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    胡蜂毒素Mastoparan的分子改造和定量構(gòu)效關(guān)系研究進(jìn)展

    2022-09-23 06:39:34韓晉輝呂文平
    關(guān)鍵詞:胡蜂多肽氨基酸

    翟 培,韓晉輝,呂文平

    (1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院,廣州 510520;2.江南大學(xué),無錫 210122)

    1979年Hirai等[1]從胡蜂(Vespula lewisii)毒液中分離出一種多肽類物質(zhì)Mastoparan(MP),因其具有誘導(dǎo)鼠肥大 細(xì)胞脫顆粒并釋放組胺的功能,所以也被稱為“組胺釋放因子”。隨著研究的深入,人們從其他胡蜂毒液中分離純化出與MP功能類似的陽離子多肽,序列測定發(fā)現(xiàn)它們皆有14個(gè)左右氨基酸殘基,但氨基酸的組成和序列長度略有不同,故將它們統(tǒng)稱為“MP家族”。從數(shù)據(jù)庫UniProtKB(https://www.uniprot.org/)可以檢索到32條相關(guān)多肽。

    MP展示出多種生物活性,作用于不同類型細(xì)胞產(chǎn)生效應(yīng)不同,如:MP作用于肥大細(xì)胞可以使其脫顆粒釋放組胺,作用于血小板可以使其分泌5-羥色胺,作用于嗜絡(luò)細(xì)胞使其分泌兒茶酚胺類物質(zhì),作用于胰島β細(xì)胞使其分泌胰島素等[2];MP可以活化G蛋白,引發(fā)一系列相關(guān)的生物效應(yīng),如:激活磷脂酶A2、磷脂酶C、磷脂酶D、鳥苷酸環(huán)化酶[3-4];此外,MP抗耐藥菌和抗腫瘤活性引起研究人員的廣泛關(guān)注。Das Neves等[5]發(fā)現(xiàn)Agelaia-MP(UniProt P69436)和Venom protein 13a(UniProt P84915)可以有效抑制多藥耐藥鮑氏不動(dòng)桿菌,并阻止其生物膜的形成;Raynor等[6]研究發(fā)現(xiàn)Mastoparan-L(UniProt P01514)、MP-X(UniProt P01515)和MP-J(UniProt P01517)均能抑制白血病HL60細(xì)胞的增殖和存活;WU等[7]實(shí)驗(yàn)表明,D型MP-M(UniProt P04205)可以有效抑制5種腫瘤細(xì)胞的生長,且比L型MP-M具有更高的抗癌活性;Yamada等[8]研究發(fā)現(xiàn)MP的類似物能增加線粒體的通透性,影響慢性髓性白血病細(xì)胞的生存能力;Annielle等[9]研究發(fā)現(xiàn)MP對人多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞具有明顯的促壞死作用;在具有抗癌活性的MP中,Polybia-MP I(UniProt P0C1Q4)對腫瘤細(xì)胞具有高度的選擇性。它可以選擇性地抑制人類白血病T淋巴細(xì)胞、前列腺癌和膀胱癌細(xì)胞的增殖,對正常(非癌)細(xì)胞幾乎沒有細(xì)胞毒性作用[10-11]。由此可以看出,MP在抗多重耐藥菌和抗腫瘤方面表現(xiàn)出良好的生物活性,其作用方式不同于傳統(tǒng)藥物,尤其是在抗腫瘤細(xì)胞方面,具有多靶點(diǎn)殺傷作用,作用效應(yīng)呈多樣性,是一種不可多得的天然活性多肽,具有重要的醫(yī)學(xué)價(jià)值和良好的應(yīng)用前景。

    1 Mastoparan分子改造研究進(jìn)展

    研究表明,MP的兩親α螺旋結(jié)構(gòu)和陽離子性對其生物活性至關(guān)重要,其作用機(jī)制為通過靜電作用與細(xì)胞膜結(jié)合,N端位于脂質(zhì)雙層的外側(cè),酰胺化的C端嵌入脂質(zhì)雙層內(nèi)部,利用“地毯模型”與膜相互作用,即:MP在膜表面聚集,從而導(dǎo)致細(xì)胞逐漸滲漏,其屏障特性短暫中斷,細(xì)胞內(nèi)容物發(fā)生滲漏,接下來,雙層膜以不均勻的方式恢復(fù)其連續(xù)性,最終肽被夾在兩個(gè)并列的膜之間,形成高肽脂比的腫塊。但MP作用于不同細(xì)胞,由于肽的濃度不同、膜的成分不同等因素,其作用機(jī)制有所差異,如:Hartman等利用電鏡觀察MP作用于大腸桿菌時(shí),發(fā)現(xiàn)有膜泡及膜皺褶形成;Das Neves等[5]觀察MP作用于耐藥鮑曼芽胞桿菌時(shí),發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜有孔洞形成。

    MP具有優(yōu)良的抗菌和抗腫瘤特性,但由其引的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞毒性等問題極大限制了MP的臨床應(yīng)用?;贛P構(gòu)效關(guān)系的分子改造,可以有效解決上述問題,已成為MP研究的熱點(diǎn)。盡管有大量關(guān)于優(yōu)化MP理化參數(shù)提高其生物活性的報(bào)道,如:陽離子性和疏水性提高有利于MP的抗菌廣譜性;降低疏水性可減少M(fèi)P溶血活性等,但多肽的各種結(jié)構(gòu)參數(shù)并非獨(dú)立發(fā)揮作用,一種因素的改變通常會導(dǎo)致其他因素的變化,因此MP的結(jié)構(gòu)改造并沒有通用的規(guī)則可以使用。目前,國內(nèi)外對MP結(jié)構(gòu)改造策略主要有兩種:(1)通過氨基酸替換、D型改造、序列環(huán)化、化學(xué)修飾等方法,提高M(jìn)P生物活性和酶穩(wěn)定性;(2)通過與其他功能多肽雜合或延伸其末端,提高M(jìn)P生物利用效率。

    1.1 Mastoparan結(jié)構(gòu)特征 MP的抗菌和抗癌細(xì)胞活性與其結(jié)構(gòu)特征密切相關(guān)。MP結(jié)構(gòu)簡單,一級結(jié)構(gòu)由14個(gè)左右的氨基酸組成,富含疏水氨基酸和堿性氨基酸,其中疏水氨基酸以亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和丙氨酸為主,堿性氨基酸以賴氨酸為主,含量一般為2~4個(gè);N端大多由異亮氨酸占據(jù),C末端大部分被亮氨酸占據(jù),且酰胺化;二級結(jié)構(gòu)在水溶液中呈自由卷曲狀態(tài),與生物膜或?qū)Π偃湛榷舅孛舾行訥蛋白的α亞基作用時(shí)表現(xiàn)為兩親性的α-螺旋結(jié)構(gòu)[12-16]。MP主要利用靜電作用和兩親螺旋結(jié)構(gòu),通過改變膜的滲透性或直接在膜上形成孔洞來發(fā)揮抗菌和抗腫瘤功能[17]。利用多重序列比對軟件MAFFT,將UniProtKB數(shù)據(jù)庫檢索到的32條MP序列進(jìn)行比對,其保守序列見圖1。

    圖 1 MP保守序列Fig.1 MP conservative sequence

    1.2 Mastoparan的氨基酸替換 John研究團(tuán)隊(duì)對MP的構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究,他們將MP-L第5位和第8位的丙氨酸用賴氨酸替換,第10位的丙氨酸用α-氨基異丁酸(Aib)替換,目的在于增加親水面陽離子密度的同時(shí),用α-氨基異丁酸促進(jìn)螺旋結(jié)構(gòu)的形成,增加肽的酶穩(wěn)定性。改造后的設(shè)計(jì)肽被命名為:Mitoparan(MitP),該多肽具有廣譜的抗菌特性(S.aureus:MIC 6-8mg/L;E.coli:MIC 4mg/L;C.albicans:MIC 27 mg/L),且同樣具有促肥大細(xì)胞脫顆粒作用,最重要是MitP穿過細(xì)胞膜后在線粒體內(nèi)聚集,能夠促進(jìn)細(xì)胞釋放細(xì)胞色素C從而引起細(xì)胞凋亡[18-19];隨后的研究表明,MitP可以在N端連接其他的結(jié)構(gòu)元件:RGD肽、Fas配體模擬物等,攜帶其一起穿過生物膜,并作用于線粒體[20-21]。John認(rèn)為MitP可以作為優(yōu)勢骨架(privileged scaffold)對結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾和改造,以改善生物活性,如:MitP利用絲氨酸替換末端亮氨酸后,由于在疏水面末端引入極性的羥基,使得[Ser14]MitP不僅對真核細(xì)胞沒有毒性,而且不會引起肥大細(xì)胞脫顆粒,但其抗菌活性較MitP有所下降(S.aureus,E.coli,C.albicans,MIC:>32 mg/L),對新型隱球菌C.neoformans保持較高抗菌活性(MIC 5 mg/L)。實(shí)驗(yàn)表明[Ser14]MitP可在線粒體內(nèi)聚集,但不會激活電壓依賴性陰離子通道(VDAC),從而可避免細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

    Irazzabal等[22]將MP-L第5和第8位丙氨酸分別用異亮氨酸和精氨酸替換,衍生肽命名為[I5,R8]MP、MP-L及[I5,R8]MP螺旋輪圖見圖2。該多肽具有良好的抑菌活性(S.aureus:MIC 25 μmol/L;E.coli:MIC 12.5 μmol/L;C.albicans:MIC 12.5 μmol/L),體外實(shí)驗(yàn)表明[I5,R8]MP對紅細(xì)胞及HEK-239沒有細(xì)胞毒性(IC50>200 μmol/L)。該設(shè)計(jì)將第8位換為精氨酸后,MP凈電荷從+3增加到+4,且根據(jù)Pace-Scholtz's α螺旋傾向表[23],精氨酸更傾向于形成α螺旋結(jié)構(gòu);氨基酸替換后未改變多肽整體極面角度Φ和疏水力矩(hydrophobic moment; Ile和Arg疏水指數(shù):4.5和-4.5)。

    圖2 MP-L及[I5,R8]MP螺旋輪圖Fig.2 Helical wheel representation of MP-L and [I5,R8]MP

    1.3 Mastoparan的D型及全反改造 某種多肽如果通過與特定受體或酶結(jié)合發(fā)揮其生物功能,那么D型多肽由于側(cè)鏈方向的改變將無法發(fā)揮其原有生物功能;當(dāng)D型多肽保持生物活性時(shí),說明多肽可能是與磷脂相發(fā)生作用,而沒有特定的受體。因此多肽D型及全反設(shè)計(jì)是研究結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系的常用手段,也是增加多肽酶穩(wěn)定性的有效方法[24]。Sarah等[25]將MP-L和MitP進(jìn)行了D型改造及逆向改造,序列見表1。實(shí)驗(yàn)表明MP-L及MitP的D型異構(gòu)體保持了其對腫瘤細(xì)胞的毒性、肥大細(xì)胞脫顆?;钚约澳せ钚裕嫦驑?gòu)型和全反構(gòu)型卻幾乎沒有活性,說明MP-L及MitP的生物功能與結(jié)構(gòu)密切相關(guān),但并非通過特定受體或酶發(fā)揮作用。

    表1 MP、MitP 及其異構(gòu)體氨基酸序列及分子量Table 1 Amino acid sequence and molecular weight of MP, MitP and their isomers

    該實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)D型MP-L有潛力成為抗酶解穿膜肽(CCP)。D型MP-L在5 μmol/L濃度下,與穿膜肽Penetratin和TAT相比,D型MP-L可以更快、更有效的進(jìn)入U(xiǎn)373MG細(xì)胞,主要聚集在中性的溶酶體中。

    1.4 Mastoparan的環(huán)化改造 Chen等[26]對Mastoparan C(LNLKALLAVAKKIL-NH2)進(jìn)行了改造研究,在MP-C末端添加二硫鍵環(huán)化,設(shè)計(jì)出環(huán)形MP類似物cMP-C(CLNLKALLAVAKKILC-NH2)。經(jīng)過環(huán)化之后的MP-C在血清中的穩(wěn)定性增加,但其抗菌活性較母肽明顯下降,且溶血活性也有較大的增加;值得注意的是該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示α螺旋含量最高的cMP-C最快觀察到滲漏現(xiàn)象,但其抑菌活性卻不及其他兩個(gè)MP類似物,其原因可能是MP-C經(jīng)環(huán)化后,疏水氨基酸更加集中,導(dǎo)致溶血性增加,但末端增加2個(gè)半胱氨酸之后,反而因?yàn)樵黾影被崾沟藐栯x子變的分散,不利于抑菌活性。cMP-C對哺乳動(dòng)物細(xì)胞的毒性和膜滲透能力顯著大于母肽MP-C。由此可見,α螺旋結(jié)構(gòu)對膜滲透有直接影響,但并不是多肽生物活性的唯一決定因素。

    1.5 Mastoparan的雜合改造 宋竟婧等[27]以MitP為分子骨架結(jié)構(gòu),設(shè)計(jì)出MitP的陰離子伙伴肽MitPE(INLEHLAHL(Aib)EEIL),并將MitP與MitPE通過二硫鍵連接起來,設(shè)計(jì)出具有非常優(yōu)異的抗腫瘤特性的AMitP,其分子結(jié)構(gòu)見圖3。在正常酸堿度下,MitP肽段與MitPE肽段之間由于靜電作用及分子間作用的影響,使得AMitP失去了生物活性;在酸性條件下,MitP與MitPE肽段之間的靜電作用減小,AMitP恢復(fù)活性構(gòu)象。酸度依賴特性使該設(shè)計(jì)肽具有細(xì)胞選擇性:對于正常細(xì)胞,其胞外環(huán)境為中性,因此AMitP對正常細(xì)胞幾乎沒有傷害;對于腫瘤細(xì)胞,因其胞外環(huán)境為酸性,AMitP可以選擇性的通過靜電作用與腫瘤細(xì)胞結(jié)合,并通過兩親結(jié)構(gòu)與腫瘤細(xì)胞膜作用,從而殺死腫瘤細(xì)胞。

    圖3 酸活化抗菌肽AMitP分子結(jié)構(gòu)Fig.3 Molecular structure of acid-activated antimicrobial peptide AMitP

    Chen等[26]在MP-C的N末端添加細(xì)胞穿透肽TAT(RKKRRQRRR),設(shè)計(jì)出MP類似物tMP-C(RKKRRQRRRLNLKALLAVAKKIL-NH2)。tMP-C與母肽相似,保持了較高的抑菌活性,且具有更強(qiáng)的抗腫瘤細(xì)胞活性(對5種測試腫瘤細(xì)胞的IC50小于4 μmol/L),但tMP-C對正常細(xì)胞HMEC-1的IC50<10 μmol/L。tMP-C抗腫瘤活性是母肽的5倍,但其膜滲透作用大大降低,推測tMP-C抗腫瘤活性可能與線粒體膜的作用有關(guān)。

    Transportan(TP)由一個(gè)賴氨酸殘基將甘丙肽(galanin)N端的12位氨基酸與MP相連構(gòu)成。TP能跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)生物大分子物質(zhì)如綠色熒光蛋白,它具有富集于細(xì)胞膜附近、高效攜帶大分子進(jìn)入細(xì)胞的能力[28]。TP包含了甘丙肽N端的活性片段,可被甘丙肽受體識別。此外,研究顯示,TP對人黑色素瘤細(xì)胞膜上的基底GTP酶有抑制作用,雖然產(chǎn)生這種抑制作用所需的TP濃度通常高于轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)所需的濃度,但這個(gè)特性仍是載體肽的重要瑕疵。為了減小TP與甘丙肽受體的親和力以及它與G蛋白的相互作用。Soomets等[29]合成了TP的9條類似物,研究發(fā)現(xiàn),類似物TP10即使在高濃度下也不會影響基底GTP酶活性,也不會被甘丙肽受體識別,這些特性使得TP10有望成為新的、副作用顯著減小的載體肽。TP10含有21個(gè)氨基酸殘基,由1個(gè)賴氨酸將長度為6個(gè)氨基酸的甘丙肽片段和14個(gè)氨基酸的MP連接而成。與母肽TP相比,TP10的穿膜能力更強(qiáng),并且不會抑制RIN-m5F細(xì)胞膜基底GTP酶活性,毒性更低。近年來有研究報(bào)道,TP10具有較好的細(xì)胞選擇性,能優(yōu)先進(jìn)入微生物細(xì)胞膜并殺死細(xì)菌(S.aureus:MIC 7.33 μmol/L,E.coli:MIC 7.33 μmol/L,C.albicans:MIC 7.33 μmol/L)及耐藥菌(A.baumannii:MIC 3.67 μmol/L),卻幾乎不會損傷哺乳動(dòng)物細(xì)胞[30]。這些研究顯示MP雜合肽TP10具有發(fā)展為抗微生物尤其是抗多重耐藥細(xì)菌的新型抗菌物質(zhì)的潛力。Rusiecka等[31]發(fā)現(xiàn)TP10對人類宮頸癌細(xì)胞和人類骨肉瘤Os143b細(xì)胞株具有體外抗癌活性。

    2 Mastoparan的定量構(gòu)效關(guān)系研究

    多肽的分子結(jié)構(gòu)與生物活性密切相關(guān),因此,結(jié)構(gòu)參數(shù)是生物活性改良研究中的重要參考指標(biāo)。定量構(gòu)效關(guān)系QSAR(quantitative structure activity relationship)是應(yīng)用數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法來定量研究分子結(jié)構(gòu)與特定的生物活性之間的關(guān)系。它是多肽設(shè)計(jì)的一種有力工具,也是在缺乏準(zhǔn)確作用機(jī)制情況下,有效避免盲目改造的合理方法。良好的QSAR模型生成取決于訓(xùn)練集和測試集在結(jié)構(gòu)多樣性和屬性值分布方面的質(zhì)量。由于MP具有卓越的藥理作用、相對簡單的結(jié)構(gòu),已經(jīng)成為QSAR研究的一種模型肽。

    基于?e?ovsky等[32]測得的40條MP及其衍生物對枯草芽孢桿菌Bacillus subtillis的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)數(shù)據(jù),早在2011年Avram等采用多元線性回歸分析(multiple linear regression analysis, MLRA)對MP進(jìn)行了二維定量構(gòu)效關(guān)系(2D-QSAR)研究,并建立了MP結(jié)構(gòu)特征(理化參數(shù))與抑制枯草芽孢桿菌MIC值的相關(guān)模型[33],其中預(yù)測效果較好的5條回歸方程見表2,該模型對MP衍生物的預(yù)測相關(guān)系數(shù)為0.81~0.83。

    表2 MP二維定量構(gòu)效關(guān)系模型Table 2 Two dimensional QSAR model of MP

    隨著3D-QSAR技術(shù)在生物學(xué)上的成功應(yīng)用,2012年Avram等[34]在前期研究基礎(chǔ)上,利用比較分子力場分析法(comparative molecular field analysis, CoMFA)和比較分子相似性指數(shù)分析法(comparative molecular similarity in-dices analysis,CoMSIA)重新對MP構(gòu)建模型,用以評估氫鍵供體/受體、疏水性、空間性和靜電性在MP對枯草桿菌抗菌活性中的貢獻(xiàn)值,由于該方法對分子的排列很敏感,作者考慮了兩種疊加方式:Cα原子的疊加(QSAR模型1)和骨架原子的疊加(QSAR模型2),從而將肽疊加在最有效的結(jié)構(gòu)上。該研究獲得良好的統(tǒng)計(jì)參數(shù),從結(jié)果來看,用較少原子結(jié)構(gòu)對準(zhǔn)的方法(模型1),預(yù)測結(jié)果更加有效,非常接近實(shí)驗(yàn)值(pMIC值偏差在0.7以內(nèi))。

    2015年,Mariya等[35]把氨基酸作為多肽的基本單位,即:端點(diǎn)=功能,采用蒙特卡洛方法計(jì)算MP的QSAR模型,利用3種模型預(yù)測33種MP衍生物對枯草芽孢桿菌的抑菌活性,預(yù)測結(jié)果優(yōu)于2D-QSAR模型。

    QSAR模型的預(yù)測精度取決于樣本的數(shù)量、訓(xùn)練集和測試集的恰當(dāng)選擇以及選擇最相關(guān)的分子描述符和合適的統(tǒng)計(jì)方法等,其中選擇最合適的分子描述符是獲得準(zhǔn)確QSAR模型的先決條件,但有效分子描述符的選擇依賴于問題,并沒有通用規(guī)則。本文提到的三種建模方式各有優(yōu)缺點(diǎn),多肽的各種結(jié)構(gòu)參數(shù)并非獨(dú)立發(fā)揮作用,而是密切相關(guān)的,一種因素的改變通常會導(dǎo)致其他因素的變化。因此,在多肽設(shè)計(jì)時(shí),應(yīng)以構(gòu)效關(guān)系為基礎(chǔ),綜合權(quán)衡各項(xiàng)結(jié)構(gòu)參數(shù),以期獲得生物活性最優(yōu)良的多肽。

    3 總結(jié)與展望

    胡蜂毒素的C端非常保守,通常由疏水的亮氨酸占據(jù),研究人員將MP衍生物C端的亮氨酸用絲氨酸替換后,將不會引起肥大細(xì)胞脫顆粒;本實(shí)驗(yàn)室將胡蜂毒素與天蠶素A進(jìn)行雜合設(shè)計(jì),設(shè)計(jì)雜合肽的抗細(xì)菌活性比MP-L提高4~8倍,且溶血活性大大降低。由以上可知,對胡蜂毒素保守序列的合理修改或重新設(shè)計(jì)將極大改善其活性,有助于胡蜂毒素在微生物防治和藥物開發(fā)的利用。隨著胡蜂毒素相關(guān)研究的深入,人們對其結(jié)構(gòu)特征、生理作用及生物活性有了新的認(rèn)識,在此基礎(chǔ)上進(jìn)行的分子改造目標(biāo)也更加明確。一方面,通過分子改造探索其在抗腫瘤和抗耐藥菌方面的潛力;另一方面,胡蜂毒素具有惰性穿膜肽的特質(zhì),通過分子改造,可以豐富穿膜肽的種類,并作為一類先導(dǎo)化合物用于開發(fā)安全有效的多肽藥物。在過去的十多年里,天然的、改良的或雜合的MP已經(jīng)被用作許多神經(jīng)疾病的潛在藥物進(jìn)行研究[36]。目前MP分子改造的方法和理念已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)變,更趨向于通過結(jié)構(gòu)活性關(guān)系研究,利用計(jì)算機(jī)輔助的理性或半理性設(shè)計(jì),這將大大提高分子改造的效率。

    蜂毒用于治療疾病已有幾百年的歷史,可有效地治療多種疾病。我國擁有非常豐富的蜂毒資源,但對于蜂毒多肽的藥理以及臨床應(yīng)用的研究、開發(fā)和利用卻還不夠深入。以胡蜂毒素Mastoparan為代表的蜂毒多肽具有廣泛的藥理作用以及臨床應(yīng)用價(jià)值,應(yīng)當(dāng)加速開展蜂毒多肽在臨床醫(yī)學(xué)、生物工程以及其他領(lǐng)域的各項(xiàng)研究。

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