血清膜聯(lián)蛋白A2與口腔鱗癌病人放化療敏感性及預(yù)后的關(guān)系

曾雅婕，蔣柳宏，趙波，李軼

口腔鱗癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）作為多發(fā)性口腔惡性腫瘤，其發(fā)病率約占90%以上，占全身惡性腫瘤的1.5%～5.6%［1］。OSCC在舌、牙齦、頰、腭、上頜竇等部位多發(fā)，具有高發(fā)病率與高死亡率，易發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，5年生存率低于50%，晚期病人存活率低于30%，而影響OSCC治療效果及預(yù)后的因素尚不明確［2-3］。膜聯(lián)蛋白A2（Annexin A2，ANXA2）是一種跨膜蛋白，參與DNA損傷修復(fù)、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡及生長因子信號(hào)傳導(dǎo)等生理過程，同時(shí)還與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［4-5］。有多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)ANXA2在癌癥病人組織和血清中高表達(dá)，并可作為預(yù)后檢測(cè)指標(biāo)，而關(guān)于ANXA2在OSCC血清中表達(dá)情況研究較少［6］。因此，本研究旨在探討中晚期OSCC病人血清ANXA2表達(dá)及與放化療敏感性和預(yù)后的關(guān)系，為OSCC尋找新的預(yù)后檢測(cè)指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料采用優(yōu)效性檢驗(yàn)計(jì)算確定樣本量，取α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，把握度取80%，結(jié)合既往文獻(xiàn)及研究，SPASS軟件確定每組需樣本量68例。選取2013年2月至2015年2月廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的81例中晚期OSCC病人，排除13例不符合條件病人，以68例中晚期OSCC病人作為研究對(duì)象，同時(shí)選取68例體檢健康者作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)組織病理學(xué)確診為中晚期OSCC病人（標(biāo)準(zhǔn)：①腫瘤細(xì)胞具有鱗狀細(xì)胞的特點(diǎn)，有角化，形成角化珠；②具有細(xì)胞間橋；③腫瘤細(xì)胞有明顯的異型性，可見核分裂象；④腫瘤細(xì)胞呈蟹足狀浸潤性生長，與正常組織之間沒有界限）；（2）手術(shù)不耐受病人；（3）病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）預(yù)計(jì)生存期低于3個(gè)月者；（2）入組前有放化療史者；（3）合并其他惡性腫瘤者；（4）合并糖尿病、高血壓等慢性代謝障礙疾病者；（5）血小板凝集障礙者；（6）合并類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫障礙疾病者；（7）放化療禁忌證者；（8）依從性差者。

1.2 放化療方法采用直線加速器放療，放療60～66 Gy，每次劑量1.8～2.0 Gy，1次/天，5次/周，連續(xù)放療6周。在放療基礎(chǔ)上給予順鉑（江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)H20010743，規(guī)格20 mg/20 mL）75 mg/m2，連續(xù)2 d，加入到250 mL 0.9%生理鹽水中，靜脈滴注1 h，氟尿嘧啶（通化茂祥制藥有限公司，批號(hào)H22023469，規(guī)格0.25 g/10 mL）1 000 mg/m2，連續(xù)5 d，加入到500 mL 0.9%生理鹽水中，靜脈滴注，3周1個(gè)療程，化療2個(gè)療程。治療后出現(xiàn)惡心、嘔吐48例，白細(xì)胞降低65例，放射線皮疹32例。

1.3 檢測(cè)方法采集受試者靜脈血3 mL，室溫靜止30 min，3 200 r/min離心10 min，取上清，-80℃凍存待檢。采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)血清ANXA2水平，試劑盒購自美國R&D公司，具體步驟如下：（1）設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測(cè)樣品孔與空白孔，相應(yīng)孔中加標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣品，空白孔不加，37℃孵育30 min；（2）洗板：棄液，吸水紙上拍干，加洗滌液靜止1 min，棄液，吸水紙上拍干，重復(fù)洗滌3次；（3）加酶標(biāo)工作液：各孔加酶標(biāo)工作液，空白孔除外，37℃孵育30 min；（4）洗板：棄液，吸水紙上拍干，加洗滌液靜止1 min，棄液，吸水紙上拍干，重復(fù)洗滌3次；（5）顯色：各孔加入顯色劑A與顯色劑B，混勻，37℃避光顯色10 min；（6）終止：各孔加終止液終止反應(yīng)；（6）測(cè)定：450 nm波長測(cè)定OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待檢樣品濃度。

1.4 療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)療效評(píng)定參照世界衛(wèi)生組織（WHO）實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［7］，完全緩解（CR）：腫瘤病灶完全消失，持續(xù)4周以上無復(fù)發(fā)；部分緩解（PR）：各病灶最大直徑與垂直直徑乘積消退≥50%；穩(wěn)定（SD）：各病灶最大直徑與垂直直徑乘積消退＜50%或增大≤25%；進(jìn)展（PD）：各病灶最大直徑與垂直直徑乘積增大＞25%或有新病灶出現(xiàn)，總有效率=（完全緩解+部分緩解）/總例數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本研究所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0，其中符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用描述，并用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例（%）描述，并用χ2檢驗(yàn)；OSCC病人血清ANXA2低表達(dá)與高表達(dá)的生存曲線采用Kaplan-Meier法衡量，得到各組5年中位數(shù)生存時(shí)間并比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受試者臨床資料比較兩組性別、年齡以及BMI比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 中晚期口腔磷癌（OSCC）病人68例與體檢健康者68例臨床資料比較

2.2 兩組病人血清ANXA2水平比較研究組病人血清ANXA2水平（28.15±6.24）μg/L明顯高于對(duì)照組（13.92±4.18）μg/L（t=15.62，P＜0.05）。

2.3 ANXA2表達(dá)與臨床病理參數(shù)關(guān)系以O(shè)SCC病人血清ANXA2表達(dá)中位數(shù)（27.62）為界值將OSCC病人分為ANXA2高表達(dá)組和ANXA2低表達(dá)組。血清ANXA2表達(dá)與病人年齡、性別、腫瘤大小無關(guān)（P＞0.05），與病人TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05），見表2。

表2 口腔磷癌（OSCC）病人68例血清膜聯(lián)蛋白A2（ANXA2）表達(dá)與臨床病理參數(shù)關(guān)系/例

2.4 ANXA2表達(dá)與放化療療效關(guān)系A(chǔ)NXA2高表達(dá)組病人放化療總有效率為54.84%（17/31），ANXA2低表達(dá)組病人總有效率為78.38%（29/37），兩組病人放化療總有效率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 膜聯(lián)蛋白A2（ANXA2）表達(dá)與放化療療效關(guān)系

2.5 OSCC病人血清ANXA2表達(dá)與預(yù)后關(guān)系OSCC病人血清ANXA2低表達(dá)病人隨訪5年中位數(shù)生存時(shí)間為（37.00±5.28）個(gè)月，高表達(dá)組5年中位數(shù)生存時(shí)間為（28.00±3.89）個(gè)月，兩組病人預(yù)后5年中位數(shù)生存時(shí)間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.87，P＜0.001）。

3 討論

OSCC是世界十大惡性腫瘤疾病之一，全球每年約有500 000新增病例，OSCC高發(fā)于45～75歲人群，并隨著人口老齡化加劇，其發(fā)病率呈明顯升高趨勢(shì)［8-9］。目前研究認(rèn)為咀嚼檳榔、吸煙酗酒、不良修復(fù)體刺激及人乳頭瘤病毒感染等是OSCC致病因素［10］。隨著手術(shù)治療、放化療技術(shù)及檢測(cè)技術(shù)不斷進(jìn)步，OSCC死亡率有所下降，但OSCC早期病人預(yù)后良好，5年生存率可達(dá)85%以上，但多數(shù)病人確診已為中晚期，預(yù)后較差，嚴(yán)重影響病人生活質(zhì)量及生命健康［11］。因此，本研究希望通過對(duì)OSCC病人血清ANXA2水平檢測(cè)及與放化療敏感性關(guān)系分析，為OSCC治療和預(yù)后提供新的檢測(cè)指標(biāo)。

ANXA2屬于跨膜蛋白A家族重要成員之一，是一種外分泌鈣磷脂結(jié)合蛋白，主要分布于細(xì)胞膜與細(xì)胞漿中，可在單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，并能釋放入血在外周血中檢測(cè)到。ANXA2在多種腫瘤組織、血清中異常升高，并與腫瘤侵襲、遷移、分化及藥物抵抗等存在密切聯(lián)系，可用于早期診斷多種惡性腫瘤及評(píng)估預(yù)后的參考指標(biāo)［12］。研究發(fā)現(xiàn)，ANXA2在肝細(xì)胞癌組織中高表達(dá)，并與腫瘤長徑、浸潤轉(zhuǎn)移相關(guān)，參與肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展［13］。有研究證實(shí)ANXA2在乳腺癌血清中表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)上調(diào)是整體生存率差和遠(yuǎn)處無轉(zhuǎn)移生存預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)［14］。本研究結(jié)果顯示，研究組病人血清ANXA2水平明顯高于對(duì)照組，Zhang等［15］臨床研究顯示相較于良性口腔疾病組和健康對(duì)照組，OSCC病人ANXA2水平明顯升高，與本研究結(jié)果相一致，進(jìn)一步表明ANXA2在OSCC中呈高表達(dá)水平，推測(cè)與疾病發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。結(jié)果還顯示OSCC病 人血 清ANXA2表 達(dá)與TNM分期、分 化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，而與年齡、性別、腫瘤大小無關(guān)，同于洋等［16］研究結(jié)果基本相似，提示ANXA2參與OSCC疾病發(fā)生、發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)ANXA2沉默可抑制血管生成，而血管生成是腫瘤發(fā)生的重要因素，細(xì)胞表面上的ANXA2可與血管產(chǎn)生抑制因子特異性結(jié)合，使纖維蛋白溶解酶與ANXA2結(jié)合受阻，無法形成纖溶酶，影響血管生成，ANXA2還能將基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）前體活化，而MMP-2和MMP-9可降解細(xì)胞基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲與遷移［17-18］。本研究中ANXA2表達(dá)與腫瘤大小無關(guān)，可能是由于樣本量較少，造成結(jié)果偏倚所致。進(jìn)一步通過對(duì)ANXA2不同表達(dá)水平OSCC病人放化療敏感性分析顯示，ANXA2高表達(dá)組病人放療總有效率為54.84%，明顯低于ANXA2低表達(dá)組病人總有效率的78.38%，與Chen等［19］研究結(jié)果相似，提示血清ANXA2高表達(dá)OSCC病人對(duì)放化療敏感性低，放化療效果差。有研究報(bào)道癌癥病人進(jìn)行放射治療者，ANXA2可進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)以減輕放射對(duì)DNA損傷，起到保護(hù)DNA作用，而ANXA2如何保護(hù)DNA機(jī)制尚不清楚［20］。最后通過生存曲線分析顯示，OSCC病人血清ANXA2低表達(dá)病人5年中位數(shù)生存時(shí)間與高表達(dá)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與Liu等［21］研究結(jié)果基本相似，提示OSCC病人的ANXA2水平越高，則生存時(shí)間越短，預(yù)后較差，其可作為預(yù)測(cè)OSCC預(yù)后潛在生物學(xué)指標(biāo)。

綜上所述，中晚期OSCC病人血清ANXA2高表達(dá)，并與TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，且ANXA2高表達(dá)者的放化療敏感性低，生存時(shí)間短。但本研究可能因所選研究對(duì)象及隨訪時(shí)間有限，可能對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生一定誤差，在之后進(jìn)一步對(duì)OSCC機(jī)制研究中會(huì)著重改進(jìn)。