葡萄根癌病研究進展及防治措施

袁麗芳，尹向田，王鵬飛，李廷剛，蔣錫龍，湯小寧，韓金濤*，魏彥鋒*

（1. 山東省葡萄研究院，山東濟南 250100；2. 山東省農(nóng)藥科學研究院，山東濟南 250100）

我國是葡萄大國，2020年栽培面積達76.75萬 hm2，排世界第二位。葡萄根癌病是常見的細菌性病害，在我國葡萄產(chǎn)區(qū)發(fā)生普遍，主要為害樹體主干，影響樹體健康生長，給葡萄產(chǎn)業(yè)帶來了巨大損失。

葡萄根癌病由葡萄土壤桿菌（Allorhizobium vitis）引起，植株染病后生長衰弱、葡萄品質(zhì)下降，產(chǎn)量降低，嚴重者植株死亡[1-3]。此外，該病原多從傷口進行侵染，因此葡萄嫁接苗存在感病風險，若用帶菌苗木建園，一旦發(fā)病只能銷毀。對葡萄根癌病進行快速診斷和檢測是進行有效預防的前提，目前農(nóng)業(yè)防治和生物防治是防治該病的首要方法。本文對國內(nèi)外葡萄根癌病的研究進展進行綜述，并提出常規(guī)防治措施，以期為葡萄根癌病的后續(xù)研究提供幫助。

1 危害及田間癥狀

葡萄根癌病（也稱冠癭病，crown gall disease）是葡萄生產(chǎn)中的一種毀滅性細菌病害，給世界范圍內(nèi)的葡萄育苗基地和種植園帶來巨大的經(jīng)濟損失[3-5]。在我國東北、華北、西北、黃河及長江流域地區(qū)均有根癌病發(fā)生，部分葡萄園發(fā)病率高達80%～90%，產(chǎn)量損失30%～70%，嚴重時甚至絕收[4-5]。

葡萄根癌病的典型癥狀是形成腫瘤[6-7]。該病的病原菌主要存活在病殘體或土壤中，通過傷口侵入植物體內(nèi)，由木質(zhì)部進行傳輸?shù)竭_植物細胞，使細胞產(chǎn)生過量的生長激素，從而形成瘤狀物[8]。葡萄幼苗期，在嫁接部位可形成大小不一的瘤狀物，初期為黃豆粒大小，外皮綠色，隨著瘤狀物逐漸膨大呈現(xiàn)直徑數(shù)厘米的球形，表面粗糙，內(nèi)部組織逐漸木質(zhì)化，后期顏色變?yōu)楹稚蛏詈稚ｋS著葡萄樹齡的增加，除主干外，瘤狀物可出現(xiàn)在主枝、側(cè)枝和結(jié)果母枝上[3]。此外，根癌病病原菌可破壞葡萄植株根冠對水和礦物質(zhì)的吸收，影響植株形成層和維管束對營養(yǎng)的運輸，導致植株營養(yǎng)不良，枝梢干枯，嚴重時可導致藤蔓死亡。

2 病原菌

2.1 病原菌的種類及分類

土壤桿菌包括根癌土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens）、發(fā)根土壤桿菌（A. rhizogenes）、懸鉤子土壤桿菌（A. rubi）和葡萄土壤桿菌（A. vitis）[5,9-10]。當菌株攜帶腫瘤誘導質(zhì)粒（tumor-inducing plasmid, Ti plasmid，Ti質(zhì)粒）時就引起根癌病。根據(jù)根瘤中誘導產(chǎn)生冠癭堿的類型，Ti質(zhì)?？煞譃檎卖~堿型（octopine）、章魚堿/黃瓜堿型（octopine/cucumopine）、胭脂堿型（nopaline）、農(nóng)桿堿型（agropine）和vitopin型[3]。目前，基于基因組信息恢復并修訂了土壤桿菌屬（Agrobacterium）和其它根瘤菌屬（Allorhizobium）的分類地位，根癌土壤桿菌和懸鉤子土壤桿菌屬于土壤桿菌屬，發(fā)根土壤桿菌劃歸在根瘤菌屬（Rhizobium）。葡萄土壤桿菌（Allorhizobium vitis），之前命名為Agrobacterium vitis、Agrobacterium biovar 3、Rhizobium vitis，被重新劃分為異根瘤菌屬（Allorhizobium）[10-14]。

葡萄根癌病的病原菌主要是不同冠癭堿類型的葡萄土壤桿菌[15-17]。在少數(shù)情況下，根癌土壤桿菌和發(fā)根土壤桿菌也可以引起葡萄根癌病[18-22]。葡萄土壤桿菌最初由Ophel和Kerr于1990年定名為Agrobacterium vitis，該病原菌分布廣泛，許多國家包括澳大利亞[23]、保加利亞[24]、德國[25]、意大利[4]、日本[26]、塞爾維亞[27]、西班牙[28]、美國[29]、俄羅斯[30]和摩洛哥[31]等，均分離鑒定到該病原菌。在我國山東、河北及新疆等地區(qū)引起葡萄根癌病的病原菌為葡萄土壤桿菌章魚堿型[32-34]。

2.2 形態(tài)特征及生理生化特性

葡萄根癌病是革蘭氏陰性菌，呈短桿狀，大小為0.8～1.0 μm×3.0 μm，具周生鞭毛；菌落乳白色，圓形，邊緣整齊。最適生長溫度28 ℃，高于37 ℃不能生長，可在pH4～10范圍生長，耐受0～3%的NaCl[35]。不同于根癌土壤桿菌和發(fā)根土壤桿菌，該病原菌多數(shù)可在pH4.5條件下分解果膠，但在pH7條件下缺乏運動性（表1）[32,36]。

表1 葡萄土壤桿菌、根癌土壤桿菌和發(fā)根土壤桿菌的生理生化特性Table 1 Comparative analysis of physiological and biochemical characteristics of A. vitis with A. tumefaciens and A. rhizogenes

2.3 基因組信息

目前，全基因組測序的葡萄土壤桿菌菌株共有9株，分別是S4、VAR03-1、VAT03-9、F2/5、CG412和VAR06-30等（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse/#!/prokaryotes/1215/）。葡萄土壤桿菌的基因組大小為5.57～6.32 Mb，包含有兩個環(huán)形染色體和1～5個質(zhì)粒，GC含量為57.48%～58.61%。根癌土壤桿菌和發(fā)根土壤桿菌大多含有一個環(huán)形染色體和一個線性染色體，GC含量為58.92%～59.96%，與葡萄土壤桿菌相比較高（表2）[37]。葡萄土壤桿菌的Ti質(zhì)粒大小約200 kb，GC含量56%～57%，包含轉(zhuǎn)運DNA（transferred DNA，T-DNA）、毒力區(qū)域（virulence region）、冠癭堿代謝基因（opine catabolism genes）、復制區(qū)（replication region）和可結(jié)合轉(zhuǎn)運的基因（conjugative transfer genes）[38]。Ti質(zhì)粒屬于repABC質(zhì)粒家族，含有兩套獨立的TypeIV分泌系統(tǒng)，第一個T4SS系統(tǒng)（vir）是負責將T-DNA從細菌轉(zhuǎn)移到宿主植物，而第二個系統(tǒng)（tra/trb）則介導Ti質(zhì)粒的偶聯(lián)轉(zhuǎn)移。Ti質(zhì)粒的結(jié)合轉(zhuǎn)移由群體感應（quorum sensing，QS）調(diào)控，受冠癭堿的產(chǎn)生而誘導。

表2 土壤桿菌基因組信息比較Table 2 Comparison of genomes information of Agrobacterium sp.

2.4 寄主范圍

土壤桿菌是引起植物根癌病的一種世界范圍內(nèi)的致病菌，可以引起包括葡萄在內(nèi)的93科331屬的643個種的植物根癌病[39-40]。根癌土壤桿菌可以侵染多種植物，包括葡萄、蘋果、櫻桃、獼猴桃、玫瑰、番茄等[41-44]；發(fā)根土壤桿菌可以侵染蘋果、梨、扁桃和櫻桃[45-48]；葡萄土壤桿菌主要侵染葡萄，還可以侵染香蕉，引起香蕉葉枯病[49]。葡萄土壤桿菌能在向日葵、煙草、蕃茄、曼陀羅、懸鉤子等幾種植物上形成癭瘤，通常采用這幾種植物為指示植物在溫室內(nèi)做致病性測定[38]。

3 葡萄土壤桿菌的致病機理

通過傷口侵入寄主體內(nèi)，將自身Ti質(zhì)粒上的T-DNA整合到寄主細胞核DNA中，從而引發(fā)葡萄根癌病。葡萄土壤桿菌的致病能力主要由Ti質(zhì)粒決定，Ti質(zhì)粒包含4個保守的功能基因區(qū)：T-DNA區(qū)，包括致瘤基因區(qū)和冠癭堿合成相關基因區(qū)；毒性Vir區(qū)，包括Vir A、Vir B、Vir C、Vir D、Vir E、Vir F六個遺傳位點；Tra區(qū)，促使細菌質(zhì)粒在細菌間的接合轉(zhuǎn)移和群體信號感應；rep區(qū)，參與質(zhì)粒復制。T-DNA區(qū)的冠癭堿合成相關基因，包括章魚堿合成相關基因（ocs）、黃瓜堿型合成相關基因（cus）、胭脂堿合成相關基因（nos）、精氨酸合成相關基因（vis）和農(nóng)桿菌素堿合成相關基因（acs），它們參與冠癭堿合成，為病原菌提供賴以生存、繁殖所必需的營養(yǎng)和能量；致瘤基因區(qū)基因調(diào)控生長素和細胞分裂素的合成，生長素的合成需要基因iaaM和iaaH參與，iaaM編碼色氨酸側(cè)鏈氧化酶（tryptonphan side-chain oxidase），催化色氨酸成吲哚乙酰胺（indoleacetamide,IAM）；iaaH編碼吲哚-3-乙酰胺水解酶，催化IAM成吲哚乙酸（indoleacetic acid，IAA），ipt是細胞分裂素合成的必需基因，在一些菌株中，T-DNA中不存在iaaM、iaaH和ipt，6b基因具有和iaaM等相似的功能，生長素和細胞分裂素的過量合成打破了寄主植物細胞內(nèi)激素原有的平衡，導致植物細胞無限制地增生，進而形成腫瘤[38,41]。

表3 葡萄土壤桿菌的特異性引物信息Table 3 Specific primer information of A. vitis

此外，多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase）和游動性是葡萄土壤桿菌所具有的特性，是該病原菌中非常重要的致病因子[50]。葡萄土壤桿菌可以產(chǎn)生多聚半乳糖醛酸酶，誘導葡萄根部壞死[18,51-52]；群體感應系統(tǒng)是細菌的一種調(diào)控機制，參與調(diào)控多種生理過程，包括營養(yǎng)或位點競爭、毒性基因的表達、細菌Ti質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移、細菌趨化性和運動性、生物膜的形成、定殖能力等。游動性葡萄土壤桿菌具有在葡萄上穩(wěn)定定殖的重要機制，其游動性是由群體感應系統(tǒng)信號分子N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯類（N-acyl-homoserine lactone signal molecules）所調(diào)控。研究表明，葡萄土壤桿菌aviR（屬于群體感應luxR家族）基因由于缺失突變體菌株喪失了表面游動性[53]。

4 葡萄土壤桿菌的鑒定及檢測

葡萄主要依靠扦插和嫁接的方式進行繁殖，帶菌的苗木是葡萄根癌病快速傳播的重要途徑。葡萄土壤桿菌主要生活在葡萄根冠及周圍土壤中，能在葡萄藤蔓上生存和繁殖。該病原菌通過木質(zhì)部在葡萄體內(nèi)擴展，對植株進行系統(tǒng)侵染。因此，快速準確的檢測技術是預防該病的前提。近些年，分子生物學檢測技術的快速發(fā)展為病原菌的檢測奠定了基礎。相比傳統(tǒng)的特異性檢測培養(yǎng)基，PCR檢測技術因具有快速、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點被廣泛應用?；赑CR檢測技術建立的葡萄土壤桿菌的檢測體系有特異性引物檢測，該技術可以定性鑒定葡萄土壤桿菌菌株[4,54-55]；熒光定量PCR（qPCR）檢測技術可以快速對葡萄土壤桿菌進行定性和定量分析，檢測用時短且靈敏度高、特異性強[4,56]；磁珠捕獲雜交定量PCR（Magnetic Capture Hybridization, MCH-qPCR）指DNA提取經(jīng)磁珠捕獲雜交處理，檢測結(jié)果比直接進行熒光定量靈敏度提高1000倍[57-58]；數(shù)字微滴PCR（ddPCR）不依賴基因擴增循環(huán)數(shù)和內(nèi)參基因即可確定基因拷貝數(shù)[59]；環(huán)介導等溫擴增（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）檢測技術不需要精準的PCR儀，在恒溫水浴下即可完成，其檢測結(jié)果可進行可視化觀察[60]。Lim等[61]根據(jù)葡萄根癌病菌葡萄土壤桿菌的特異性DNA片段設計引物，利用巢式PCR進行檢測，其靈敏度為2 cfu·mL-1，能夠有效檢測土壤中的病原菌。Nguyen-Huu[62]設計了5對引物分別進行熒光定量PCR檢測，這5對引物均能特異地檢測出葡萄土壤桿菌，靈敏度為100 cfu·mg-1。施文驍[34]建立的LAMP技術可用于田間快速檢測，對葡萄土壤桿菌DNA的靈敏度為20 pg，60～90 min就可完成。

5 綜合防治

目前，葡萄根癌病最有效的防治措施是建立無病原菌的育苗基地，因為沒有特別有效的防治方法。植株一旦染病將導致減產(chǎn)、甚至植株死亡。近年來，針對葡萄根癌病主要通過農(nóng)業(yè)防治和生物防治進行。

5.1 農(nóng)業(yè)防治

建園時使用無毒苗木，避免引進帶病的種苗是預防根癌病的前提。選育無病苗木和栽植抗病品種是預防葡萄根癌病的重要途徑[63]。目前，鮮食葡萄中‘紅地球’‘玫瑰香’‘巨峰’等品種高度感病，‘龍眼’‘康太’等品種對根癌病有一定抗性；釀酒葡萄中‘霞多麗’‘赤霞珠’‘黑比諾’也有一定抗性。此外，根癌病抗性葡萄砧木有‘河岸2號’‘河岸6號’‘河岸9號’等[64-65]。因此，對葡萄根癌病菌的早期診斷，及時清除和銷毀病苗，并加強田間管理，增施有機肥和礦質(zhì)營養(yǎng)，盡量避免在農(nóng)事操作時造成傷口，都可以減少根癌病的發(fā)生。

5.2 生物防治

生物防治是根癌病的有效措施，非致病菌A.radiobacterK84可以有效防治不同寄主植物的根癌病，該菌產(chǎn)生的細菌素（農(nóng)桿菌素）對根癌病菌有抑制作用，但是對于葡萄土壤桿菌引起的葡萄根癌病無防效[66]。無致病性的A. vitisE26、VAR03-1和ARK-1可作為生防菌來抑制土壤桿菌的生長和葡萄植株腫瘤的形成[67-78]。E26菌株可以穩(wěn)定的產(chǎn)生細菌素，其在溫室和田間對葡萄根癌病有顯著的防治效果，并且對土壤環(huán)境及微生物無風險。分離自葡萄上的A. vitisF2/5能抑制致病的葡萄土壤桿菌，但同時可以引起葡萄根部壞死[69]。室內(nèi)試驗表明，假單孢菌（Pseudomonasspp.）和水生拉恩氏菌（Rahnella aquatilisHX2）可以抑制指示植物根瘤的形成[70]。此外，商品生防制劑枯草芽孢桿菌Bacillus subtilisSR63和木霉菌Trichoderma asperellumT1可以有效抑制葡萄土壤桿菌。

多聚半乳糖醛酸酶可以降解葡萄木質(zhì)部細胞壁的組成成分果膠[71]。近年來，有研究利用噬菌體的展示技術篩選分離出一種多肽SVTIHHLGGGS，該多肽可以緊密結(jié)合在葡萄土壤桿菌中的多聚半乳糖醛酸酶。室內(nèi)試驗證明，該多肽可以降低多聚半乳糖醛酸酶活性35%[72]，效果顯著。此外，葡萄土壤桿菌不同菌株中效應蛋白（Tae4）和免疫蛋白（Tai4）變異較大，能否利用免疫蛋白進行病害防治還需后續(xù)研究[73]。