3種陸生植物葉片浸提液對東海原甲藻生長及光合生理的影響

向 舒，陳雯雯，沈盎綠

（上海海洋大學海洋生態(tài)與環(huán)境學院，上海 201306）

東海原甲藻（Prorocentrum donghaiense）赤潮在福建、浙江沿海常有發(fā)生，該藻已經成為了我國東海海域內引發(fā)赤潮次數最多、累計面積最大的肇事甲藻［1］。東海原甲藻赤潮期間造成水體缺氧，降低中華哲水蚤（Calanus sinicus）種群豐度從而影響漁業(yè)資源［2－3］。網箱養(yǎng)殖是海水增養(yǎng)殖生產的重要方式之一，赤潮的暴發(fā)會對網箱養(yǎng)殖產生嚴重影響［4］。因此，如何有效防治近岸水產養(yǎng)殖海域有毒有害赤潮成為目前我國赤潮災害防治的熱點和重點之一。

植物化感作用因簡單易操作、對環(huán)境壓力小且無二次污染、經濟適用等優(yōu)點，正逐漸成為當下藻華生物防治的重要手段之一。早期大多涉及陸生植物抑制淡水藻類，其中紫玉蘭（Yulania liliiflora）、女貞子（Ligustri lucidi）、石榴（Punica granatum）和銀杏（Ginkgo biloba）等陸生木本植物分泌的化感物質對銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）和絲狀藻（Cladophora sp.）等淡水藻類有較好的抑制效果［5－8］。但是在海洋赤潮藻類抑制方面，目前大多數研究聚焦在稻麥稈、玉米（Zea mays）和加拿大一枝黃花（Solidago canadensis）等 陸 生 草 本 植 物［9－10］。鹽 角 草（Salicornia europaea）、互 花 米 草（Spartina alterniflora）［11－13］及紅樹林植物秋茄葉（Kandelia candel）、木欖（Bruguiera gymnorhiza）和海芒果（Cerbera manghas）等濕地植物［14－15］也具有化感抑藻作用。此外，少數研究發(fā)現，陸生木本植物對海洋藻類具有較好的抑制作用，比如托里桉（Eucalyptus tarelliana）粉和杉木（Cunninghamia lanceolata）粉能夠有效去除水體中的米氏凱倫藻（Karenia mikiotoi）或東海原甲藻等海洋藻類［16－17］。常 見 木 本 植 物 香 樟（Cinnamomum camphora）、夾竹桃（Nerium indicum）和銀杏雖被證明其落葉浸出液中化感物質可有效抑制黃絲藻（Tribonema bombycinum）、銅綠微囊藻等淡水藻類的生長，并導致其光合生理發(fā)生顯著變化［8，18］，但作為良好的化感物質候選者，這幾種植物對赤潮生物東海原甲藻的抑藻效果卻未見報道。

基于脈沖-振幅-調制的葉綠素熒光測量技術（pulse-amplitude-modulation，PAM），因快速且不傷害植物本身而被廣泛用于測量植物光合系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）的生理變化，可提供最大光化學量子效率（Fv/Fm）、有效光化學量子效率（Fv′/Fm′）、最大相對電子傳遞效率（rETRmax）和光能轉化效率（α）等有效光合參數［19］。在植物化感抑藻方面的研究中，這些參數被廣泛應用，研究發(fā)現荔枝（Litchi chinensis）、銀杏和互花米草等植物中存在的化感物質對銅綠微囊藻、東海原甲藻和絲狀藻等微藻的光合參數具有顯著抑制作用［8，13］。

借鑒森林防火隔離帶原理，當沿海養(yǎng)殖區(qū)面臨赤潮威脅時，在網箱養(yǎng)殖區(qū)用陸生植物葉片粉末構筑一道赤潮隔離帶，可實現保護海水養(yǎng)殖區(qū)的目的。本研究在前期篩選有效陸生植物的基礎上，選擇具有較好化感作用的香樟、夾竹桃和銀杏葉片作為研究對象，探究其葉片浸提液對東海原甲藻的抑制效果；在此基礎上，應用PAM測定3種植物葉片浸提液對東海原甲藻細胞的Fv′/Fm′、rETRmax和α等光合作用參數，從而綜合評價香樟、夾竹桃和銀杏這3種植物葉片浸提液對東海原甲藻生長及光系統(tǒng)PSⅡ的調控作用，為東海原甲藻生物防控提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

香樟、夾竹桃和銀杏葉片于2019年10—11月收集自上海市上海海洋大學校園內。將清洗干凈的材料置于60℃烘箱中烘干，粉碎過篩（100目），常溫密封保持備用。

東海原甲藻（GY-H40）購自上海光語生物科技有限公司，藻類培養(yǎng)基采用f/2培養(yǎng)基。培養(yǎng)基所用海水采自浙江省舟山市漳州灣近岸（29°54′56″N、122°25′14″E），海水經過孔徑為0.22μm的濾膜過濾，然后經過121℃高壓蒸汽滅菌20分鐘。藻類培養(yǎng)溫度為（25±1）℃，光照強度大約為20μmol·m－2·s－1，光暗比為14 h∶10 h。藻類培養(yǎng)和實驗均按照以上條件在新苗智能型光照培養(yǎng)箱（GZX-250BSH-Ⅲ，上海）進行。

1.2 實驗方法

1.2.1 植物葉片浸提液的制備

稱取50.0 g植物粉末，加入500 mL滅菌海水，60℃水浴鍋中水溶2 h后取上清液，然后重新加入滅菌海水，多次重復上述操作至上清液無色。上清液再經0.22μm的濾膜過濾，除去顆粒雜質和微生物，得到最終實驗浸提母液，質量濃度為50.0 g·L－1。

1.2.2 3種植物葉片浸提液抑藻實驗

根據預實驗結果，香樟和夾竹桃實驗中每組實驗設置1個對照組和4個質量濃度梯度為0.1、0.5、1.0和3.0 g·L－1的試驗組。銀杏實驗中每組實驗設置1個對照組和5個質量濃度梯度為0.1、0.5、1.0、3.0和5.0 g·L－1的試驗組。將處于指數增長期的東海原甲藻接種于100 mL錐形瓶中，同時添加植物葉片浸提液，接種后的總體積為50 mL。香樟、夾竹桃和銀杏植物葉片浸提液處理組中東海原甲藻的起始藻密度均為1.1×104個·mL－1。每個濃度3個重復組，培養(yǎng)條件與1.1相同。實驗周期為96 h，每天光周期2 h后取樣一次，進行藻細胞密度和葉綠素熒光參數的測定。

1.2.3 東海原甲藻葉綠素熒光參數的測定

通過浮游植物分類熒光儀（PHYTO-PAMED，Walz公司，德國）測定東海原甲藻的Fv′/Fm′和rETR，參數測定時光化學設置參見文獻［20］。rETR和光照強度（I）之間關系按照EILERS和PEETERS［21］的公式進行擬合，Fv′/Fm′、rETRmax及α計算公式參見文獻［20］。本實驗光照強度設置為1、32、64、164、264、364、464、564、664、764 μmol photons·m－2·s－1共10個梯度，每個光強下照射時間為20 s。

1.3 數據分析

所有實驗數據均以平均值±標準差（SD）表示，Shapiro-Wilk和Levene檢驗用于檢驗數據是否正態(tài)分布和方差齊性。在數據呈正態(tài)分布以及方差相等的前提下采用SPSS軟件進行單因素方差分析，組間差異顯著的情況下（P＜0.05表示差異顯著）采用Tukey’s方法進行多重比較。所有圖表采用Origin 2015軟件進行繪制。藻類抑制率計算方法參照文獻［10］。96 h-EC50的計算采用GraphPad Prism 7.0軟件［22］。

2 結果與分析

2.1 3種植物葉片浸提液對東海原甲藻生長的影響

由圖1可知，0.1 g·L－1香樟浸提液處理96 h時間內，東海原甲藻藻細胞生長與對照組無顯著差異（P＞0.05）；1.0 g·L－1和3.0 g·L－1浸提液在48 h對東海原甲藻的藻密度具有顯著的抑制作用（P＜0.05），96 h時藻密度的抑制率分別為57.6%和100.0%。鑒于對東海原甲藻的抑制率已達100%，所以更高濃度（＞3.0 g·L－1）試驗組在圖1中不再顯示。經計算，香樟浸提液對東海原甲藻的96 h-EC50值為0.84 g·L－1。

圖1 不同梯度濃度香樟葉片浸提液對東海原甲藻藻密度的影響Fig.1 Effects of Cinnamomum camphora leaf extract concentration gradient on algae density of Prorocentrum donghaiense

由圖2可知，夾竹桃浸提液對東海原甲藻的抑制效果趨勢基本一致，0.1 g·L－1浸提液處理后東海原甲藻藻細胞生長與對照組無顯著差異（P＞0.05）；1.0 g·L－1夾竹桃浸提液處理96 h后東海原甲藻密度與對照組相比下降較為明顯，抑制率為38.1%（P＜0.05）。高濃度3.0 g·L－1浸提液作用下，藻密度在48 h時出現急劇下跌，96 h藻密度抑制率為100%（P＜0.05）。經計算，夾竹桃浸提液對東海原甲藻的96 h-EC50值為1.30 g·L－1。

圖2 不同梯度濃度夾竹桃葉片浸提液對東海原甲藻藻密度的影響Fig.2 Effects of Nerium indicum leaf extract concentration gradient on algae density of P.donghaiense

由圖3可知，0.1 g·L－1銀杏浸提液處理下東海原甲藻藻密度與對照組差異不顯著（P＞0.05），0.5 g·L－1和1.0 g·L－1浸提液處理72 h時藻細胞還能輕微生長。3.0 g·L－1和5.0 g·L－1浸提液處理后東海原甲藻的藻密度48 h時出現顯著下降，96 h時抑制率達到74.9%和88.7%（P＜0.05）。經計算，銀杏浸提液對東海原甲藻的96 h-EC50值為1.74 g·L－1。

圖3 不同梯度濃度銀杏葉片浸提液對東海原甲藻藻密度的影響Fig.3 Effects of Ginkgo biloba leaf extract concentration gradient on algae densityof P.donghaiense

2.2 3種植物葉片浸提液對東海原甲藻PSⅡ的影響

2.2.1 對東海原甲藻F v′/F m′的影響

如圖4-A所示，0.1 g·L－1香樟葉片浸提液處理96 h后東海原甲藻Fv′/Fm′值與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）。而0.5 g·L－1和1.0 g·L－1葉片浸提液處理96 h后藻類Fv′/Fm′抑制率分別為19.4%和29.9%（P＜0.05）。3.0 g·L－1浸提液處理下藻細胞的Fv′/Fm′值急劇下降，72 h時藻類Fv′/Fm′抑制率為100.0%（P＜0.05）。如圖4-B所示，0.1 g·L－1夾竹桃葉片浸提液處理96 h內藻細胞Fv′/Fm′值與對照組無顯著差異（P＞0.05）。0.5 g·L－1和1.0 g·L－1葉片浸提液處理后藻細胞Fv′/Fm′值出現小幅度下降，96 h后藻類Fv′/Fm′抑制率分別為11.9%和19.4%（P＜0.05）。3.0 g·L－1浸提液處理下藻細胞的Fv′/Fm′值劇烈下降，96 h后藻類Fv′/Fm′抑制率為97.0%（P＜0.05）。由圖4-C所示，濃度低于1.0 g·L－1銀杏葉片浸提液處理時，藻細胞Fv′/Fm′值與對照組無顯著差異（P＞0.05）。3.0 g·L－1葉片浸提液處理96 h后藻類Fv′/Fm′抑制率為34.9%，5.0 g·L－1葉片浸提液作用24 h后藻類Fv′/Fm′抑制率為50.8%，96 h后藻類Fv′/Fm′抑制率達88.9%（P＜0.05）。

圖4 不同梯度濃度香樟（A）、夾竹桃（B）、銀杏（C）葉片浸提液對東海原甲藻有效光化學量子效率（F v′/F m′）值的影響Fig.4 Effects of C.camphora（A），N.indicum（B）and G.biloba（C）leaf extract concentration gradient on effective photochemical efficiency（F v′/F m′）of P.donghaiense

2.2.2 對東海原甲藻PSⅡ光合活性參數的影響

通過測量藻細胞的快速光曲線得到香樟葉片浸提液對東海原甲藻PSⅡ光合活性參數（圖5）。0.1、0.5 g·L－1和1.0 g·L－1香樟葉片浸提液處理72 h內，東海原甲藻的α值與對照組差異不顯著（P＞0.05），浸提液處理96 h后，0.1 g·L－1和0.5 g·L－1組雖然顯著低于對照組和1.0 g·L－1組，但是絕對值相差不大。藻細胞rETRmax值和Ik值在實驗期間的變化幅度則大于α值，處理組濃度越高，兩者的數值越低（P＜0.05）。高濃度3.0 g·L－1浸提液處理下，藻細胞α值、rETRmax值和Ik值從24 h開始就顯著低于對照組（P＜0.05），并且在72 h時表現出急劇降低，96 h后藻類的PSⅡ光合活性參數均處于極低狀態(tài)（P＜0.05）。

圖5 不同梯度濃度香樟葉片浸提液對東海原甲藻光能轉化效率α（A）、最大相對電子效率r ETRmax（B）及光飽和系數I k（C）的影響Fig.5 Effects of C.camphora leaf extract concentration gradient on the photosynthesis efficiencyα（A），relative maximal electron transport rates r ETRmax（B）and light saturation coefficient I k（C）of P.donghaiense

如圖6所示，夾竹桃葉片浸提液在低濃度范圍內（0.1、0.5 g·L－1和1.0 g·L－1）對東海原甲藻PSⅡ光合活性參數的影響與香樟葉片浸提液對其的影響趨勢基本一致，東海原甲藻α值差異不顯著（P＞0.05）。3.0 g·L－1處理組對東海原甲藻α值、rETRmax值和Ik值都在24 h出現驟降，但在96 h后卻有所回升，各個參數的藻類抑制率分別為57.4%、94.0%和70.1%（P＜0.05），均未達到完全抑制。

圖6 不同梯度濃度夾竹桃葉片浸提液對東海原甲藻光能轉化效率α（A）、最大相對電子效率r ETRmax（B）及光飽和系I k（C）的影響Fig.6 Effects of N.indicum leaf extract concentration gradient on the photosynthesis efficiencyα（A），relative maximal electron transport rates r ETRmax（B）and light saturation coefficient I k（C）of P.donghaiense

如圖7所示，0.1、0.5 g·L－1和1.0 g·L－1銀杏葉片浸提液處理下，東海原甲藻的α值、rETRmax值和Ik值在72 h內都與對照組無顯著差異（P＞0.05），浸提液處理96 h后0.1、0.5和1.0 g·L－1組雖然與對照組有差異，但是絕對值也相差不大。3.0 g·L－1浸提液作用下，96 h內藻細胞α值出現小幅度下降（P＜0.05），rETRmax值和Ik值與對照組相比有小幅波動（P＞0.05）。5.0 g·L－1浸提液處理后，東海原甲藻α值、rETRmax值和Ik值在實驗期間不斷下降，96 h后各個參數的藻類抑制率分別達到88.9%、96.1%和62.2%（P＜0.05）。

圖7 不同梯度濃度銀杏葉片浸提液對東海原甲藻光能轉化效率α（A）、最大相對電子效率r ETRmax（B）及光飽和系I k（C）的影響Fig.7 Effects of G.biloba leaf extract concentration gradient on the photosynthesis efficiencyα（A），relative maximal electron transport rates r ETRmax（B）and light saturation coefficient I k（C）of P.donghaiense

3 討論

3.1 不同植物提取物對藻類抑制效果的影響

近年來赤潮發(fā)生的頻率和危害不斷上升，自2000年以來東海海域經常暴發(fā)大規(guī)模東海原甲藻赤潮［23］，所以篩選有效的生物防治方法控制東海原甲藻赤潮成為十分迫切的事情。由于陸生植物種類多、來源廣、化感物質更豐富，所以在抑藻劑原材料選擇上，陸生植物提供了更多選擇［24］。香樟、夾竹桃及銀杏是我國常見的綠化樹種，其樹形高大、枝葉豐滿，利用其落葉化感作用抑制藻類生長，不僅可以有效防控赤潮的發(fā)生，也能實現落葉的廢物利用。

在本研究中，東海原甲藻在對照組中一直處于指數增長期，但在3種植物浸提液處理組中藻類生長受到不同程度的抑制，發(fā)現香樟的抑制效果最為顯著，其次是夾竹桃，銀杏效果最差。香樟［25］、夾竹桃［26］及銀杏［27］水提液均含有豐富的黃酮類化合物，這類化合物對藻類生長具有抑制作用。3種植物浸提液抑藻程度差異化的主要原因可能是黃酮化合物種類不同，不同種類黃酮類化合物中羥基個數不同，羥基個數越多抑藻效果越好；其次黃酮分子結構中引入3位親水基團、A環(huán)5位帶負電氫鍵供體基團、B環(huán)4’位親水氫鍵供體基團及3’、4’位帶負電基團有利于化合物抑藻效果的增加，反之，A環(huán)6、7位引入帶負電羥基供體基團或B環(huán)2’、3’、5’及6’位引入氫鍵供體基團能削弱黃酮化合物的抑藻效果；此外黃酮類化合物分子極性越大、通透性越高及疏水性越強，其抑藻活性也更高［28］。除黃酮類化合物之外，木脂素類化合物是樟屬植物中的一類主要化學成分，這類物質被降解產生氧化類多酚可能抑制藻類生長［29］。夾竹桃葉片中特有的夾竹桃苷類［26］、銀杏葉片中大量的有機酸類［27］等化合物也是導致抑藻活性差異的重要原因。這3種植物有效物質成分的組成和含量存在差異，后續(xù)將通過液相色譜質譜聯用儀等儀器定量分析3種植物葉片水提液的各種有效成分的組成和含量，為后期分析相關抑藻作用機制提供更為精確的靶點。

3.2 植物化感作用對藻類光合作用的影響

葉綠素熒光測量技術是測量植物光合作用最經典的手段，因快速、靈敏、無損傷而被用于赤潮藻類光合機制的研究，利用葉綠素熒光分析技術可以有效監(jiān)控藻細胞PSⅡ的生理狀態(tài)，光合系統(tǒng)PSⅡ的Fv′/Fm′值、α值和rETRmax值取決于電子傳輸鏈的容量或Calvin循環(huán)的限制［30－31］。在研究植物化感物質對藻類作用機理中，PSⅡ是被認為最敏感的位點之一，特別是對電子傳遞鏈某一區(qū)段表現出強烈的抑制作用。本研究中香樟、夾竹桃和銀杏植物葉片中都含有豐富的黃酮類物質，3種植物浸提液高濃度試驗組會導致東海原甲藻Fv′/Fm′值、α值和rETRmax值顯著降低。相似地，黃皓旻［28］發(fā)現，黃酮類物質木犀草素會導致銅綠微囊藻的Fv/Fm值、α值和rETRmax值顯著下降，破壞銅綠微囊藻的光合作用從而抑制其生長。李超等［32］發(fā)現，黃酮類物質槲皮素能脅迫球形棕囊藻（Phaeocystis globsa）的光合系統(tǒng)，導致球形棕囊藻的Fv/Fm、Fv′/Fm′值、α值和rETRmax值呈不同程度降低，對球形棕囊藻光合作用影響明顯。

本研究選取的3種陸生植物香樟、夾竹桃和銀杏葉片中都含有豐富的黃酮類物質［25－27］，因此，這3種植物浸提液中化感物質可能是通過阻斷東海原甲藻第一電子受體QA和第二電子受體QB之間電子流，中斷藻細胞PSⅡ中電子傳遞鏈，從而抑制東原甲藻的光合作用?；形镔|往往是抑制藻細胞光合作用的關鍵。與此觀點類似，有學者認為黃酮類化合物，特別是木犀草素，通過破壞光合系統(tǒng)中第二電子受體QB功能和降低有效量子產量，阻斷光系統(tǒng)中PSⅡ之間電子流，導致光合作用下降［33］。LEU等［34］發(fā)現，穗花狐尾藻（Myriophyllum spicatum）中的特里馬素Ⅱ會影響淡水藍藻及菠菜的光合作用，3μmol·L－1純特里馬素Ⅱ通過阻斷光系統(tǒng)中第一電子受體QA和第二電子受體QB之間電子流來抑制其光合作用。HERNáNDEZ-TERRONSE等［35］發(fā)現，從菊科植物中分離出trachyloban-19-oic acid會阻斷ATP的合成和PSⅡ中H2O→2，6-二氯靛酚（DCPIP），其抑制位點也可能是QA和QB之間的電子傳遞鏈。ZHU等［36］認為，穗花狐尾藻中的化感物質焦性沒食子酸和沒食子酸能抑制銅綠微囊藻和羊角月牙藻（Selenastrum capricornutum）的光合系統(tǒng)活性和電子傳遞鏈，其抑制位點在PSⅡ放氧復合體到QB間。

4 小結

香樟、夾竹桃和銀杏3種植物葉片浸提液對東海原甲藻生長具有不同程度的抑制作用，綜合分析東海原甲藻藻密度及96 h-EC50發(fā)現，香樟的抑制效果最佳，夾竹桃次之，這種抑藻效率的差異可能是3種植物中所含的化感物質種類和含量不同。香樟、銀杏和銀杏葉片高濃度浸提液（≥3.0 g·L－1）可以大幅度降低東海原甲藻Fv′/Fm′值和藻細胞光合參數α、rETRmax和Ik值，對東海原甲藻的光合作用有顯著的抑制作用。因此，這3種植物浸提液中化感物質很有可能通過阻斷東海原甲藻第一電子受體QA和第二電子受體QB之間電子流，中斷藻細胞PSⅡ中電子傳遞鏈，從而抑制東海原甲藻的光合作用。