LncRNA HEIH 對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力的影響及機(jī)制

田少輝 張學(xué)浩 徐江龍 喬曉霞 張雨豪 徐燦 李春暉

(河北大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 保定 071000)

膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤,由于腫瘤細(xì)胞高度的侵襲性,患者死亡率居高不下。因此，探討和揭示調(diào)控膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵基因和信號(hào)分子對(duì)于提高患者預(yù)后意義重大。隨著高通量RNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，RNA測(cè)序提示70%～90%的人類基因組被轉(zhuǎn)錄成RNA，而其中約68%的轉(zhuǎn)錄子為不能編碼蛋白質(zhì)的非編碼RNA〔1,2〕。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)是一類長(zhǎng)度不小于200 nt的非編碼RNA，能夠以“分子海綿”的形式吸附miRNA影響其對(duì)下游靶基因的調(diào)節(jié)作用,或通過(guò)與蛋白質(zhì)結(jié)合參與蛋白質(zhì)相互作用〔3,4〕。有研究報(bào)道LncRNA在多種病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用〔5,6〕。LncRNA在多種腫瘤中異常表達(dá)，并且參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移〔7～9〕。研究表明LncRNA HEIH在肝癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移〔10〕。在結(jié)直腸癌中LncRNA HEIH高表達(dá)，通過(guò)與miR-939相互作用，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，抑制其凋亡〔11〕。另有證據(jù)顯示LncRNA HEIH促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移〔12〕。LncRNA HEIH是一類促進(jìn)腫瘤生成和進(jìn)展的基因。研究表明多種LncRNA在膠質(zhì)瘤組織中異常表達(dá)影響膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展〔13〕。然而，目前尚不清楚LncRNA HEIH對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞表型和功能的影響及相關(guān)的調(diào)控機(jī)制。本研究旨在闡明LncRNA HEIH在膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用和調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1膠質(zhì)瘤組織細(xì)胞系 21例人腦膠質(zhì)瘤組織取自河北大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，以16例同期手術(shù)的腦膜瘤樣本作為陰性對(duì)照。取材前患者均已簽署知情同意書(shū)，并經(jīng)河北大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2材料 DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、TRIzol試劑盒、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒購(gòu)自Takara公司；雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega 公司；Transwell 小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司；E盒結(jié)合鋅指蛋白(ZEB)1抗體和GAPDH抗體購(gòu)自Abcam公司；RIPA裂解液和BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)。U251細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，放在37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

LncRNA HEIH siRNA及對(duì)照siRNA、miR-194-5p模擬物(mimics)及無(wú)異序列陰性對(duì)照、pmirGLO-HEIH-Wt野生型載體、pmirGLO-HEIH-Mut突變型載體(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)分別用脂質(zhì)體介導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251細(xì)胞中，具體方法按照LipfectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)染48 h后，qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。

1.4qRT-PCR 采用Trizol試劑按其說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，按照TakaRa公司qRT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。在ABI7500熒光PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR測(cè)定LncRNA HEIH、miR-194-5p的相對(duì)表達(dá)水平。LncRNA HEIH上游引物:5′-CCTCTTGTGCCCCTTTCT-3′，下游:5′-AGGTCTCATGGCTTCTCG-3′；miR-194-5p，上游引物：5′-ATGGACCTGGGGCCAGCGAAG-3′,下游:5′-TCTGGCCTGGGAGCGTCG-3′；ZEB1上游引物：5′-TTCGGAAAGAGCTGTTCGCT-3′，下游:5′-TGCAGCGATCAAGAACCTCT-3′；GAPDH上游引物：5′-CCTGACCTGCGTGTGGACT-3′,下游:5′-GCTGTGGATGGGGAGGTGTC-3；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCCACA-3′，下游:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。以U6或GAPDH為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法分別計(jì)算LncRNA HEIH、miR-194-5p和ZEB1的相對(duì)表達(dá)量。

1.5細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 將20 μl基質(zhì)膠均勻涂在Transwell小室內(nèi)面，使基質(zhì)膠凝固。向24孔板中加入600 μl含有10%血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，孔內(nèi)放置Transwell(8 μm)小室。向小室內(nèi)加入轉(zhuǎn)染si-LncRNA HEIH(si-HEIH組)或?qū)φ誷iRNA(si-Ctrl組)的U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞(2.5×104個(gè))，放入37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后取出小室，用棉簽將上室內(nèi)面沒(méi)有侵襲過(guò)去的細(xì)胞去掉，4%多聚甲醛固定30 min，晾干后用結(jié)晶紫染色液染色30 min。磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，擦去上層細(xì)胞，在顯微鏡下拍照。每個(gè)孔隨機(jī)選擇5個(gè)視野拍照，計(jì)數(shù)每張相片細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均數(shù)進(jìn)行比較。

1.6生物信息學(xué)分析 利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)Starbase(http://starbase.sysu.edu.cn/)，TargetScan(http://www.targetscan.org)預(yù)測(cè)LncRNA HEIH 和miR-194-5p的靶基因。

1.7雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn) 胰酶消化收取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251細(xì)胞，接種于不含雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)液6孔板中。分組如下：pmir-GLO-HEIH-Wt+miR-194-5p mimics組、pmiR-GLO-HEIH-Wt+mimics組、pmiR-GLO-HEIH-Mut+miR-194-5p mimics組、pmiR-GLO-HEIH-Mut+mimics組，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔,混合均勻后按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，24 h后按照雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.8Western印跡 按照每1.0×106個(gè)U251細(xì)胞加入100 μl RIPA蛋白裂解液，混勻后置冰上30 min，4℃ 14 000 r/min離心30 min。上清轉(zhuǎn)入潔凈EP管，采用BCA蛋白定量分析檢測(cè)蛋白含量。將轉(zhuǎn)有蛋白的聚偏氟乙烯(PVDF)膜置于5%脫脂奶粉-TBST室溫中振蕩封閉1 h，然后置于1∶2 000稀釋的,兔抗人ZEB1抗體(ab203829，Abcam)中4℃孵育過(guò)夜；第2天室溫用1×TBST洗滌PVDF膜，將膜置于適當(dāng)稀釋的含辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗的1×TBST中，室溫孵育1 h；用1×TBST洗滌后，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光操作，伯樂(lè)公司Chemic Doc XRS系統(tǒng)曝光，顯影。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1LncRNA HEIH在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)且影響U251細(xì)胞侵襲 與正常星形膠質(zhì)細(xì)胞(1.00±0.08)比較，膠質(zhì)瘤細(xì)胞 U-251中 LncRNA HEIH表達(dá)明顯升高(2.53±0.36，P<0.01)。轉(zhuǎn)染si-HEIH后U251細(xì)胞LncRNA HEIH表達(dá)顯著降低 (1.00±0.11 vs 0.34±0.03，P<0.01)。與si-Ctrl組相比，si-HEIH組U251細(xì)胞侵襲能力顯著降低〔(101.57±11.43) vs (53.56±5.35)個(gè)，P<0.01，n=9〕，見(jiàn)圖1。

圖1 沉默LncRNA HEIH抑制U251細(xì)胞侵襲 (結(jié)晶紫染色，×200)

2.2miR-194-5p是LncRNA HEIH靶基因 利用Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)LncRNA HEIH靶基因發(fā)現(xiàn)，miR-194-5p與LncRNA HEIH有結(jié)合位點(diǎn)(圖2)。雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)結(jié)果顯示，與miR-NC+HEIH-Wt組相比，miR-194-5p+HEIH-Wt組細(xì)胞熒 光 素 酶 相 對(duì)活性顯著降低(1.00±0.07 vs 0.34±0.03,P<0.01)，而miR-NC+HEIH-Mut組和miR-194-5p+HEIH-Mut組細(xì)胞熒光素酶相對(duì)活性無(wú)明顯差異(0.99±0.06 vs 0.99±0.06,P>0. 05)。與si-Ctrl組相比，si-HEIH組miR-194-5p表達(dá)顯著升高(1.00±0.09 vs 3.04±0.23,P<0. 01)。pcDNA-HEIH組U251細(xì)胞中miR-194-5p的表達(dá)水平顯著低于 pcDNA組( 0.34±0.03 vs 1.00±0.05,P<0.05)。

圖2 Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)LncHEIH與miR-194-5p結(jié)合位點(diǎn)

2.3miR-194-5p抑制U251細(xì)胞ZEB1表達(dá)和侵襲 Targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-194-5p與ZEB1有靶向結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖3。與miR-NC組(1.00±0.05 )相比，miR-194-5p組U251細(xì)胞ZEB1的表達(dá)水平顯著降低(0.25±0.03，P<0.01)，見(jiàn)圖4。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與miR-NC組〔(99.52±9.27)個(gè)〕相比，miR-194-5p組U251細(xì)胞侵襲數(shù)量顯著減少〔(45.61±6.05)個(gè)，P<0.01〕，見(jiàn)圖5。

圖3 Targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)mir-194-5p與ZEB1的結(jié)合位點(diǎn)；qRT-PCR

圖4 Western印跡

圖5 檢測(cè)mir-194-5p對(duì)ZEB1表達(dá)的影響(結(jié)晶紫染色，×200)

2.4miR-194-5p部分逆轉(zhuǎn)LncRNA HEIH對(duì)ZEB1表達(dá)和侵襲能力的影響 與pcDNA-HEIH+miR-NC組相比，pcDNA-HEIH+miR-194-5p組U251細(xì)胞ZEB1表達(dá)和侵襲數(shù)量顯著降低(P<0.01)，見(jiàn)圖6、7，表1。

圖6 各組U251細(xì)胞侵襲能力(結(jié)晶紫染色，×200)

1～3:pcDNA+miR-NC組，pcDNA-HEIH+miR-NC組，pcDNA-HEIH+miR-194-5p組圖7 miR-194-5p逆轉(zhuǎn)LncHEIH對(duì)ZEB1表達(dá)

表1 過(guò)表達(dá)miR-194-5p逆轉(zhuǎn)LncRNA HEIH對(duì)U251細(xì)胞ZEB1表達(dá)和侵襲能力的影響

2.5敲減ZEB1能逆轉(zhuǎn)LncHEIH對(duì)U-251細(xì)胞侵襲的影響 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，pcDNA+si-Ctrl組細(xì)胞侵襲數(shù)量為(96.43±6.34)個(gè)。pcDNA-HEIH+si-ZEB1組〔(97.34±5.23 )個(gè)〕U251細(xì)胞侵襲能力顯著低于pcDNA-HEIH+si-Ctrl組〔(159.78±12.34)個(gè)，P<0.01〕，見(jiàn)圖8。

圖8 si-ZEB1逆轉(zhuǎn)LncHEIH對(duì)U251細(xì)胞侵襲能力的影響(結(jié)晶紫染色，×200)

3 討 論

膠質(zhì)瘤是常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，目前對(duì)于膠質(zhì)瘤的治療方法包括手術(shù)治療、化療、放療、生物治療等。由于腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，膠質(zhì)瘤患者生存期很短預(yù)后較差。LncRNA在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用〔14〕。Dai等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)LncRNA ANRIL通過(guò)MAPK信號(hào)通路促進(jìn)膠質(zhì)瘤發(fā)生。Liu等〔16〕報(bào)道LINC00909通過(guò)調(diào)控miR-194/MUC1-C軸促進(jìn)膠質(zhì)瘤進(jìn)展。本研究表明LncRNA HEIH 在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中高表達(dá)，進(jìn)一步在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)LncRNA HEIH增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251侵襲能力，從而證實(shí)LncRNA HEIH是一種促膠質(zhì)瘤LncRNA。miRNA是一種短鏈非編碼RNA分子，在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮調(diào)控作用。有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-194調(diào)控腫瘤發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)miR-194通過(guò)調(diào)控BMP1和 p27 kip1表達(dá)抑制非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移〔17〕。miR-194通過(guò)靶向抑制BMI1抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞間質(zhì)-上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化〔18〕。近年來(lái)，有研究顯示，LncRNA可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA途徑，與其他RNA 轉(zhuǎn)錄本競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合相同的miRNA，從而調(diào)控miRNA靶基因的表達(dá)。研究表明miR-194在膠質(zhì)瘤中低表達(dá)是LINC00909促進(jìn)膠質(zhì)瘤增殖侵襲作用的靶分子〔16〕。本研究結(jié)果提示在膠質(zhì)瘤中，LncRNA HEIH可能通過(guò)分子海綿吸附miR-194-5p發(fā)揮促癌基因的作用。ZEB1可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT，增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能。有研究表明LncRNA-MALAT1可爭(zhēng)性結(jié)合miR-200a，上調(diào)EC-109細(xì)胞中ZEB1、ZEB2的表達(dá)，促進(jìn)食管癌的侵襲和轉(zhuǎn)移〔19〕。本研究用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-194-5p可能與ZEB1互相結(jié)合而調(diào)控ZEB1的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251侵襲。

綜上所述，LncRNA HEIH通過(guò)發(fā)揮ceRNA作用，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-194-5p上調(diào)ZEB1表達(dá)而促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲。在本研究中，只是用Targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)ZEB1是miR-194-5p的靶分子，沒(méi)有進(jìn)一步用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-194-5p與ZEB1直接相互結(jié)合。本實(shí)驗(yàn)沒(méi)有在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證LncRNA HEIH對(duì)膠質(zhì)瘤侵襲轉(zhuǎn)移的影響，這是本研究的局限性。本研究進(jìn)一步完善了LncRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中生物學(xué)功能和調(diào)控機(jī)制，為膠質(zhì)瘤診斷治療提供新的理論依據(jù)。