染組Caspase-3表達明顯增高，而槲皮素處理組Caspase3表達水平受到抑制。

圖5 EV71感染后槲皮素對IL-6及IL-8表達的影響

3 討論

腸道病毒71型所致手足口病目前仍是世界各國，尤其是亞太地區(qū)的一個重要公共衛(wèi)生問題，目前尚無有效治療藥物［13-14］。作為黃酮類化合物的重要組成-槲皮素，目前已有大量相關文獻體外證實其具有顯著抗病毒活性。然而，更進一步針對其藥理特性及抗病毒機制的研究是非常必要的。本課題組體外實驗證實，槲皮素50%細胞毒性濃度（CC50）值＞100μM，EC50為15μM。這表明，治療劑量的槲皮素不會顯著抑制細胞生長，能有效抑制病毒感染，計算SI至少大于6，依據（SI）值≥4種被認為適用于抗病毒藥物［8］，表明槲皮素可以作為一種有效的抗EV71藥物，其在治療EV71感染方面具有潛在的應用價值。

先天免疫系統(tǒng)對病原微生物的快速識別及清除對于自身穩(wěn)態(tài)的維持至關重要，固有免疫細胞絕大多數(shù)是通過細胞表面或者不同細胞內隔間表達的模式識別受體識別病毒的感染，這些模式識別受體包括Retinoic acid-inducible gene I（RIGI）樣受體（RLRs），Toll樣受體（TLRs），以及NOD樣受體（NLRs）。TLR-7，該 基 因也被稱為PYPAF3、NALP7、PAN7、NOD12、CLR19.4和HYDM，在人類19號染色體長臂q13.42位置，TLR7不僅在腦內的主要免疫細胞小膠質細胞中表達，而且神經元中也有表達［15］。盡管TLR7和TLR8都能識別單鏈RNA（ssRNA），但多項研究證實，TLR7是大腦中識別ssRNA的主要TLR［16］。針對其功能研究發(fā)現(xiàn)，TLR7在中樞神經系統(tǒng)的神經紊亂和炎癥反應中起著多種作用，猴免疫缺陷病毒（SIV）感染恒河猴腦后，分泌的microRNA21激活TLR7通路，導致神經系統(tǒng)疾?。?7］；有學者研究發(fā)現(xiàn)，TLR7-MyD88-Caspase3軸在單鏈RNA病毒引起的神經系統(tǒng)炎癥病變中發(fā)揮重要作用［18］。動物實驗證實，TLR7-MyD88-c-Fos-IL-6信號通路能夠在腦內負向調控樹突狀細胞的生長［16］。值得關注的是，2019年有學者通過體內體外試驗提出，TLR7/IL-6/Caspase3凋亡軸在EV71感染發(fā)病機制中起重要作用［19］。

進一步研究發(fā)現(xiàn)，高水平的細胞因子，如IL-1、IL-6、IL-10等與肺水腫和神經系統(tǒng)損傷嚴重程度相關［20］。研究發(fā)現(xiàn)，IL-6是EV71相關性腦炎的獨立預測因子，在EV71感染的發(fā)病機制中起重要作用［21］。與此同時，另外一項針對新生小鼠模型的研究顯示，EV71感染后產生的持續(xù)高水平IL-6會導致嚴重的組織損傷，而在臨床癥狀出現(xiàn)后給予抗IL-6中和抗體，可以極大地改善宿主的生存率和臨床評分，因此，抗IL-6可作為EV71感染的潛在治療候選者［22］。此外，目前已有大量研究證實，EV71感染后通過非結構性蛋白3C激活caspase-3，由此誘導的宿主細胞凋亡在其發(fā)病機制中起重要作用［23］。2018年有學者發(fā)現(xiàn)，抑制caspase-3的活性可以減弱3C引起的細胞凋亡，同時降低EV71病毒蛋白的表達，提示抑制caspase-3可作為一種潛在治療手足口病的選擇靶點來考慮［24-25］。

2021年，一項系統(tǒng)評價研究認為，補充槲皮素及其衍生物可以減少促炎癥細胞因子、趨化因子、活性氧、黏液分泌等，可以作為治療病毒性下呼吸道感染的候選藥物［26］。此外，目前也有多篇文獻從機制方面探討槲皮素治療新冠肺炎的意義，例如有研究認為，槲皮素能夠抑制抑制3CLpro和PLpro的結合能分，槲皮素在理論上具有干擾SARS-CoV-2復制的能力［27］。針對EV71感染，研究認為，槲皮素能有效抑制EV71的3Cpro活性，從而阻斷EV71的復制［28］。但須明確的是，如果要將槲皮素作為抗病毒藥物使用，那更進一步地針對其藥理特性和臨床使用的研究是非常有必要的，且目前針對槲皮素體內研究尚處于初步階段，缺乏長期體內研究的臨床數(shù)據及相關部門的監(jiān)管，而詳細的藥代動力學，藥效學和長期毒理學研究亦是必要的。

本實驗發(fā)現(xiàn)，EV71體外感染RD細胞可上調TLR-7表達水平，而槲皮素可以顯著抑制IL-6及Caspase-3表達，體外實驗證實具有明顯的抗細胞凋亡作用，且細胞毒性較低，具有潛在的臨床應用前景，有望用于EV71感染引起的手足口病的治療。