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    左旋咪唑?qū)θ崮郯蓝蛳x活疫苗免疫增強(qiáng)效果的評(píng)價(jià)

    2022-09-23 06:39:16余水蘭趙其平朱順海韓紅玉梁珊珊王青杰王海霞
    關(guān)鍵詞:免疫增強(qiáng)艾美耳佐劑

    余水蘭,趙其平,朱順海,黃 兵,韓紅玉,于 鈺,2,梁珊珊,2,王青杰,王海霞,董 輝

    (1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200241;2.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,上海 200234)

    球蟲病是一種由艾美耳球蟲(Eimeriaspp.)寄生在腸道所引起的傳染性疾病,嚴(yán)重?fù)p害全球養(yǎng)雞業(yè)的經(jīng)濟(jì)利益[1-2]??骨蛳x藥物的使用是當(dāng)前球蟲病的防治主要途徑之一[3-4]。但由于球蟲耐藥性的產(chǎn)生以及人們對(duì)藥物殘留和環(huán)境保護(hù)等公共衛(wèi)生安全問題的日益關(guān)注,迫切需要免疫預(yù)防替代藥物成為球蟲病控制的主導(dǎo)途徑[5]。實(shí)踐證明,球蟲卵囊具有良好的免疫原性,能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)[6],可制成活疫苗免疫預(yù)防球蟲病,減少死亡率[7]。目前,由早熟株卵囊組成的減毒活疫苗是應(yīng)用最廣泛的球蟲病疫苗[8]。但球蟲病活疫苗也存在明顯的不足:活疫苗通常接種3~7日齡雛雞,依靠產(chǎn)生的卵囊后代經(jīng)2~3次重復(fù)感染而獲得良好的免疫力,在此過程中雞可能會(huì)出現(xiàn)生長減緩、增重減少等不良反應(yīng),影響生產(chǎn)性能[9]。而已有研究發(fā)現(xiàn)免疫增強(qiáng)劑與球蟲活疫苗聯(lián)用不但可以增強(qiáng)雛雞的免疫效果,同時(shí)也可以降低接種疫苗帶來的不良影響[10-11]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,通過口服或腹腔注射左旋咪唑均可明顯增強(qiáng)雞球蟲疫苗的免疫效果[10-12]。然而已有的研究中左旋咪唑的使用方法較為復(fù)雜或使用周期長,成本較高。本文擬研究單次口服化學(xué)合成小分子免疫增強(qiáng)劑——左旋咪唑(Levamisole)對(duì)柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)免疫增強(qiáng)效果和免疫雞增重的影響,為評(píng)估左旋咪唑作為球蟲病活疫苗的免疫增強(qiáng)劑提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)試劑和蟲株 鹽酸左旋咪唑(Levamisole hydrochloride)由南京鯨輪制藥有限公司惠贈(zèng),規(guī)格:25 kg/桶,產(chǎn)品批號(hào):LV19007。分別按照每公斤體重1、2、4 mg鹽酸左旋咪唑來設(shè)置低、中、高三個(gè)劑量組,按3日齡雛雞體重約為50 g計(jì)算,低、中、高劑量分別為每只雞0.05、0.1 mg和0.2 mg。稱取適量鹽酸左旋咪唑樣品溶于水中,制成濃度分別0.1、0.20、0.40 mg/mL,每只雞經(jīng)口灌服0.5 mL。

    免疫用蟲株為柔嫩艾美耳球蟲上海株早熟系,攻蟲用蟲株為柔嫩艾美耳球蟲上海株,均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究動(dòng)物原蟲創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)保存。所用卵囊的保存期不長于3個(gè)月。

    1.2 籠養(yǎng)試驗(yàn)評(píng)價(jià)左旋咪唑的效果

    1.2.1 試驗(yàn)方法 選取60只體重相近的3日齡三黃雞,隨機(jī)均分為6組,飼養(yǎng)于單獨(dú)的籠子內(nèi),其中第1、2、3組每只雞分別先經(jīng)口灌服0.05、0.10、0.20 mg的鹽酸左旋咪唑,再接種1000個(gè)柔嫩艾美耳球蟲早熟株卵囊;第4組每只雞接種1000個(gè)柔嫩艾美耳球蟲早熟株卵囊(無佐劑免疫組);第5、6組為不免疫組。10日齡第1~4組進(jìn)行第二次免疫,每只雞接種1000個(gè)柔嫩艾美耳球蟲早熟株卵囊。二免后7 d,除了第6組(健康組)之外,其余各組每只雞灌服5×104個(gè)柔嫩艾美耳球蟲上海株(強(qiáng)毒株)卵囊。攻蟲后7 d,稱重、剖殺。

    1.2.2 主要觀測(cè)指標(biāo) 包括:①臨床癥狀:記錄試驗(yàn)期間各組雞的血便、死亡情況。②體重:一免疫后7 d、二免后7 d以及攻蟲后7 d分別對(duì)所有的雞進(jìn)行稱重,算出各組免疫期間的體重和攻蟲期間增重。③卵囊產(chǎn)量:攻蟲后第6~7 d,收集各組糞便,進(jìn)行卵囊OPG計(jì)數(shù),算出各組平均每只雞的卵囊產(chǎn)量。④腸道病變記分:攻蟲后7 d,取各組盲腸,參照J(rèn)ohnson等[13]的方法進(jìn)行病變記分。⑤抗球蟲指數(shù)(Anticoccidial index, ACI):根據(jù)公式ACI=(相對(duì)存活率+相對(duì)增重率)-(病變值+卵囊值)計(jì)算各組的ACI,評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[14],即ACI>160、160≤ ACI ≥ 120、ACI<120分別表示高效、部分、無抗球蟲效果。⑥血清抗體效價(jià):一免疫后7 d、二免后7 d以及攻蟲后7 d,分別從每組中隨機(jī)挑選3只雞采血,利用ELISA方法檢血清抗體效價(jià)。方法為:將5 μg/mL的柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊抗原包被于96孔板上,與雞血清孵育(1∶200)后,以Anti-Chicken IgY(IgG)(whole molecule)-Peroxidase antibody produced in rabbit(Sigma)作為二抗進(jìn)行孵育,以TMB為底物進(jìn)行顯色,在450 nm處讀取OD值。

    1.3 平養(yǎng)試驗(yàn)評(píng)價(jià)左旋咪唑的效果 根據(jù)籠養(yǎng)試驗(yàn)的結(jié)果,選取具有較好免疫增強(qiáng)和促生長作用的2個(gè)左旋咪唑劑量(0.05 mg和0.10 mg)進(jìn)行平養(yǎng)試驗(yàn),以進(jìn)一步確認(rèn)其效果。

    1.3.1 試驗(yàn)方法 150只剛出殼三黃雞,隨機(jī)分為5組,每組30只,平養(yǎng)于墊有木屑的房間里,飼喂無抗球蟲藥物的飼料,自由采食和飲水。3日齡時(shí),第1、2組每只雞分別先經(jīng)口灌服0.05、0.10 mg的鹽酸左旋咪唑,再接種600個(gè)柔嫩艾美耳球蟲早熟株卵囊,即左旋咪唑處理組(分別記為LEV1、LEV2);第3組每只雞接種600個(gè)柔嫩艾美耳球蟲早熟株卵囊,即無佐劑免疫組(VAC);第4、5組為不免疫組,分別為不免疫感染組(INF)和健康組(CON)。免疫后第21 d,各組隨機(jī)選取12只雞,除了第5組之外,其余各組每只雞灌服5×104個(gè)柔嫩艾美耳球蟲上海株(強(qiáng)毒株)卵囊。攻蟲后7 d,稱重、剖殺。

    1.3.2 主要觀測(cè)指標(biāo) 包括:①體重:免疫后第7、14、21 d以及攻蟲后7 d分別對(duì)所有的雞進(jìn)行稱重,計(jì)算出各組免疫期間的體重和攻蟲期間增重。②臨床癥狀、卵囊產(chǎn)量、腸道病變記分、抗球蟲指數(shù)等指標(biāo)的方法參照1.2.2。③血清細(xì)胞因子水平:免疫后第7、14、21 d以及攻蟲后7 d,分別從每組中隨機(jī)選取3只雞采血,利用ELISA檢測(cè)雞血清中的CD4、CD8分子及細(xì)胞因子TNF-α水平,所用試劑盒為Chicken Cluster of Differentiation 4(CD4)或8(CD8)ELISA Kit和 Chicken tumor Necrosis Factor α(TNF-α)ELISA Kit,均購自mlBio公司,檢測(cè)方法根據(jù)說明書進(jìn)行。數(shù)據(jù)結(jié)果以各試驗(yàn)組平均OD值與同時(shí)段健康組平均OD值之間的比值來表示。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用GraphPad Prism 5.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,并使用SPPS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)。當(dāng)方差分析發(fā)現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)時(shí),采用Dunnettt檢驗(yàn)分析處理組和對(duì)照組的均數(shù)差異。體重、OD值及腸道平均病變記分表示為“均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”。

    2 結(jié)果

    2.1 籠養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果

    2.1.1 左旋咪唑?qū)γ庖咂陂g雞體重的影響 由結(jié)果可知,各免疫組在免疫期間的平均體重均與健康組無差異顯著。但在一免后7 d,第3組(0.20 mg左旋咪唑組)體重稍差,相對(duì)體重率僅為94.09%;而在二免后7 d,第4組(無佐劑免疫組)體重稍差,相對(duì)體重率僅為94.62%(表1)。

    表1 籠養(yǎng)試驗(yàn)中免疫期間體重(g)和相對(duì)體重率(%)結(jié)果Table 1 Body weights (g) and relative weight rate (%) during immunization in battery test

    2.1.2 左旋咪唑?qū)ハx后雞免疫效果的影響 結(jié)果見表2。從表可知,各免疫組攻蟲期間的增重均與健康組的差異不顯著(P>0.05),且0.05 mg(第1組)和0.10 mg(第2組)左旋咪唑組的增重明顯高于不免疫攻蟲組(第5組)(P<0.05)。各免疫組的病變記分相當(dāng),均明顯低于不免疫攻蟲組(P<0.05)。除了0.20 mg左旋咪唑組(第3組)的卵囊產(chǎn)量與不免疫攻蟲組的相當(dāng)之外,其余免疫組的均明顯減少。從綜合指標(biāo)ACI來看,0.10 mg左旋咪唑組的ACI最高,達(dá)到192,具有極其高效效果,0.05 mg左旋咪唑組和無佐劑免疫組(第4組)具有高效效果,而0.20 mg左旋咪唑組的效果不佳。

    表2 籠養(yǎng)試驗(yàn)中攻蟲后的ACI結(jié)果Table 2 Result of ACI after challenge in battery test

    2.1.3 左旋咪唑?qū)贵w水平的影響 結(jié)果見表3。從表可知,各免疫組的抗體水平均在二免后7天最高,但除了0.20 mg左旋咪唑組(第3組)明顯高于不免疫組之外(P<0.05),其余組均差異不顯著(P>0.05)。在試驗(yàn)期間,三個(gè)左旋咪唑組的抗體水平均與無佐劑免疫組(第4組)的相當(dāng)(P>0.05)。

    表3 籠養(yǎng)試驗(yàn)中的血清抗體效價(jià)結(jié)果Table 3 Result of serum antibody titer in battery test

    2.2 平養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果

    2.2.1 左旋咪唑?qū)γ庖咂陂g雞體重的影響 結(jié)果見表4。由表可知,在免疫期間,各免疫組之間的體重相當(dāng),均與健康組(CON)無顯著差異(P>0.05),但左旋咪唑組(LEV1、LEV2)的體重稍高于無佐劑免疫組(VAC)。

    表4 平養(yǎng)試驗(yàn)中免疫期間的體重(g)和相對(duì)體重率(%)結(jié)果Table 4 Body weight (g) and relative weight rate (%) during immunization in floor-pen assay

    2.2.2 左旋咪唑?qū)ハx后雞免疫效果的影響 結(jié)果見表5。由表可知,各免疫組沒有出現(xiàn)死亡,而不免疫感染組存活率為91%。各免疫組的增重均與健康組的相當(dāng),腸道病變輕微或無病變,僅排出少量的卵囊。從綜合指標(biāo)ACI來看,各免疫組的ACI均大于160,具有高效的效果;但相對(duì)來講,0.10 mg左旋咪唑組(LEV2)的ACI達(dá)到212,優(yōu)于0.05 mg左旋咪唑組(LEV1)和無佐劑免疫組(VAC)。

    表5 平養(yǎng)試驗(yàn)中攻蟲后的ACI結(jié)果Table 5 Result of ACI after challenge in floor-pen assay

    2.2.3 左旋咪唑?qū)?xì)胞因子的影響 對(duì)免疫期間和攻蟲后血清中的CD4、CD8分子及細(xì)胞因子TNF-α水平進(jìn)行檢測(cè),以各試驗(yàn)組平均OD值與同時(shí)段的健康組平均OD值之間比值來表示試驗(yàn)結(jié)果。

    CD8分子檢測(cè)結(jié)果見表6,從表可知,各免疫組的CD8分子水平在免疫后第14 d明顯高于不免疫組(CON)(P<0.05),0.10 mg左旋咪唑組(LEV2)明顯高于無佐劑免疫組(VAC)(P<0.05);其余時(shí)間各組之間無顯著性差異(P>0.05)。

    表6 平養(yǎng)試驗(yàn)中CD8分子檢測(cè)結(jié)果Table 6 Result of CD8 detection in floor-pen assay

    CD4分子檢測(cè)結(jié)果見表7,從表可知,各免疫組的CD4分子水平在免疫后第7 d明顯高于不免疫組(CON)(P<0.05),左旋咪唑組與無佐劑免疫組(VAC)之間相當(dāng)(P>0.05);其余時(shí)間各組之間無顯著性差異(P>0.05)。

    表7 平養(yǎng)試驗(yàn)中CD4分子檢測(cè)結(jié)果Table 7 Result of CD4 detection in floor-pen assay

    TNF-α分子檢測(cè)結(jié)果見表8,從表可知,各免疫組的TNF-α分子水平在免疫后(第7、14、21 d和攻蟲后7 d均明顯高于不免疫組CON)(P<0.05),2個(gè)左旋咪唑組在免疫后第21 d和攻蟲后7 d均明顯高于無佐劑免疫組(VAC)(P<0.05),而免疫后7、14 d時(shí)差異不顯著(P>0.05)。

    表8 平養(yǎng)試驗(yàn)中TNF-α分子檢測(cè)結(jié)果Table 8 Result of TNF-α detection in floor-pen assay

    3 討論

    左旋咪唑?yàn)檫溥蜓苌?,?duì)寄生于消化道和呼吸道的線蟲均有高效的驅(qū)除效果,且毒副作用低,是被廣泛應(yīng)用的獸用抗蠕蟲藥物[15-16]。1971年,Renoux等[17]發(fā)現(xiàn)左旋咪唑能增強(qiáng)小鼠布氏桿菌菌苗免疫效果,進(jìn)一步研究表明,左旋咪唑具有免疫刺激作用,可以通過促進(jìn)免疫細(xì)胞的增殖和成熟,或通過增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的功能來刺激產(chǎn)生免疫[18-19]。同時(shí),左旋咪唑?qū)ζ⑴K、法氏囊等免疫器官的發(fā)育具有促進(jìn)作用,對(duì)雞具有顯著的增重效果[15],可減輕疫苗對(duì)免疫雞生長的不良影響。由于具有免疫增強(qiáng)和促生長的雙重作用,左旋咪唑是一種良好的免疫增強(qiáng)劑,被應(yīng)用于新城疫[20-24]、禽流感[25]、雞傳染性法氏囊[26]等疫苗研制中。本文研究左旋咪唑?qū)θ崮郯蓝蛳x免疫增強(qiáng)效果,首先在籠養(yǎng)試驗(yàn)中對(duì)左旋咪唑的劑量進(jìn)行篩選,再通過平養(yǎng)試驗(yàn)對(duì)篩選獲得的有效劑量進(jìn)行驗(yàn)證。

    本研究首先在籠養(yǎng)試驗(yàn)中對(duì)左旋咪唑的劑量進(jìn)行篩選,首次免疫所用雞為3日齡,是為了與球蟲病活疫苗推薦使用的日齡一致,由于免疫雞一般需要2~3次重復(fù)感染后才可獲得較好的免疫保護(hù)力,而籠養(yǎng)雞無法進(jìn)行二次感染,所以首免后7 d進(jìn)行了二次免疫以增強(qiáng)免疫力?,F(xiàn)有商品化球蟲病活疫苗都僅需免疫一次,所以本研究中僅是在首次免疫時(shí)將左旋咪唑與柔嫩艾美耳球蟲聯(lián)合使用,是為了盡可能與疫苗臨床使用方法相符合。最小劑量主要參考喬彥良等[24]、楊晶晶等[25]人的報(bào)道,按每公斤體重免疫1 mg左旋咪唑來計(jì)算,3日齡雞的體重約為50 g,所以每只雞的劑量為1 mg/kg×0.05 kg=0.05 mg,在此基礎(chǔ)上設(shè)置了0.1 mg和0.2 mg劑量組,即分別是按每公斤體重免疫2 mg和4 mg左旋咪唑來計(jì)算。在試驗(yàn)中,我們觀測(cè)了雞的免疫期間體重、ACI以及血清抗體水平等指標(biāo),結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.1 mg和0.05 mg組雞在免疫期間的增重均稍好于無佐劑免疫組,免疫保護(hù)力分別高于或相當(dāng)于無佐劑免疫組,而0.2 mg組在免疫初期對(duì)雞有不良影響,抗球蟲效果明顯低于無佐劑免疫組。結(jié)果表明左旋咪唑?qū)θ崮郯蓝蛳x感染雞具有免疫增強(qiáng)和促生長雙重作用,但其發(fā)揮作用的強(qiáng)度與劑量有關(guān),這與王書全等[27]研究結(jié)果一致?;诨\養(yǎng)試驗(yàn)的結(jié)果,我們選擇劑量為0.05 mg和0.10 mg左旋咪唑進(jìn)行散養(yǎng)試驗(yàn)以進(jìn)一步驗(yàn)證其效果。結(jié)果也發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)劑量組免疫期間的增重均稍好于無佐劑免疫組,0.10 mg組的ACI明顯高于0.05 mg組,而后者與無佐劑免疫組相當(dāng)。兩次試驗(yàn)結(jié)果均表明0.1 mg左旋咪唑?qū)θ崮郯蓝蛳x感染雞的免疫增強(qiáng)和促生長的效果最好。

    球蟲感染后可誘發(fā)宿主產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng),其中體液免疫在抗球蟲免疫中發(fā)揮著不可忽視的作用,尤其特異性抗體 IgG在抵抗球蟲感染時(shí)具有重要的作用[28-29]。在籠養(yǎng)試驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)各免疫組的IgG抗體水平在二免后7 d(即一免后14 d)明顯高于不免疫組,其余時(shí)間均與不免疫組的相當(dāng),這與已有研究一致。田文霞等[29]發(fā)現(xiàn)雞特異性IgG可在初次感染柔嫩艾美耳球蟲后第6 d的血清中檢測(cè)出,隨后抗體水平逐漸升高于第18 d達(dá)到峰值,持續(xù)一段時(shí)間后下降。但本試驗(yàn)中,各左旋咪唑組與無佐劑免疫組之間的抗體水平無顯著性差異,不同于已有研究。已有研究發(fā)現(xiàn)左旋咪唑與新城疫疫苗聯(lián)用[20-24]、與雞傳染性法氏囊疫苗聯(lián)用[26]均可明顯升高血清特異性抗體滴度。

    在雞球蟲保護(hù)性免疫機(jī)制中,細(xì)胞免疫居于主導(dǎo)地位,而T細(xì)胞免疫反應(yīng)在抵抗球蟲病過程起重要作用。雞CD4和CD8分子是T細(xì)胞表面重要的表面標(biāo)志。在平養(yǎng)試驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)免疫組的CD4和CD8分子水平分別在免疫后第7 d和14 d明顯升高,這與已有研究一致。當(dāng)感染球蟲后,雞CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞都參與細(xì)胞免疫過程,CD4+T淋巴細(xì)胞作為調(diào)節(jié)細(xì)胞,主要是啟動(dòng)免疫應(yīng)答和抵抗初次感染;而CD8+T淋巴細(xì)胞作為一種效應(yīng)細(xì)胞,是抵抗再感染的主力[30-32]。但左旋咪唑處理組的CD4與無佐劑免疫組之間無顯著性差異,而0.1 mg組CD8分子水平免疫后第14 d明顯高于無佐劑免疫組,而0.05 mg組與無佐劑免疫組相當(dāng),均明顯高于不免疫組,說明左旋咪唑無促進(jìn)CD4增殖作用,而0.1 mg左旋咪唑可以明顯促進(jìn)CD8分子的增殖。

    雞感染球蟲后,在細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中,激活的CD4+和CD8+T細(xì)胞釋放的多種細(xì)胞因子在抗球蟲中發(fā)揮重要作用,主要包括5種細(xì)胞因子:IFN-γ、IL-2、IL-5、TGF和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)[33]。其中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是由自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌,對(duì)球蟲感染可產(chǎn)生保護(hù)作用。在本試驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)各免疫組的TNF-α水平明顯高于不免疫組,這與已有研究一致。王彩霞等[34]研究結(jié)果表明,首免柔嫩艾美球蟲后第9 d雞TNF-α水平明顯升高。同時(shí)也發(fā)現(xiàn),左旋咪唑處理組在免疫后第21 d和攻蟲后第7 d均明顯高于無佐劑免疫組,說明左旋咪唑可明顯刺激機(jī)體產(chǎn)生TNF-α,利于抵抗球蟲的感染,這與Zhang等[35]發(fā)現(xiàn)脂多糖或柔嫩艾美球蟲子孢子、裂殖子可刺激雞巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF的結(jié)果一致。

    綜上,本研究發(fā)現(xiàn)0.1 mg左旋咪唑處理組可明顯促進(jìn)雞CD8因子的增殖和TNF-α的分泌,明顯提高柔嫩艾美耳球蟲的免疫效果,且有促生長的作用,可以消除球蟲免疫對(duì)生長的不良影響,即左旋咪唑與柔嫩艾美耳球蟲聯(lián)合使用的最佳劑量為:按每公斤體重免疫2 mg左旋咪唑來使用。本研究結(jié)果為進(jìn)一步評(píng)估左旋咪唑作為球蟲病活疫苗的免疫增強(qiáng)劑提供理論基礎(chǔ)。

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