“cell-in-cell”對胃癌細胞生物學行為的影響*

孫靜 閔婕 單宇鵬 雷鴿 張峰

(空軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院腫瘤內科，陜西 西安 710000)

統(tǒng)計顯示，每年新發(fā)胃癌和死于胃癌的患者分別約為100萬例和80萬例，占所有惡性腫瘤的5.7%和8.2%，發(fā)病率和死亡率均分別排名第六和第二[1]。但目前，胃癌發(fā)生和發(fā)展的機制則仍不清楚。在腫瘤細胞培養(yǎng)過程中，會發(fā)現(xiàn)一些帶有內部空泡和多個細胞核的大細胞，即一個細胞在另一個細胞內的情況，被稱為“cell-in-cell”結構[2-3]。免疫細胞與腫瘤細胞的“cell-in-cell”結構會提高腫瘤的惡性程度[4-5]，一項臨床研究顯示“cell-in-cell”結構與口腔舌癌的侵襲性特征和癌癥相關死亡率有關[6]。然而，關于“cell-in-cell”結構對胃癌的影響則仍不清楚，至今也鮮有研究報道。為此，本文就胃癌腫瘤細胞與免疫細胞“cell-in-cell”對腫瘤細胞生物學行為的影響進行研究，以期為胃癌的診斷和治療提供新的思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌細胞BGC823(ATCC，美國)；96孔、24孔組織培養(yǎng)板(康寧公司，美國)；RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司，美國)；BALB/c小鼠[SPF級，雄性，6～8周齡(20±2) g，浙江醫(yī)院實驗動物中心， SYXK(浙)2021-0017)]；免疫磁珠(Invitrogen公司，美國)；吉姆薩試劑(碧云天公司，中國)；凋亡試劑盒(Annexin V-FITC和PI)(耶森公司，中國)；流式細胞儀(Becton公司，美國)；基質膠和Transwell裝置(Corning公司，美國)。本次動物實驗符合3R原則，并且實驗方案經過空軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院動物倫理委員會的批準。

1.2 小鼠免疫細胞的分離 小鼠頸脫臼處死，在無菌的環(huán)境下收集得到脾臟中細胞懸液，通過密度梯度離心法分離單核淋巴細胞(PBMC)，使用免疫磁珠傳話PBMC。PBMC培養(yǎng)在RPMI 1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基含有10%的胎牛血清，將細胞在5%CO2培養(yǎng)箱中于37°C和95%濕度下培養(yǎng)。

1.3 胃癌細胞培養(yǎng)和“cell-in-cell”模型的建立 人胃癌細胞BGC823培養(yǎng)在DMEM完全基中，培養(yǎng)基含有10%的胎牛血清、0.1 mg / mL的鏈霉素和100 U/mL的青霉素。將細胞在5%CO2培養(yǎng)箱中于37°C和95%濕度下培養(yǎng)。根據(jù)參考文獻[7]構建腫瘤細胞與免疫細胞的“cell-in-cell”模型。按照靶效比1∶1和5∶1加入已標記的胃癌細胞分別為1∶1組和5∶1組，分別接種到24 孔板中，每孔細胞總數(shù)為5×104個。在上述條件下孵育6 h。然后BGC823細胞單獨培養(yǎng)作為對照。

1.4 檢測方法

1.4.1 “cell-in-cell”構建率 培養(yǎng)后細胞加入2.5%的戊二醛在4℃固定20 min，然后加入10%的吉姆薩試劑1在室溫下染色1 min；洗滌后加入10%的吉姆薩試劑2室溫下染色10 min。顯微鏡下觀察，隨機選擇5個高倍視野，“cell-in-cell”構建率=(“cell-in-cell”細胞數(shù)/總細胞數(shù))×100%。

1.4.2 CCK-8檢測細胞增殖活力 將100 μL的細胞懸浮液添加到96孔板的孔中，孵育24 h、48 h和72 h后，將體積為10 μL的CCK-8溶液添加到每個孔中并孵育2 h。在450 nm波長下，用酶標儀檢測每個孔的光密度(OD)值。

1.4.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 將細胞用1×PBS洗滌并懸浮在100 μL結合緩沖液中。加入5 μL的Annexin V-FITC和10 μL的PI(中國上海耶森)，在室溫下于黑暗中孵育10～15 min。最后，將400 μL的結合緩沖液添加到樣品中，并在1 h內通過流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.4.4 Transwell檢測侵襲 將基質膠(1∶8稀釋)加入Transwell裝置的上室并在 37℃下孵育 30 min。將 600 μL完全培養(yǎng)基填充到 24 孔板-Transwell 裝置的下室。將細胞在無血清培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng) 24 h進行饑餓處理。消化后，向水合的 Transwell 上室中加入 100 μL 細胞溶液(5×105個細胞/mL)。24 h后，洗去未侵入的細胞。滲入下室的細胞用95%乙醇固定，0.1%結晶紫室溫染色20 min。在×400倍視野中的5個隨機視野中計數(shù)細胞數(shù)。

2 結果

2.1 胃癌細胞與免疫細胞“cell-in-cell”形成情況 深紫紅色為細胞核，淺紫色為細胞質，黃色箭頭為形成的“cell-in-cell”結構，見圖1。1∶1組的“cell-in-cell”構建率為(8.65±1.06)%，5：1組的“cell-in-cell”構建率為(12.92±1.32)%，顯著高于1∶1組(P<0.05)。

圖1 胃癌細胞與免疫細胞“cell-in-cell”形成情況(400×)Figure 1 Gastric cancer cell and immune cell "cell-in-cell" formation

2.2 “cell-in-cell”形成對胃癌細胞增殖能力的影響 3組細胞的增殖能力比較差異顯著(P<0.05)。1∶1組的增殖能力顯著高于對照組(P<0.05)，5∶1組的增殖能力顯著高于1∶1組和對照組(P<0.05)。見表1。

表1 “cell-in-cell”形成對胃癌細胞增殖能力的影響Table 1 The effect of "cell-in-cell" formation on the proliferation of gastric cancer cells

2.3 “cell-in-cell”形成對胃癌細胞凋亡的影響 3組細胞的凋亡率比較差異顯著(P<0.05)。1∶1組的凋亡率(4.06±0.45)%顯著低于對照組(6.27±0.58)%(P<0.05)，5∶1組的凋亡率(2.95±0.34)%顯著低于1∶1組和對照組(P<0.05)。見圖2。

圖2 流式細胞術檢測“cell-in-cell”形成對胃癌細胞凋亡的影響Figure 2 Flow cytometry detects the influence of "cell-in-cell" formation on the apoptosis of gastric cancer cells

2.4 “cell-in-cell”形成對胃癌細胞侵襲的影響 3組細胞的侵襲能力比較差異顯著(P<0.05)。1：1組的侵襲能力顯著高于對照組(P<0.05)，5∶1組的侵襲能力顯著高于1∶1組和對照組(P<0.05)。圖3、表2。

圖3 Transwell檢測“cell-in-cell”形成對胃癌細胞侵襲的影響Figure 3 Transwell detects the influence of "cell-in-cell" formation on gastric cancer cell invasion

表2 “cell-in-cell”形成對胃癌細胞侵襲的影響(個，Table 2 The influence of "cell-in-cell" formation on the invasion of gastric cancer cells

3 討論

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，大部分患者在確診時已處于中晚期，這使得死亡率大幅升高[8-10]。胃癌的復發(fā)和轉移是導致治療失敗的主要原因[11-13]，尋找胃癌細胞增殖和侵襲的機制具有重要的臨床意義。

研究顯示免疫抑制在腫瘤的發(fā)生和進展中起著重要的作用，一方面，腫瘤細胞表面會產生包括PD-L1等免疫抑制的蛋白，并直接與免疫細胞表面的受體結合導致免疫細胞的功能抑制或者凋亡[14-17]；另一方面，腫瘤細胞也會分泌免疫抑制因子，從而來降低機體的識別和清除腫瘤細胞的能力[18-20]。免疫細胞與腫瘤細胞的“cell-in-cell”結構是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的細胞現(xiàn)象，即一個活細胞侵入另一個活細胞[21-22]。近年來研究顯示，免疫細胞與腫瘤細胞也可形成“cell-in-cell”結構，并且與腫瘤免疫相關，如Wang等[23]的研究顯示結腸癌細胞可以內化淋巴細胞，并且這種免疫細胞與結腸癌細胞形成的“cell-in-cell”結構有助于逃避宿主免疫防御。也有研究顯示在乳腺癌組織中發(fā)現(xiàn)了“cell-in-cell”結構，并且臨床研究結果顯示“cell-in-cell”結構的增多與乳腺癌患者不良預后有關[24]。為分析胃癌細胞與免疫細胞是否可以形成“cell-in-cell”結構，本研究從小鼠脾臟中收集了PBMC，并分別按照PBMC：胃癌細胞比例為1∶1和5∶1的比例混合接種，通過顯微鏡觀察，可清晰的觀察到細胞的內化結果，其中5∶1組的“cell-in-cell”構建率顯著高于1∶1組。本次研究成功的構建了胃癌細胞與免疫細胞的“cell-in-cell”模型。

為在細胞水平上分析“cell-in-cell”對胃癌細胞生物學行為的影響，本研究分別檢測了各組細胞的增殖、凋亡和侵襲情況。結果顯示“cell-in-cell”的形成能夠顯著的促進胃癌細胞的增殖和侵襲能力，并且抑制凋亡。此外，隨著“cell-in-cell”比例的升高，細胞的增殖和侵襲能力被進一步促進，且凋亡率也被進一步抑制。研究顯示“cell-in-cell”的形成能夠促進頭頸部鱗狀細胞癌細胞的增殖并抑制凋亡[25]。Miyatake等[26]的研究也顯示“cell-in-cell”的形成會促進胰腺導管腺癌細胞的侵襲能力。結合過往文獻報道和本次研究結果，提示免疫細胞與胃癌細胞形成的“cell-in-cell”會促進胃癌細胞的惡性生物學行為，促進胃癌細胞的增殖和侵襲，并抑制凋亡。

然而，本研究也存在不足之處，首先，關于“cell-in-cell”結構對胃癌細胞的生物學行為的而影響和對機體免疫的影響仍需要體內研究證實?！癱ell-in-cell”結構在胃癌組織中的形成情況、與臨床病理數(shù)據(jù)的關系和與患者預后的關系則仍需要進一步的臨床研究。此外，“cell-in-cell”形成的分子機制和調控胃癌細胞生物學行為的分子機制也值得深入研究。

4 結論

胃癌細胞與免疫細胞形成的“cell-in-cell”結構不但會提高胃癌細胞的增殖和侵襲能力，還會顯著抑制細胞凋亡。此外，PBMC的比例升高會提高“cell-in-cell”的形成率，并更顯著地促進胃癌細胞的增殖和侵襲。本研究揭示了一種胃癌進展的新機制，提示cell-in-cell”可能成為診斷和治療胃癌的新方向。