正交試驗(yàn)法提取益腎止暈丸有效成分的分析

張 瑋

（河南省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，鄭州 450004）

益腎止暈丸為河南省中醫(yī)藥研究院醫(yī)院院內(nèi)協(xié)定方，由淫羊藿、巴戟天、杜仲、當(dāng)歸、黃柏、知母、女貞子、墨旱蓮、白芍、炒酸棗仁等多味中藥材組成，具有補(bǔ)腎益陰、消眩止暈之功效，臨床主要用于陰陽(yáng)兩虛所致頭暈、頭痛、體倦乏力、腰膝酸軟等癥，也可用于高血壓、圍絕經(jīng)期綜合征見上述癥狀者。為方便患者臨床應(yīng)用，現(xiàn)將劑型選定為濃縮丸劑，對(duì)淫羊藿、巴戟天、黃柏、知母、墨旱蓮、杜仲6 味藥物進(jìn)行煎煮提取，其余藥味采用粉碎后入藥，提高用藥效率。淫羊藿為方中重要藥物，具有滋陰補(bǔ)陽(yáng)之功效，其主要含有為淫羊藿甙（Icariin）、淫羊藿次甙（Icariside）、去氧甲基淫羊藿甙（des-O-Methylicariin）、β-去水淫羊藿素（β-anhy -Droicaritin）、淫羊藿糖甙（Epimedoside）等黃酮類成分，此外還含有木脂素、生物堿等多種化合物[1-3]?，F(xiàn)代研究表明，淫羊藿中的主要化學(xué)成分淫羊藿苷具有廣泛的生物活性，具有保護(hù)心腦血管系統(tǒng)、促進(jìn)造骨細(xì)胞的增殖和發(fā)育、調(diào)節(jié)免疫和抗腫瘤等多種重要的藥理作用，具有較高的藥用價(jià)值[4-7]。此外，淫羊藿苷具有良好的水溶性，可以作為益腎止暈丸煎煮液的標(biāo)志物，故本研究采用正交試驗(yàn)法，選取淫羊藿苷為觀測(cè)指標(biāo)，采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定，優(yōu)選煎煮提取工藝，為其臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

LIBROR-160DPT 萬(wàn)分之一分析天平（日本島津公司）；Waters 高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）；AE240 十萬(wàn)分之一分析天平（瑞士METTLER 公司）；GT-350W 超聲波提取器（濟(jì)寧科技超聲電子有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市英峪儀器廠）；恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；DLSB低溫冷卻循環(huán)泵（鄭州凱鵬實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。當(dāng)歸、女貞子、炒酸棗仁、白芍、淫羊藿、巴戟天、黃柏、知母、墨旱蓮、杜仲（亳州市康博中藥飲片有限公司提供）。淫羊藿苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院）。色譜用甲醇、乙腈（德國(guó)Merck 公司）；重蒸水；分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交試驗(yàn) 采用正交試驗(yàn)法對(duì)提取的主要影響因素和水平進(jìn)行篩選，考察因素提取次數(shù)（A）、提取時(shí)間（B）、加水量（C）、空白（D），見表1。

2.2 煎煮提取正交試驗(yàn)安排和儲(chǔ)備液的制備 按正交試驗(yàn)表安排各試驗(yàn)。稱取當(dāng)歸、女貞子、炒酸棗仁、白芍、淫羊藿、巴戟天、黃柏、知母、墨旱蓮、杜仲，共9 份，按表1 因素水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將上述1～9 號(hào)提取液濃縮至1 000 mL，移至量瓶中搖勻，作儲(chǔ)備液。

2.3 儲(chǔ)備液中淫羊藿苷的含量測(cè)定 參照高效液相色譜法[8]。色譜條件 填充劑：十八硅烷鍵合硅膠；流動(dòng)相:乙腈-水（30:70）；淫羊藿苷檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm。柱溫：35 ℃；流速：1 mL/min。

對(duì)照品溶液：取淫羊藿苷對(duì)照品，加入甲醇，制成含淫羊藿苷32 μg/mL 溶液，搖勻。

供試品溶液：精密量取上述正交試驗(yàn)貯備溶液各10 mL，置入量瓶，加乙醇稀釋至25 mL，靜置至室溫，再次加乙醇稀釋至25 mL，搖勻，超聲處理20 min，濾過。測(cè)定法：精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀。

2.4 供試品溶液中淫羊藿苷含量測(cè)定方法學(xué)[9-12]

2.4.1 陰性對(duì)照試驗(yàn) 根據(jù)上述色譜條件，將淫羊藿苷對(duì)照品溶液、不含淫羊藿的陰性對(duì)照溶液、正交試驗(yàn)供試品溶液分別注入液相色譜儀。在與淫羊藿苷對(duì)照品溶液色譜圖相應(yīng)保留時(shí)間處，供試品溶液色譜有相應(yīng)吸收峰出現(xiàn)，分離良好；陰性對(duì)照溶液色譜無相應(yīng)吸收峰出現(xiàn)。見圖1、圖2 和圖3。

圖1 淫羊藿苷對(duì)照品色譜圖

圖2 供試品溶液色譜圖

圖3 不含淫羊藿陰性對(duì)照溶液色譜圖

2.4.2 線性關(guān)系 稱取淫羊藿苷對(duì)照品，加入甲醇，制成含淫羊藿苷0.032 mg/mL 的溶液為對(duì)照品溶液。分別吸取對(duì)照品溶液2、4、6、8、10、20 μL，注入液相色譜儀測(cè)定峰面積，橫坐標(biāo)：淫羊藿苷進(jìn)樣量（μg），縱坐標(biāo)：峰面積積分值，計(jì)算回歸方程，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，淫羊藿苷進(jìn)樣量0.064～0.640 μg，進(jìn)樣量（X）與峰面積（Y）成線性關(guān)系，回歸方程：Y=2.32×106X-2.21×104，r=0.999 5。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 吸取3 號(hào)正交試驗(yàn)儲(chǔ)備液，依法制備供試品溶液，分別在制備后0、1、3、6、8、12 h 測(cè)定淫羊藿苷的含量，結(jié)果平均峰面積為717 138，RSD為1.12%，提示淫羊藿苷在于12 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.4 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，進(jìn)樣6 次，測(cè)定峰面積，平均峰面積714 210，RSD=1.03%，結(jié)果表明儀器精密度較好。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 吸取3 號(hào)正交試驗(yàn)儲(chǔ)備液，平行制備供試品溶液5 份，依法測(cè)定，淫羊藿苷平均含量0.078 58 mg/m，RSD=0.95%。

2.4.6 回收率試驗(yàn) 量取3 號(hào)正交試驗(yàn)貯備液（淫羊藿苷含量0.078 58 mg/mL）6 份，每份5 mL，再準(zhǔn)確加入5 mL濃度為0.09 mg/mL的淫羊藿苷對(duì)照品溶液，制成加樣回收供試品溶液，測(cè)定淫羊藿苷含量，計(jì)算回收率，平均回收率99.5%，RSD=1.04%，結(jié)果見表2。

表2 回收率結(jié)果

2.4.7 正交試驗(yàn)含量測(cè)定 按照上述供試品溶液的測(cè)定方法，制備1～9 號(hào)正交試驗(yàn)供試品溶液，依法測(cè)定淫羊藿苷的含量，進(jìn)行正交試驗(yàn)結(jié)果分析，見表3。

表3 水提取正交試驗(yàn)結(jié)果

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

2.5.1 直觀分析 根據(jù)各因素3 個(gè)水平的平均值，以淫羊藿苷為指標(biāo)，選擇A1、B3、C3。

2.5.2 煎煮提取正交試驗(yàn)方差分析 見表4。

表4 煎煮提取正交試驗(yàn)方差分析

根據(jù)方差分析結(jié)果，以淫羊藿苷為指標(biāo)，提取次數(shù)影響顯著，其余因素不顯著，選擇A1；B 因素影響不顯著，B2、B3 相差不大，從節(jié)能、降費(fèi)、減排考慮，選擇B2；C 因素影響不顯著，但有一定的趨勢(shì)，因此選擇C3。綜上所述，選擇A1、B2、C3。即水提取正交試驗(yàn)最佳提取工藝為：加水10倍量，提取3次，每次1.5 h。

2.6 煎煮提取工藝延長(zhǎng)試驗(yàn) 上述正交試驗(yàn)的提取次數(shù)為正交水平最大值，因此需要進(jìn)行3 次和4 次的最佳工藝比較試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果顯示提取4 次和3 次的結(jié)果基本一致。從節(jié)能、降耗考慮，故選擇3 次。

2.7 煎煮提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 按上述最佳煎煮提取工藝，進(jìn)行水提取工藝3 次驗(yàn)證試驗(yàn)。稱取處方量，加水10 倍量，加水煎煮3 次，每次1.5 h，合并上述煎煮液，濾過，各濃縮至1 000 mL，按上述方法測(cè)定淫羊藿苷的含量，并計(jì)算淫羊藿苷的提取率和轉(zhuǎn)移率，見表5。

表5 水提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 mg

3 小結(jié)

淫羊藿具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的功效，是多種中藥方劑的常用藥。近年來，隨著現(xiàn)代提取技術(shù)與中醫(yī)藥的結(jié)合，關(guān)于中藥有效成分的研究成為關(guān)注重點(diǎn)。淫羊藿苷作為淫羊藿的主要化學(xué)成分，具有廣泛的生物活性，如抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗腫瘤、抗抑郁等，是目前研究熱點(diǎn)中藥材之一。以往研究顯示，淫羊藿苷通過調(diào)控細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，具有靶向治療的作用，在神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等多種疾病中具有調(diào)節(jié)神經(jīng)功能、保護(hù)心血管、調(diào)節(jié)免疫功能、改善性功能等多種作用，具有廣闊的應(yīng)用前景。但我們發(fā)現(xiàn)，中藥有效成分的提取尤其是復(fù)方制劑中單一藥材有效成分的提取一直是研究難點(diǎn)，探究高效的提取工藝是開發(fā)和應(yīng)用中藥材的重要手段。

目前，關(guān)于淫羊藿苷的提取方法研究較多，常用的包括傳統(tǒng)的水提取、醇提取及新興的微波法、高壓法、超聲法、減壓回流法、超臨界二氧化碳法等。各提取方法各具優(yōu)缺點(diǎn)，如水提取污染小、成本低，但耗時(shí)較長(zhǎng)；醇提取可以縮短提取時(shí)間，但成本較高；超聲法提取率高，污染小，但耗能高、成本高。由此可見，單一提取方法并不完全是用于淫羊藿的開發(fā)與應(yīng)用，將多種方法結(jié)合應(yīng)用于淫羊藿的提取已經(jīng)逐漸取代單一方法，是中藥有效成分提取的新興技術(shù)。

本研究采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，該方法是研究多因素、多水平的常用試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，采用多指標(biāo)并經(jīng)正交試驗(yàn)綜合平衡后所得的工藝條件，根據(jù)需要兼顧到各指標(biāo)的理化性質(zhì)，從全面試驗(yàn)中挑選具有代表性的點(diǎn)，是一種高效、快速、經(jīng)濟(jì)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，符合益腎止暈丸的作用特點(diǎn)。以往研究顯示，采用正交試驗(yàn)法提取復(fù)方淫羊藿咀嚼片中淫羊藿苷時(shí)，提取工藝穩(wěn)定、可靠，是開發(fā)利用淫羊藿有效成分的試驗(yàn)基礎(chǔ)，進(jìn)一步佐證了本次試驗(yàn)方法取得的結(jié)果可靠程度較高。HPLC 法是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的，以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液，將不同極性的單一溶液或不同比例的混合溶液、緩沖液等裝入固定色譜柱，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析，可根據(jù)待分析混合樣品中各組分在色譜柱中分配系數(shù)不同，達(dá)到分離目的，具有高壓、高效、高靈敏度、應(yīng)用范圍廣、分析速度快、載液流速快的三高一廣一快的特點(diǎn)，符合本次試驗(yàn)的目的，以往研究也佐證該方法用于測(cè)定復(fù)方中淫羊藿苷的含量結(jié)果準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性良好，可用復(fù)方制劑的質(zhì)量控制。

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，提取次數(shù)對(duì)淫羊藿苷的影響并不顯著，水提取可作為正交試驗(yàn)的最佳提取方式，煎煮4 次與煎煮3 次結(jié)果并無顯著差異，3 次試驗(yàn)的提取量及提取率與正交試驗(yàn)結(jié)果比較均一致，淫羊藿苷的轉(zhuǎn)移率為90%左右，綜合能源、經(jīng)費(fèi)、時(shí)間等因素，故所選煎煮提取工藝條件穩(wěn)定、可行，加水10 倍量，加水煎煮 3 次，每次1.5 h，是益腎止暈丸的最佳煎煮提取工藝。經(jīng)工藝驗(yàn)證，本研究所制定的制備工藝適合工業(yè)化生產(chǎn)，工藝穩(wěn)定性較好。