非洲豬瘟的流行病學及疫苗研究新進展

黃 劍，李國新，童光志

（1.福建農林大學動物科學學院，福州 350002；2.中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

非洲豬瘟（ASF）自1921年在非洲肯尼亞發(fā)現(xiàn)后，隨后陸續(xù)傳至非洲其他地區(qū)、歐洲、美洲和俄羅斯等區(qū)域，2018年8月，在中國遼寧發(fā)現(xiàn)首例ASF疫情，并迅速擴散至全國各地，由此直接導致我國生豬存欄量急劇下降。由于目前還未有有效的疫苗[1-3]，因此，疫苗的研制迫在眉睫。本文主要從近些年ASF流行病學及疫苗的研究進展加以綜述。

1 流行病學

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒引起的以高熱、呼吸障礙和神經癥狀為主要特征的一種急性、烈性傳染病[4]。ASFV可感染不同年齡段的家豬和野豬，臨床上最急性型和急性型ASF的死亡率高達100%，亞急性型的死亡率可降低30～70%。

ASFV的傳播途徑主要有直接接觸感染動物或軟蜱叮咬傳播、也可通過污染過的泔水、飼料等食物傳播、另外也能通過接觸感染過的豬尸體或其產品進行傳播[5-7]。1998年馬達加斯加[8]暴發(fā)的ASF疫情就是通過野豬與家豬直接接觸導致；1985年由于非法飼喂泔水導致荷蘭[9]暴發(fā)ASF；2018年中國[10]也暴發(fā)了ASF，具體的傳播來源見表1?？梢园l(fā)現(xiàn)，ASFV主要通過國際貿易以及走私等方式導致了跨國、跨洲的傳播，地方性流行主要通過易感豬與帶毒豬的接觸以及ASFV污染過的料、餐余垃圾、泔水等傳播。

表1 ASF疫情傳播來源Table 1 Sources of African swine fever transmission

2 病原學

ASFV是非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬的唯一成員[11-13]。是具有囊膜包被的二十面體DNA病毒[14]。ASFV基因組長度為170～190 kb，有150多個開放閱讀框（opening reading frame, ORF）[15-19]，編碼50多種結構蛋白和100多種非結構蛋白（見圖1-1）。ASFV病毒粒子由里到外主要由5部分組成：含病毒基因組（genome）DNA的擬核、內核芯殼（core shell）、內膜（inner envelope）、衣殼（capsid）和囊膜（external envelope）[20]。其結構主要包含中間約130 kb比較穩(wěn)定的基因區(qū)（stable region），兩邊為20～40 kb的由串聯(lián)重復序列和多基因家族（multigene families, MGF）構成的可變區(qū)（variable region）[21]，末端是有37 nt部分堿基互補配對的發(fā)卡環(huán)結構（hairpin loop）[22]。標準的免疫學實驗不能區(qū)分病毒株，但通過對編碼p72的基因B646L末端約500 bp核苷酸的序列分析法，目前已經鑒定出24種ASFV基因型[23]。

圖1 ASFV結構示意圖[24]Fig.1 The structure of ASFV

ASFV的生命周期主要有病毒吸附、入侵、復制、包裝和出芽5個過程。ASFV進入機體，單核巨噬細胞首先受到感染，ASFV通過CD163受體介導的內吞作用進入細胞，然后利用相關因子進行早期mRNA的轉錄，這時主要編碼早期所需的酶類，如DNA聚合酶等[25]。最初的研究認為，胞質的病毒工廠是基因組復制的起點[26]；后來發(fā)現(xiàn)，感染早期基因組在細胞核也出現(xiàn)了復制，核內復制產生的基因組比正?；蚪M要小，目前尚不清楚其中的作用[27]。但是可以由此推測，早期在細胞核內復制的基因組被轉運到病毒工廠后用于正?；蚪M的復制[28]。ASFV在細胞質的病毒工廠進行復制加工，比如核蛋白的包裝，形成二十面體對稱的衣殼。包裝好的病毒粒子通過微觀作用移至細胞膜，通過出芽的方式獲得外層囊膜[25]離開宿主細胞。

3 疫苗研究進展

過去幾十年大量的研究表明，滅活疫苗雖能誘導抗體反應，但對強毒攻擊不能提供有效保護；基于單個或多個保護性抗原的亞單位疫苗，包括重組蛋白、DNA疫苗和病毒活載體疫苗等，能對免疫動物提供部分保護；而弱毒活疫苗，包括天然弱毒株、傳代培養(yǎng)致弱毒株和基因缺失弱毒株等，能誘導體液免疫應答和細胞免疫應答，為接種動物提供高水平的保護，被認為是最有希望研制成功的疫苗（表2）。

表2 不同類型的非洲豬瘟疫苗的特性Table 2 Characteristics of different types of African swine fever vaccines

3.1 滅活疫苗 ASF疫情暴發(fā)后，最先開始研究的是滅活疫苗，但是不能提供有效的保護作用[29]。后來Blome等[30]將佐劑PolygenTM與Emulsigen?-D與ASFV的滅活制劑混合后免疫豬，結果發(fā)現(xiàn)能夠檢測到特異性抗體，但是并沒有觀察到保護作用。此外，滅活疫苗免疫后也已經觀察到抗體介導的感染增強現(xiàn)象[31-32]。

滅活疫苗引起的細胞免疫應答弱且很難誘導產生有效的中和抗體，這也是滅活疫苗不能提供有效保護的主要原因。

3.2 減毒活疫苗

3.2.1 傳代致弱毒株 ASFV經細胞傳代培養(yǎng)，會導致病毒基因組部分區(qū)域缺失，從而使病毒毒力減弱，這曾經使研究者看到了研制ASF疫苗的希望。ASFV-G株在Vero細胞上傳代培養(yǎng)，使該毒株在Vero細胞上復制越來越強，在豬原代巨噬細胞上的復制能力下降，病毒毒力逐漸減弱，直至在第110代毒力完全喪失。但經多次傳代培養(yǎng)的毒株抗原性也發(fā)生了改變，給家豬接種后，沒能誘導有效的免疫應答。用豬骨髓細胞傳代培養(yǎng)獲得的弱毒株免疫豬可以抵抗強毒株的攻擊。但該弱毒株在葡萄牙和西班牙的田間試驗，造成了災難性的后果。接種豬出現(xiàn)肺炎、皮膚潰瘍、流產甚至死亡等嚴重的副作用。在葡萄牙，55萬頭接種豬有超過12萬頭豬出現(xiàn)副反應，并出現(xiàn)大量的病毒攜帶豬。此次試驗失敗后，再無弱毒株進行過田間試驗[33]。

“昆南”陰平聲字“他”的唱調（《南西廂·佳期》【十二紅】“愛他兩意和諧”，687），其中的即為兩節(jié)型過腔。雖然這個過腔的音樂材料都相同，都來自于本唱調音階的級音，但由此組成的樂匯或句型可以分作兩節(jié)，為第一節(jié)級音性過腔，為第二節(jié)級音性過腔。這個過腔即是由同一種音樂材料組成的兩節(jié)型過腔。

3.2.2 天然致弱毒株 目前，研究較多的天然致弱毒株有OURT88/3和NH/P68，這兩種毒株接種豬能抵抗同型強毒的攻擊，保護率最高可達100%。但天然致弱毒株作為疫苗需要解決安全性問題，已經證實，大部分接種豬會產生肺炎、運動障礙、流產甚至死亡等安全問題。

最近，歐洲報道了一株分離自野豬的基因Ⅱ型天然致弱毒株Lv17/WB/Rie1[34]，與OURT88/3和NH/P68類似，該毒株無紅細胞吸附活性。以10 TCID50劑量肌肉注射該毒株，接種豬僅產生輕微的臨床癥狀，表現(xiàn)3～5 d的低燒（40℃～40.7℃），伴隨著不同程度的耳朵發(fā)紺和關節(jié)腫脹。接種豬能排毒并且接觸豬也能被感染，接種豬和接觸豬都能產生高水平的抗體。在感染2個月后，所有接種豬和接觸豬完全暴露于感染強毒的豬中，感染弱毒株的豬能完全抵抗強毒株的攻擊。

Lv17/WB/Rie1毒株以口服方式接種野豬，6/9的接種豬和3/3接觸豬在一個月的試驗期內抗體轉陽。有7/9的接種豬和1/3的接觸感染豬有平均3～4 d的輕微發(fā)熱（40.1℃～40.8℃）。強毒株攻擊后，11/12接種豬和接觸豬存活，沒有表現(xiàn)出任何非洲豬瘟的臨床癥狀。30 d免疫期內2頭沒有抗體反應也沒有發(fā)熱的豬，在強毒攻擊后第3 d和第7 d抗體轉陽。唯一死亡的1頭豬在攻毒前后都沒有檢測到抗體，在攻毒后，和對照攻毒豬一樣，表現(xiàn)出了典型的臨床癥狀。

3.2.3 基因缺失弱毒株 重組ASFV見表3[35-42]。包括特定的基因缺失，例如胸苷激酶（thymidine kinase T,K）的缺失，可能會產生非致病性的毒株[35-36]。此外，刪除涉及免疫逃避的基因，DP71L基因以及多基因家族360和505（MGF360和MGF505），或與病毒復制有關的基因以及B119L基因，可以使ASFV強毒株毒性減弱并且可以誘導保護性免疫應答來抵抗強毒的攻擊，但殘留毒力水平不同[37-40]。敲除單個或多個基因獲得的基因缺失毒株，毒力減弱而且可誘導不同程度的針對同源毒株或異源毒株的保護[41]。

表3 ASFV基因缺失毒株及其特性Table 3 Genes deletion strain of ASFV and its characteristics

最近，我國報道了一株由中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所構建的基因缺失病毒株（HLJ/18-7GD），初步試驗證明，該基因缺失（MGF505-1R、MGF505-2R、MGF505-3R、MGF360-12L、MGF360-13L，MGF360-14L和CD2v缺失）疫苗具有較好的安全性和有效性[42]。

3.3 亞單位疫苗 ASFV編碼150多個蛋白，而且很多蛋白的功能不清，因此，選擇可以作為亞單位疫苗的候選抗原將十分困難。目前，已有報道，ASFV結構蛋白p72、p54、p30、p12、CD2v等都可以引起機體產生免疫應答見表4[41-51]。

使用桿狀病毒同時表達的p54和p30蛋白共同免疫豬，可有效抵抗E75毒株的致死性攻擊[43]，而使用桿狀病毒表達p72、p54和p30蛋白組合免疫豬，雖然能夠檢測到中和抗體，但是對致病性Malawi分離株并不提供保護能力。這些不同的結果可能是使用不同的病毒株造成的，同時細胞免疫應答對于保護作用也尤為關鍵。Argilaguet等[44]的研究結果表明，編碼p54和p30蛋白的DNA疫苗不會誘發(fā)產生中和抗體，面對E75毒株的致死性感染時不提供保護能力。這提示，使用相同的抗原，但不同形式的疫苗可能產生不同的結果。

表4 不同類型亞單位疫苗的特性Table 4 Characteristics of different types of subunit vaccines

腺病毒、痘病毒或偽狂犬病病毒作為載體表達ASFV抗原能夠誘導比較強的體液免疫的應答和細胞免疫應答[47-49]，但是其免疫保護效力需要進一步評價。近期有以腺病毒為載體表達的多種抗原采取“雞尾酒式”免疫野豬后，并不提供保護作用[50-51]。

4 結語與展望

目前，ASF疫情幾乎席卷我國所有地區(qū)，就連越南、蒙古、柬埔寨等周邊國家也相繼報道[52]，我國及時地采取封鎖隔離、撲殺等方式，有效地控制了疫情的進一步蔓延，但是隨著貿易全球化，國內跨區(qū)域的人流、物流、車流、豬流以及肉制品的流動給疫情的控制增添了不少煩惱。此外，我國目前流行的ASFV能引發(fā)野豬感染致死[53]。在有效疫苗問世之前，可以從生物安全角度進行防控，形成運輸車-實驗室-隔離點三級隔離監(jiān)測系統(tǒng)，提升豬場生物安全水平，即生豬在調運時需隔離消毒幾天且每天采樣送至實驗室檢測是否含有病毒源，無病毒才可允許進出；同時也要妥善處理帶毒豬和污染物[54]。

由于ASFV生物學特性的復雜性，迄今為止還未能研制出安全有效的疫苗[55]。對于ASFV與宿主互作的各種機制，如免疫逃避機制、免疫保護機制等，我們知之甚少；還有很多病毒蛋白的功能尚不清楚，這嚴重阻礙了ASF疫苗的研發(fā)進程。滅活疫苗十分安全，但是誘導的免疫應答較弱，不能提供有效的保護能力。

弱毒活疫苗被認為是ASF疫苗研發(fā)最有希望的疫苗。對于基因缺失弱毒活疫苗的研制，安全性是要考慮的最重要因素。比如重復接種和超劑量接種的安全性、病毒在體內外的穩(wěn)定性、與流行的野毒株重組的可能性等。理想的情況是，找到幾種與毒力相關和免疫抑制相關的基因，并尋求在它們之間找到一個合適的組合，進行敲除，在疫苗的安全性和有效性上獲得精準的平衡。我國近期研發(fā)的MGF 360/505、CD2v基因缺失毒株HLJ/18-7GD在實驗室條件下具備安全性和有效性，但是其對異源毒株的保護能力尚未可知，該疫苗可以說是目前最可能實現(xiàn)產業(yè)化應用的疫苗。

盡管迄今為止在減毒活疫苗方面的研究中發(fā)現(xiàn)了針對ASFV的最佳保護效果[56-57]，但是其安全性堪憂，從安全角度出發(fā)，基于亞單位疫苗的持續(xù)研究仍然有趣。亞單位疫苗相對安全，但是缺少保護能力[58-59]，且需要多種抗原以及多次免疫，這說明距離研制有效的亞單位疫苗還有巨大的改進空間。由于目前的有效抗原較少，且很多病毒蛋白功能還未可知，今后如果能夠解析出更多蛋白的功能，鑒定出更多有效的抗原，或許能夠研制出有效的疫苗。

用一種類型的疫苗免疫后，再用表達同樣抗原的另一種疫苗加強免疫，能夠誘導強的免疫應答。Murgia等[60]用甲病毒表達的p30（RP-30）免疫后，再用天然弱毒株OURT88/3加強免疫拓寬了抗原表位的識別。因此，既然目前ASF疫苗研發(fā)有困難，那么可以采用不同疫苗相互組合免疫的方式，可能會給ASF疫苗的研究帶來希望。例如，在弱毒活疫苗的研究中，如果在安全性和有效性上無法找到合適的平衡，為了確保安全，可以考慮犧牲一些有效性。然后，通過多次免疫策略與亞單位疫苗聯(lián)合應用來提高免疫應答水平，彌補疫苗的有效性。

從目前的疫苗研究進展來看，有效的疫苗短期內較難實現(xiàn)產業(yè)化[61-62]，但是ASFV的基礎研究也為將來疫苗的問世奠定了基礎。此外，也可以同時研制針對參與ASFV的復制、轉錄有關的蛋白的抗病毒藥物。