側(cè)腦室注射脂多糖建立腦微出血動物模型研究

吳倩 張恒 盧永婷 李春艷 賈文姬 鮑天昊 韓劍虹

腦微出血(cerebral microbleeds，CMBs)是一種腦小血管病(cerebral small vessel disease，CSVD)[1]，其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，主要是由于腦微小血管壁損害導(dǎo)致血管內(nèi)紅細(xì)胞等成分外滲并沉積于腦實質(zhì)內(nèi)，長期亞急性損傷可導(dǎo)致患者認(rèn)知功能下降。動物模型研究對全面認(rèn)識和了解疾病機(jī)制和病因具有重要作用。目前CMBs動物模型主要包括腹腔注射脂多糖(LPS)全身炎癥誘導(dǎo)法[2]、腦內(nèi)定向注射細(xì)菌膠原酶誘導(dǎo)法[3]和激光脈沖靶向損傷血管誘導(dǎo)法[4]，這些方法均存在一定不足：如腹腔注射LPS全身炎癥誘導(dǎo)CMBs模型無法進(jìn)行動物行為學(xué)評估，其原因是難以區(qū)分行為學(xué)表現(xiàn)差異是由CMBs造成還是全身炎癥導(dǎo)致，未能排除軀體因素的干擾；腦內(nèi)定向注射細(xì)菌膠原酶誘導(dǎo)出的微出血灶僅存在注射位點，微出血病灶較少，與臨床上CMBs多部位多發(fā)的特點存在差異；而激光脈沖靶向損傷血管造模方法對條件要求和成本相對較高而應(yīng)用受限。

研究表明神經(jīng)炎癥是各種神經(jīng)退行性疾病的機(jī)制之一[5]，LPS可通過與Toll樣受體4(Toll-like receptors 4，TLR4)結(jié)合激活核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥發(fā)生，導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞遷移增殖和星形膠質(zhì)細(xì)胞激活[6]，膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)作為反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物在炎癥損傷時表達(dá)增多，已成為評估星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性的一個重要標(biāo)志物[7]。因此，本研究運用腦立體定位儀向側(cè)腦室注射LPS誘發(fā)神經(jīng)炎癥反應(yīng)從而誘導(dǎo)CMBs，嘗試建立一種新型的CMBs動物模型。

1 材料和方法

1.1 動物雄性SPF級SD大鼠共24只，體質(zhì)量250～300 g，購自昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部〔SCXK(滇)K2020-0004〕。室內(nèi)飼養(yǎng)，溫度20～26℃，12 h/12 h晝夜明暗交替，自由飲水及進(jìn)食。將大鼠隨機(jī)分為對照組以及低、中、高劑量LPS模型組，每組6只。該研究經(jīng)昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)(kmmu2021553)。

1.2 主要試劑與儀器LPS(L2630)、蘇木素(H3136)、伊紅(230251)均購自美國Sigma公司；抗GFAP小鼠單抗(一抗，GB12096)購自武漢塞維爾生物科技有限公司；AF488標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(二抗，ab150113)購自英國Abcam公司；大鼠腦立體定位儀、微量注射器購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1CMBs模型制備：采用右側(cè)腦室單次注射LPS法進(jìn)行造模。將大鼠以3%(質(zhì)量濃度)戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(35 mg/kg)，頭頂備皮、碘伏消毒后將大鼠固定于腦立體定位儀上，頭頂正中作一長約1.5 cm手術(shù)切口，參照Paxinos &Watson大鼠腦立體定位圖譜[8]，以前囟為原點，向后0.8 mm、矢狀縫向右1.5 mm為注射位點，打孔后微量注射器緩慢進(jìn)針，進(jìn)針深度3.8 mm。低、中、高劑量LPS模型組大鼠分別給予50、75、100 μg LPS(均10 μL)，給藥速度1 μL/min，注射完畢后留針10 min，緩慢退針后縫合傷口，術(shù)后置于加熱墊待大鼠蘇醒后放回飼養(yǎng)籠繼續(xù)飼養(yǎng)。對照組以相同方法給予等體積生理鹽水。實驗過程中若出現(xiàn)大鼠死亡，用備用鼠補充至每組6只，并記錄大鼠存活率。

1.3.2新物體識別實驗：根據(jù)Leger等[9]方法進(jìn)行新物體識別檢測。給藥后第1天為適應(yīng)階段，將大鼠置空箱子內(nèi)5 min讓其自由探索，之后放回籠子。給藥后第2天進(jìn)入熟悉和測試階段，箱子內(nèi)放置2個相同的物體，讓老鼠探索物體10 min后放回籠子，1 h后其中一個物體替換為不同的新物體，再次讓老鼠探索2個物體10 min，記錄老鼠嗅探新物體和熟悉物體的時間。按下列公式計算大鼠的辨別指數(shù)：辨別指數(shù)=探索新物體的時間/探索兩個物體的總時間。

1.3.3曠場實驗：在四周有固定標(biāo)識物件的環(huán)境中，將大鼠單獨放置在一個方形場地(100 cm×100 cm×20 cm)讓其自由活動。采用SuperMaze動物行為學(xué)視頻分析系統(tǒng)跟蹤大鼠4 min，記錄大鼠運動距離評價大鼠的水平運動情況；同時統(tǒng)計大鼠4 min內(nèi)站立次數(shù)，記為大鼠垂直運動情況。每只大鼠測試后用75%酒精擦拭場地去味。

1.3.4CMBs檢測：包括腦表面微出血和病理性腦微出血(cerebral microhemorrhages，CMH)。于給藥48 h(即行為學(xué)評估結(jié)束)后，給予大鼠腹腔注射致死劑量的戊巴比妥鈉，取全腦組織置4%(質(zhì)量濃度)多聚甲醛中固定72 h。采用體視顯微鏡觀察并記錄大鼠腦表面微出血點，隨后將腦組織脫水、石蠟包埋，常規(guī)制備冠狀切片，厚度5 μm，每隔8張切片取相鄰2張切片為一組，每只大鼠共收集45組切片。每組切片中的一片用于HE染色檢測CMH，另一片用于免疫熒光檢測GFAP陽性表達(dá)。HE染色按照脫蠟至水、蘇木素染細(xì)胞核、伊紅染細(xì)胞質(zhì)、脫水封片的步驟依次進(jìn)行，染色后置光學(xué)顯微鏡下觀察沉積于腦實質(zhì)的紅細(xì)胞并拍照。根據(jù)Fisher教授建議[2]，以微出血數(shù)量、微出血大小描述和記錄CMH情況。取每只大鼠45張腦切片微出血個數(shù)的中位數(shù)表示每只大鼠CMH數(shù)量。運用NIH ImageJ軟件分析每張切片CMH總面積，取每只大鼠45張腦切片微出血面積的中位數(shù)表示每只大鼠CMH面積。

1.3.5免疫熒光法檢測腦組織GFAP表達(dá)：石蠟切片脫蠟至水后經(jīng)PBS溶液漂洗、檸檬酸鹽緩沖液抗原修復(fù)、PBS溶液漂洗、5%(體積分?jǐn)?shù))羊血清封閉、加1∶200稀釋的抗GFAP小鼠單抗、PBST漂洗、加1∶500稀釋的AF488標(biāo)記山羊抗小鼠IgG H&L、PBST漂洗、DAPI染色封片等步驟依次進(jìn)行。置熒光顯微鏡觀察GFAP表達(dá)情況，玻片通過掃描儀掃描后使用NIH ImageJ軟件量化每張切片總陽性免疫反應(yīng)面積，以每張切片陽性免疫反應(yīng)面積的均值表示每只大鼠GFAP表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；非正態(tài)分布的計量資料采用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗，兩兩比較采用Bonferroni校正檢驗水準(zhǔn)；采用Spearman相關(guān)性分析GFAP陽性表達(dá)與CMH數(shù)量、大小的相關(guān)性。以P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠存活率對照組和低劑量LPS組大鼠均存活，存活率100.0%，中劑量LPS組死亡1只，存活率83.3%，高劑量LPS組死亡3只，存活率50.0%。

2.2 腦表面微出血情況對照組大鼠無腦表面微出血，低、中、高劑量LPS模型組大鼠均存在明顯的腦表面微出血，中、高劑量LPS模型組腦表面微出血數(shù)量較對照組明顯增多(P<0.05)，而高、中劑量LPS模型組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)果見圖1、表1。

注：LPS：脂多糖；A：對照組；B：低劑量LPS模型組；C：中劑量LPS模型組；D：高劑量LPS模型組

2.3 病理學(xué)檢測微出血HE染色結(jié)果顯示，與對照組比較，低、中、高劑量LPS模型組大鼠CMH數(shù)量更多、面積更大(均P<0.05)；與低劑量LPS模型組比較，中、高劑量LPS模型組CMH數(shù)量更多、面積更大(均P<0.05)；中、高劑量LPS模型組CMH數(shù)量、面積比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)果見圖2、表1。

表1 各組大鼠腦表面微出血及CMH數(shù)量和大小比較情況〔Md(QU-QL)〕

注：CMH：腦微出血；A：對照組大腦組織未見微出血灶；B：中劑量LPS模型組腦干組織微出血病灶(箭頭所示)；C：中劑量LPS模型組大腦組織微出血病灶(箭頭所示)

2.4 非空間記憶認(rèn)知功能及運動功能情況新物體識別實驗結(jié)果顯示，低、中、高劑量LPS模型組辨別指數(shù)有小于對照組的趨勢，但4組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。曠場實驗結(jié)果顯示，4組大鼠水平運動距離和垂直運動次數(shù)間比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(均P>0.05)。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠新物體識別實驗和曠場實驗結(jié)果比較

2.5 各組大鼠腦組織GFAP表達(dá)免疫熒光結(jié)果顯示，對照組以及低、中、高劑量LPS模型組大鼠腦組織GFAP熒光陽性面積比較有統(tǒng)計學(xué)差異(F=80.458，P=0.000)，且隨LPS劑量增加，大鼠腦組織GFAP熒光陽性面積增加(均P<0.05)。結(jié)果見表2、圖3。

注：GFAP：膠質(zhì)纖維酸性蛋白；A：對照組；B：低劑量LPS模型組；C：中劑量LPS模型組；D：高劑量LPS模型組

2.6 腦組織GFAP表達(dá)與CMH的相關(guān)性GFAP陽性表達(dá)面積與CMH數(shù)量和大小呈正相關(guān)(r=0.80，r=0.74；均P<0.05)。見圖4。

注：GFAP：膠質(zhì)纖維酸性蛋白；CMH：腦微出血

3 討論

本研究在既往針對CMBs動物模型研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，嘗試通過側(cè)腦室注射LPS誘發(fā)神經(jīng)炎癥建立CMBs模型，結(jié)果顯示中、高劑量LPS模型組腦表面微出血數(shù)量較對照組增多，且低、中、高劑量LPS模型組腦組織CMH數(shù)量較對照組增多，面積增大，提示造模成功。同時，本研究對造模大鼠進(jìn)行了非空間記憶認(rèn)知功能和運動功能的檢測，為后續(xù)進(jìn)一步研究CMBs與認(rèn)知功能的關(guān)系提供了參考。

既往研究證實神經(jīng)炎癥是導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病的重要病因，是治療神經(jīng)退行性疾病的重要靶點。炎癥可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷和血-腦屏障通透性增加[10]，使紅細(xì)胞等血管內(nèi)物質(zhì)外滲并沉積于組織導(dǎo)致CMBs的形成。炎癥引發(fā)早期和持續(xù)的周圍小膠質(zhì)細(xì)胞遷移和星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，導(dǎo)致后續(xù)的樹突變性和神經(jīng)元壞死[11]，從而導(dǎo)致認(rèn)知功能下降。本研究結(jié)果顯示，隨著LPS濃度升高，LPS模型大鼠新物體辨別指數(shù)呈下降趨勢，提示大鼠經(jīng)LPS干預(yù)后其認(rèn)知功能可能已開始發(fā)生改變，但尚未達(dá)統(tǒng)計學(xué)差異，其原因可能為本研究誘發(fā)的是急性CMBs模型，而認(rèn)知功能受損與慢性持續(xù)損傷關(guān)系密切，因此大鼠尚未出現(xiàn)具有統(tǒng)計學(xué)差異的認(rèn)知行為學(xué)改變。有關(guān)腦室單次注射LPS法造模大鼠認(rèn)知功能的確切變化可參考Fisher教授團(tuán)隊的腹腔注射LPS的CMBs模型思路[2]，從造模后2 d(急性期)和造模后7 d(亞急性期)兩個時間點分別探索模型大鼠的認(rèn)知功能變化。本研究曠場實驗結(jié)果顯示，4組大鼠在水平運動距離和垂直運動次數(shù)兩方面比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這與Lee等[12]研究結(jié)果一致，表明側(cè)腦室注射LPS未影響動物的運動功能，進(jìn)一步提示大鼠的行為表現(xiàn)差異是由記憶認(rèn)知功能引起而非病理因素等引起，可排除軀體因素的干擾。本研究結(jié)果顯示，大鼠腦組織GFAP表達(dá)水平與CMH的數(shù)量和大小呈正相關(guān)，表明CMBs與星形膠質(zhì)細(xì)胞激活有關(guān)。星形膠質(zhì)細(xì)胞可上調(diào)突觸破壞性基因，在神經(jīng)炎癥中具有損傷效應(yīng)，隨著炎癥反應(yīng)愈烈，可導(dǎo)致微出血數(shù)量越多、范圍越廣。

本研究中，對照組與低劑量LPS組大鼠均存活，而中、高劑量LPS模型組大鼠有死亡情況；與低劑量LPS組比較，中劑量LPS組大鼠CMH數(shù)量明顯增多，面積增大，而中、高劑量組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)合大鼠存活率和微出血誘導(dǎo)情況，作者推薦75 μg劑量LPS側(cè)腦室注射可作為誘導(dǎo)大鼠CMBs相對理想造模方法。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，運用腦立體定位儀側(cè)腦室單次注射LPS方法可誘導(dǎo)大鼠CMBs模型，其中75 μg劑量LPS誘導(dǎo)CMBs較為理想。與現(xiàn)有的CMBs動物模型方法相比，側(cè)腦室單次注射LPS方法既可滿足CMBs隨機(jī)多發(fā)的特點又可以滿足行為學(xué)的評估。但本研究目前尚存以下不足：未進(jìn)行影像學(xué)觀察；所造模型為急性CMBs模型，而臨床CMBs大多呈亞急性或慢性。因此，今后如能借助SWI影像學(xué)技術(shù)可能會更全面、更精確地觀察大鼠CMBs情況；此外，進(jìn)一步探索LPS劑量和注射頻率以制備更符合臨床的CMBs動物模型，可為深入研究CMBs的病理生理機(jī)制提供參考。