B淋巴細(xì)胞瘤-2結(jié)合抗凋亡基因1在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及臨床意義

郭致飛，汪超，馬春春，趙兵

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是成人最常見的原發(fā)性顱內(nèi)惡性腫瘤，致死率甚高，其中惡性度最高的為多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，預(yù)后極差，即使采取了手術(shù)輔以放化療病人平均的生存期只有1年，只有不足5%的病人可以存活5年以上［1-2］。雖然近年來相關(guān)手術(shù)及放化療技術(shù)不斷地進步，但是膠質(zhì)瘤的預(yù)后仍然很差，手術(shù)和放化療這些既往常用的措施已無法進一步延長病人的生存期，治愈膠質(zhì)瘤最根本的策略仍是發(fā)現(xiàn)更多新的靶向分子［3-4］。細(xì)胞凋亡是一種復(fù)雜的過程，有許多的基因和信號通路參與，人體內(nèi)的細(xì)胞凋亡出現(xiàn)障礙時會導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖，是人體內(nèi)腫瘤產(chǎn)生的重要分子機制之一。B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）結(jié)合抗凋亡基因1（Bcl-2-associated athanogene 1，BAG-1）是一種參與細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)的基因，可以和Bcl-2相互結(jié)合，增強其抗凋亡的作用，并且可以和多種信號通路因子相互結(jié)合作用來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等生物學(xué)行為［5］。因此本文通過免疫組化方法檢測人腦膠質(zhì)瘤中BAG-1的表達(dá)情況，并分析其與臨床病理及預(yù)后的關(guān)系，初步探討B(tài)AG-1在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 組織標(biāo)本 選取2009年9月至2021年9月年安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科的212例人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本，以及10例正常腦組織標(biāo)本，正常腦組織取自顱腦外傷術(shù)中內(nèi)減壓。腫瘤的病理級別分類是按照世界衛(wèi)生組織關(guān)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類2007年版本進行分類，在212例膠質(zhì)瘤中低級別膠質(zhì)瘤（Ⅰ～Ⅱ級）有91例，具體數(shù)目為Ⅰ級4例、Ⅰ～Ⅱ級4例、Ⅱ級83例，高級別膠質(zhì)瘤（Ⅲ～Ⅳ級）有121例，其中Ⅱ～Ⅲ級13例、Ⅲ級43例、Ⅲ～Ⅳ級14例、Ⅳ級51例。

1.1.2 臨床資料212例膠質(zhì)瘤標(biāo)本中，男114例，女98例，年齡范圍為4～80歲，年齡（47.65±5.46）歲；正常腦組織10例標(biāo)本中，7例為男性，3例為女性，年齡范圍為35～60歲，年齡（46.14±4.32）歲。病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.1.3 主要試劑BAG-1兔單克隆抗體（美國Abcam公司，貨號ab32109），PV-6000二步法免疫組化檢測試劑盒（美國金橋公司）

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫組織化學(xué) 標(biāo)本經(jīng)過甲醛固定和石蠟包埋后，連續(xù)切成厚度為4 μm的切片，先進行HE染色，后經(jīng)兩位高年資的病理醫(yī)師獨立閱片并診斷，核實為膠質(zhì)瘤標(biāo)本后進行免疫組化染色。石蠟切片經(jīng)過烤片、二甲苯脫蠟、濃度梯度乙醇水化后，3%雙氧水去離子水孵育10 min，再以稀釋濃度為0.01 mol枸櫞酸鈉修復(fù)20 min，滴加稀釋的一抗（1∶100），在4℃冰箱放置過夜以孵育。過夜后第二天用PBS沖洗三次后，依次滴加免疫組化試劑盒中的試劑1（聚合物輔助物）和試劑2（多過氧化物酶抗鼠/兔IgG），在37℃下分別孵育20 min和30 min。常規(guī)顯色封片后鏡檢，重復(fù)實驗以保證結(jié)果的特異性。

1.2.2 隨訪及資料整理 采取電話隨訪為主，結(jié)合門診隨訪的方式，隨訪截止日期2021年12月31日。病人的生存時間長短按照月來計算。

1.2.3 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 免疫組化評分判斷參照Mattern等［6］的方法，進行半定量判定：①染色深淺度，未見染色為0，輕度染色為1，中度染色為2，深度染色為3；②染色細(xì)胞的百分比：未見染色為0，0～25%為1，25%～50%為2，＞50%為3?？偡譃槿旧顪\度和百分比得分的相加，0為最低得分，6為最高得分。在放大倍率為400倍的高倍顯微鏡下觀察10個視野，計算10個視野的平均分，則為每例標(biāo)本的得分。陰性為0～2分，陽性為3～6分。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0進行統(tǒng)計分析。呈正態(tài)分布的計量資料采用表示，計數(shù)資料以例（%）表示，各組間率的比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，生存曲線的比較采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BAG-1在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況在總體的212例人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本中，檢測到BAG-1的陽性表達(dá)130例，陰性表達(dá)82例，陽性表達(dá)率為61.3%，陰性表達(dá)率38.7%，BAG-1的陽性信號為腫瘤細(xì)胞細(xì)胞漿呈棕黃色（或棕褐色）著色，部分細(xì)胞核也可呈棕褐色著色，呈不均勻散在分布。10例正常腦組織中BAG-1的陽性表達(dá)2例，陽性表達(dá)率為20%；BAG-1在正常腦組織、低級別和高級別膠質(zhì)瘤中的免疫組化典型表達(dá)圖見圖1。

2.2 BAG-1的表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析統(tǒng)計BAG-1的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤病人的各項臨床病理參數(shù)并作相關(guān)性分析。BAG-1表達(dá)在病人的年齡、性別、術(shù)前卡氏功能狀態(tài)（Karnofsky performance status，KPS）評分、腫瘤大小上差異無統(tǒng)計學(xué)意義，BAG-1表達(dá)在不同腫瘤的病理級別上差異有統(tǒng)計學(xué)意義。BAG-1在高級別膠質(zhì)瘤中陽性表達(dá)率71.1%，低級別膠質(zhì)瘤中陽性表達(dá)率48.4%，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001）。在91例低級別膠質(zhì)瘤中進一步分析BAG-1表達(dá)陽性組的復(fù)發(fā)病例為28例，復(fù)發(fā)率為77.8%；BAG-1陰性表達(dá)的病人的復(fù)發(fā)病例為25例，復(fù)發(fā)率為45.5%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.002）。在65例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤標(biāo)本中抽取30例腫瘤復(fù)發(fā)標(biāo)本行免疫組化檢測BAG-1的表達(dá)，結(jié)果顯示BAG-1在復(fù)發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中陽性表達(dá)為29例，陽性表達(dá)率為96.7%，在65例原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的陽性表達(dá)49例，陽性表達(dá)率為75.4%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.010）。結(jié)果見表1。

表1 BAG-1的表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤病人臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

2.3 BAG-1表達(dá)與膠質(zhì)瘤病人預(yù)后的關(guān)系通過生存曲線分析比較得出：BAG-1陰性和陽性表達(dá)的膠質(zhì)瘤病人的中位生存時間分別為60個月和17個月，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），見圖2。BAG-1表達(dá)陰性和陽性的高級別膠質(zhì)瘤病人的中位生存時間分別為31個月和11個月，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），見圖3。BAG-1陰性和陽性表達(dá)的膠質(zhì)瘤病人的無進展中位生存時間分別為26個月和8個月，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001），見圖4。

圖2 BAG-1表達(dá)陽性和陰性的膠質(zhì)瘤病人的整體生存率的比較

圖3 BAG-1表達(dá)陽性和陰性的高級別膠質(zhì)瘤病人的整體生存率的比較

圖4 BAG-1表達(dá)陽性和陰性的膠質(zhì)瘤病人無進展生存率的比較

3 討論

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞內(nèi)主動實施的程序性死亡，對于及時清除人體內(nèi)的突變異常細(xì)胞具有重要的作用，針對細(xì)胞凋亡方面的研究已經(jīng)成為腫瘤病因?qū)W研究的熱點，凋亡相關(guān)和調(diào)控的特異性蛋白對細(xì)胞增殖和凋亡的作用有望成為腫瘤治療的新的靶點，具有廣闊的應(yīng)用前景。例如：轉(zhuǎn)錄和表現(xiàn)遺傳調(diào)控因子溴結(jié)構(gòu)域蛋白4（bromodomain protein 4，BRD4）和組蛋白去乙?；?（Histone deacetylase 3，HDAC3）對膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖和凋亡會產(chǎn)生巨大的影響，小分子靶向抑制BRD4和HDAC3能明顯誘發(fā)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的凋亡及增殖減緩，增加凋亡率［7-9］。BAG-1作為另一個與細(xì)胞凋亡相關(guān)的重要的蛋白，在生理學(xué)上可以通過多種途徑達(dá)到抗凋亡的作用：①與Bcl-2相結(jié)合，兩個蛋白相互配合，得以抑制細(xì)胞的凋亡，影響細(xì)胞的正常周期變化；②通過結(jié)合熱休克蛋白70來對受損的細(xì)胞進行及時有效的自身修復(fù)，會影響細(xì)胞的增殖；③BAG-1可與多種生長因子受體相結(jié)合，繼而作用于它們的靶器官，最終得以增強其功能從而使得細(xì)胞凋亡的進程受到明顯的抑制［10-11］；④參與自噬調(diào)節(jié)，BAG-1通過維持作為哺乳動物自噬調(diào)節(jié)因子Beclin 1相關(guān)復(fù)合物組成部分的自噬來調(diào)節(jié)細(xì)胞存活或者死亡［12］。

BAG-1已報道在乳腺癌［13］、非小細(xì)胞肺癌［14］及在結(jié)腸癌［15］等人體惡性腫瘤中高表達(dá)，可以促進腫瘤的進展，同時研究發(fā)現(xiàn)通過RNA干擾技術(shù)敲減沉默BAG-1，可以使得惡性腫瘤細(xì)胞的生長得到明顯的抑制，加速惡性細(xì)胞的凋亡［16-17］，探討B(tài)AG-1基因?qū)δz質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展及相關(guān)的調(diào)控機制研究對于膠質(zhì)瘤的靶向治療具有十分重要的意義。為此我們采用免疫組化染色方法檢測10例正常腦組織和212例不同病理級別的人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本中BAG-1蛋白的表達(dá)，并分析BAG-1的表達(dá)與腫瘤臨床病理參數(shù)及病人預(yù)后的相關(guān)性。免疫組化的結(jié)果顯示：正常腦組織中BAG-1呈現(xiàn)低表達(dá)，陽性表達(dá)率僅為20%，而膠質(zhì)瘤中陽性表達(dá)率高達(dá)61.3%；比正常腦組織明顯要高。高級別膠質(zhì)瘤中陽性率高達(dá)71.1%，并且BAG-1在不同級別膠質(zhì)瘤組織中的陽性率和上調(diào)情況與腫瘤分期呈現(xiàn)正相關(guān)性。我們進一步分析了膠質(zhì)瘤中BAG-1的表達(dá)情況與病人預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示：在212例膠質(zhì)瘤病人中BAG-1表達(dá)陽性者總生存率較BAG-1陰性表達(dá)者明顯降低，在121例高級別膠質(zhì)瘤中BAG-1表達(dá)陽性者總生存率較BAG-1陰性表達(dá)者明顯降低。以上統(tǒng)計結(jié)果表明在膠質(zhì)瘤的演變發(fā)生進展的過程中，BAG-1有可能扮演了重要的角色，并且可以作為判斷膠質(zhì)瘤病人的預(yù)后及分子靶向治療新的分子標(biāo)志物。

目前腦膠質(zhì)瘤的治療仍以手術(shù)加術(shù)后放化療為主，最常用的化療藥物為替莫唑胺，但由于血腦屏障的存在以及膠質(zhì)瘤本身對于化療的不敏感性，導(dǎo)致腦膠質(zhì)瘤的化療有效率較低，化療耐藥已成為膠質(zhì)瘤預(yù)后差的一個重要因素。膠質(zhì)瘤化療耐藥是一個多分子參與的復(fù)雜過程，涉及到環(huán)狀RNA-微小RNA-信使RNA復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)［18］?？沟蛲霰徽J(rèn)為是膠質(zhì)瘤化療耐藥的一個重要機制，如前所述，凋亡相關(guān)蛋白BRD4和HDAC3的特異性抑制劑與替莫唑胺聯(lián)合應(yīng)用能顯著提高化療的療效［19-20］。Bcl-2也是一種凋亡抑制基因，是通過抑制凋亡等參與腫瘤放化療的耐藥過程，有學(xué)者在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中通過沉默Bcl-2能明顯提高替莫唑胺的化療敏感性［21］，而BAG-1可以通過與Bcl-2形成復(fù)合物來提高細(xì)胞凋亡抗性，從而加強Bcl-2的抗凋亡效果。研究發(fā)現(xiàn)PD-L1可增加BAG-1表達(dá)，通過持續(xù)激活ERK信號，使非小細(xì)胞肺癌病人對酪氨酸激酶抑制劑產(chǎn)生耐藥性［22］。此外在乳腺癌［23］、卵巢癌［24］、肝癌［25］、宮頸癌［26］、肺癌［14］以及頭頸部鱗狀細(xì)胞癌［27］的BAG-1過表達(dá)可以增強化療藥物的抵抗，對BAG-1進行相關(guān)的基因調(diào)控可能會改變膠質(zhì)瘤化療耐藥的現(xiàn)狀。為此我們分析和統(tǒng)計了復(fù)發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的BAG-1表達(dá)情況，結(jié)果顯示復(fù)發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的BAG-1陽性表達(dá)率高達(dá)96.7%，較原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中明顯要高；在91例低級別膠質(zhì)瘤中進一步分析BAG-1表達(dá)陽性的病人腫瘤復(fù)發(fā)為28例，復(fù)發(fā)率為77.8%；BAG-1陰性表達(dá)的病人的復(fù)發(fā)病例為25例，復(fù)發(fā)率為45.5%，BAG-1表達(dá)陽性的病人復(fù)發(fā)率較BAG-1表達(dá)陰性的病人明顯要高。同時我們統(tǒng)計了212例膠質(zhì)瘤病人無進展生存期和BAG-1表達(dá)之間的關(guān)系，結(jié)果顯示BAG-1表達(dá)陽性者無進展生存率較BAG-1陰性表達(dá)者明顯降低，二者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，以上結(jié)果初步表明BAG-1有可能參與膠質(zhì)瘤化療耐藥性的形成。

綜上所述，凋亡抑制基因BAG-1在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，和膠質(zhì)瘤的病理分級正相關(guān)，并且對于預(yù)測膠質(zhì)瘤病人的預(yù)后具有重要臨床意義，可能對膠質(zhì)瘤替莫唑胺等藥物的化療敏感性產(chǎn)生影響，設(shè)計BAG-1的小分子干擾藥物與化療藥物的聯(lián)合應(yīng)用，可能會提高替莫唑胺等化療藥物的療效。本研究尚存在一定的局限性，例如只采取免疫組化方法檢測膠質(zhì)瘤標(biāo)本中的BAG-1表達(dá)情況，實驗方法較為單一，關(guān)于BAG-1在膠質(zhì)瘤中的惡性表型以及對替莫唑胺耐藥性的相關(guān)分子機制需后續(xù)進一步研究。