微流控芯片-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在細(xì)胞代謝與藥物代謝中的研究進(jìn)展

范芳芳，林金明

（1．清華大學(xué) 化學(xué)系，微量分析測試方法和儀器研制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100084；2．貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)教研室，貴州 貴陽 550025；3．貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科，貴州 貴陽 550000）

微流控芯片（Microfluidic chip）又稱芯片實(shí)驗(yàn)室（Lab on a chip），源于20世紀(jì)90年代。在最初發(fā)展階段，微流控芯片主要目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)分析儀器小型化，但隨著微流控芯片上集成微閥、微泵等技術(shù)的快速發(fā)展，“芯片實(shí)驗(yàn)室”應(yīng)運(yùn)而生，應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大到生命科學(xué)、生物醫(yī)藥、環(huán)境檢測等領(lǐng)域，被Forbes雜志列為影響人類未來15件最重要的發(fā)明之一［1］。經(jīng)過30多年的發(fā)展，微流控芯片技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞分析、藥物篩選、免疫分析、蛋白檢測、基因檢測、化學(xué)合成以及樣品前處理等多個(gè)領(lǐng)域，實(shí)現(xiàn)了集成化和自動(dòng)化發(fā)展［2］。微流控分析系統(tǒng)通過設(shè)計(jì)和制造各種構(gòu)型的微通道網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)對(duì)通道內(nèi)流體的操控和檢測，將化學(xué)和生物等領(lǐng)域中所涉及的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測及細(xì)胞培養(yǎng)、分選、裂解等基本操作單元集成或基本集成到一塊幾平方厘米甚至更小的芯片上，以形成“芯片實(shí)驗(yàn)室”技術(shù)平臺(tái)，與其他檢測技術(shù)聯(lián)用增強(qiáng)分析功能［3］。目前，常見的微流控分析檢測系統(tǒng)主要有光學(xué)、電化學(xué)、質(zhì)譜等［4］。

大健康時(shí)代背景下，人類疾病的預(yù)防、診斷和治療研究成為“健康中國”戰(zhàn)略的重要組成部分［5］。在疾病治療方面，新藥研發(fā)是解決此問題的主要研究目標(biāo)。但是，藥物研發(fā)過程往往是漫長而復(fù)雜的，如何高效快速篩選出潛在有效組分，一直是困擾新藥研發(fā)科研工作者的關(guān)鍵問題。目前，通過體外細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行藥物活性評(píng)價(jià)成為藥物篩選初期最主要的手段之一。但現(xiàn)階段細(xì)胞培養(yǎng)多以普通靜態(tài)培養(yǎng)為主，并不能很好地反映機(jī)體內(nèi)細(xì)胞微環(huán)境狀態(tài)。而微流控芯片技術(shù)可進(jìn)行細(xì)胞動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，高度模擬細(xì)胞體內(nèi)動(dòng)態(tài)微環(huán)境，能集成其他功能單元，具有分析速度快、通量高、靈敏度高、分辨率高、試劑消耗量低等優(yōu)勢，受到諸多生命領(lǐng)域與醫(yī)藥領(lǐng)域科研工作者的青睞，近年來廣泛應(yīng)用于細(xì)胞與藥物分析研究中［6］。在現(xiàn)有多功能集成檢測分析系統(tǒng)中，微流控芯片-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)可實(shí)時(shí)在線分析細(xì)胞與藥物的代謝情況，在揭示細(xì)胞特性、細(xì)胞與細(xì)胞之間代謝通訊以及藥物作用代謝分析中具有獨(dú)特優(yōu)勢［2］。本文主要綜述近年來微流控芯片-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)及其在細(xì)胞代謝檢測、藥物作用代謝等方面的應(yīng)用研究進(jìn)展，并重點(diǎn)討論和展望了未來其在細(xì)胞代謝和藥物研發(fā)方向面臨的挑戰(zhàn)和前景。

1 微流控芯片-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

與微流控芯片聯(lián)用的檢測技術(shù)主要有光學(xué)檢測法、電化學(xué)檢測法和質(zhì)譜法［7］。光學(xué)和電化學(xué)檢測方法均具有較高的靈敏度，但也有相應(yīng)的局限性，如不能提供化合物的結(jié)構(gòu)信息，存在樣品檢測范圍受限、標(biāo)記操作復(fù)雜等問題，經(jīng)常無法對(duì)多種目標(biāo)化合物同時(shí)進(jìn)行定性和定量分析［8］。質(zhì)譜分析是一種根據(jù)質(zhì)荷比差異對(duì)樣品離子進(jìn)行分離、定性和定量分析的方法，與微流控芯片聯(lián)用，具有高效、快速、高通量、樣品結(jié)構(gòu)信息豐富、可微量檢測等特點(diǎn)［4］。

微流控芯片-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)最早由Ramsey［9］和Karger［10］等于1997年率先建立。隨后，微流控芯片-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的相關(guān)研究逐漸被報(bào)道。尤其在微流控芯片和質(zhì)譜聯(lián)用接口方面，有效接口是二者聯(lián)用的關(guān)鍵，也是制約二者聯(lián)用的重要瓶頸之一。根據(jù)離子源不同，目前二者之間主要有電噴霧電離（ESI）和基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）兩種接口，兩種接口以在線和離線方式相連［11］。其中，ESI通常采用在線接口檢測方式，而MALDI多采用離線收集后檢測方式。在線芯片ESI源主要通過在芯片通道末端平口處形成噴霧、外接毛細(xì)管作為噴嘴或芯片上微加工形成一體化噴嘴3種方式進(jìn)行電離檢測［12］。MALDI離子源在線檢測時(shí)，樣品被送入真空中進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測；離線檢測時(shí)，樣品在芯片上反應(yīng)收集后，轉(zhuǎn)移到MALDI板進(jìn)行檢測［8］。ESI是目前微流控芯片-質(zhì)譜聯(lián)用中最常用的電離方式。

1.1 微流控芯片-質(zhì)譜聯(lián)用ESI接口

早期ESI源接口為Karger［13］和Ramsey［14］所應(yīng)用的芯片通道末端直噴接口，該類型的接口早期存在接口死體積大、噴霧穩(wěn)定性差和不適于混合物分離等問題。但經(jīng)過不斷改進(jìn)制得有利于液體形成的泰勒錐，其分離速度快、噴霧穩(wěn)定，目前已實(shí)現(xiàn)商品化，與質(zhì)譜聯(lián)用常用于蛋白組學(xué)研究［15-20］。隨后，出現(xiàn)大量以毛細(xì)管作為電噴霧噴針在芯片上的應(yīng)用報(bào)道。Harrison［21］課題組將電噴霧噴針與芯片結(jié)合，首次實(shí)現(xiàn)了微流控芯片電泳與質(zhì)譜的聯(lián)用；Li等［22］以插入芯片直角處的毛細(xì)管為噴口，通過在芯片內(nèi)設(shè)計(jì)流體通道，實(shí)現(xiàn)了對(duì)氨基酸的分離檢測，但因外接噴口存在死體積等因素，嚴(yán)重影響了電泳分離效果。本課題組前期將短熔硅毛細(xì)管附著在微芯片上構(gòu)建鞘流電噴霧界面，使樣品液和霧化氣體通過2個(gè)不銹鋼三通同軸泵輸送，以保持穩(wěn)定和高效的電噴霧效果，最終成功用于多肽的分離和鑒定［23］；Franssila［24］設(shè)計(jì)了一種微流控芯片與帶有聚四氟乙烯套管的石英毛細(xì)管連接，通入霧化氣體輔助產(chǎn)生噴霧，增加了樣品離子化效率，提高了信號(hào)強(qiáng)度。此外，Zhao等［25］設(shè)計(jì)了一種微流控芯片與不銹鋼噴針相連的接口，通過在芯片上固定抗體，實(shí)現(xiàn)了在線提取并定量分析了牛奶中的喹諾酮類藥物殘留。此類外接噴針型噴口，穩(wěn)定性和離子化效果較好，但存在漏液等現(xiàn)象。因此，大量芯片質(zhì)譜一體化接口被研究報(bào)道，這種接口避免了上述芯片直接接口和外接噴針接口存在的問題，逐漸成為芯片-ESI/MS的主要接口方式［26］。高分子材料芯片因制作簡單、柔韌性和可塑性較好等優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于芯片一體化接口技術(shù)。一體化接口技術(shù)前期研究一般通過設(shè)計(jì)制作陽模，澆鑄聚二甲基硅氧烷（PDMS）制作成一體化接口的PDMS芯片［27］。但高分子材料會(huì)溶于部分有機(jī)溶劑，從而影響目標(biāo)物的質(zhì)譜檢測。因此，Sun［28］課題組采用溶劑提前清洗PDMS中的雜質(zhì)，排除了信號(hào)干擾，提升了質(zhì)譜信號(hào)的信噪比。除高分子材料外，玻璃芯片也有一體化接口應(yīng)用。Belder［29-30］課題組首次在玻璃芯片末端制造出錐形尖端，可在一定條件下實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定噴霧，并應(yīng)用于藥物分析；Svedberg［31］課題組用微機(jī)械加工方法和手工方法在聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）和聚碳酸酯（PC）上打磨出2D和3D的噴口；He［32］課題組采用轉(zhuǎn)磨的方式在玻璃芯片通道末端加工一體化探針，用于外界試樣/試劑與芯片的接口及芯片接口，建立了高通量連續(xù)換樣分析系統(tǒng)。Mao等［33］在硅片上研發(fā)了一種由96個(gè)10噴嘴發(fā)射體組成的環(huán)形陣列的多噴嘴發(fā)射體陣列，該平臺(tái)具有無交叉污染、實(shí)驗(yàn)高度平行等優(yōu)點(diǎn)。Sainiemi等［34］提出使用標(biāo)準(zhǔn)的微加工技術(shù)（沉積、光刻和濕法刻蝕）制造3D電噴霧尖端接口，此種芯片接口產(chǎn)生的噴霧穩(wěn)定，具有良好的重復(fù)性，有利于批量生產(chǎn)。目前，ESI源是微流控芯片與質(zhì)譜聯(lián)用的主要離子化方式，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物分子的分析。

1.2 微流控芯片-質(zhì)譜聯(lián)用MALDI接口

MALDI通常是解析樣品與基質(zhì)的共結(jié)晶固體，結(jié)合質(zhì)譜廣泛應(yīng)用于生物樣品的分析。因微流控芯片樣品大多以液體為主，故微流控芯片-質(zhì)譜聯(lián)用的MALDI連接多以離線分析為主。Nilsson［35］課題組將樣品前處理、進(jìn)樣系統(tǒng)、集成有蛋白質(zhì)酶解反應(yīng)器的硅芯片以及微型吸樣器串聯(lián)，待樣品酶解反應(yīng)后，由微型吸樣器轉(zhuǎn)移至基質(zhì)板上進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜（MALDI-MS）檢測。Mesbah等［36］研制了一種自動(dòng)液滴微流控系統(tǒng)，在油水混合物中生成可監(jiān)測的納升液滴，通過高精度的程序控制，實(shí)現(xiàn)接口與靶板的對(duì)準(zhǔn)，使液滴均勻滴加到靶板上，隨后用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）分析肽或蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物。除離線上樣檢測模式外，也有以芯片為反應(yīng)器和靶板在芯片上直接測定的設(shè)計(jì)應(yīng)用。Wang等［37］在玻璃芯片上完成蛋白質(zhì)等電聚焦分離后滴加基質(zhì)，達(dá)到基質(zhì)樣品共結(jié)晶，隨后經(jīng)MALDI-TOF MS分析了腦脊液微透析液樣本，實(shí)現(xiàn)了在不除鹽的前提下，對(duì)微量復(fù)雜樣品的快速分離分析；Mikkonen等［38］也采用類似方法完成了腦脊液和血漿樣品的分析；Guo等［39］在PDMS芯片開放通道內(nèi)進(jìn)行毛細(xì)管等電聚焦分離后，加入輔助基質(zhì)混合樣品，直接在芯片上進(jìn)行激光離子化檢測；Li等［40］制備了一種納米金修飾的多孔硅芯片結(jié)合表面輔助激光解吸電離質(zhì)譜（SALDI-MS）檢測癌細(xì)胞中的谷胱甘肽。

綜上所述，微流控芯片-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)主要有ESI源和MALDI源2種接口。2種離子源的性能和接口決定了其應(yīng)用范圍差異。MALDI源接口通常用于生物大分子如蛋白、核酸等檢測，而ESI除了可用于蛋白、酶、多肽等生物大分子檢測外，還常用于細(xì)胞微環(huán)境中代謝小分子和藥物代謝檢測。

1.3 ESI與MALDI接口的優(yōu)缺點(diǎn)

微流控芯片-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)ESI源和MALDI源接口技術(shù)的不斷成熟，極大促進(jìn)了檢測范圍的增加。ESI 3種不同接口技術(shù)及MALDI接口的不斷改進(jìn)，在實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢集聚的同時(shí)也存在一定的局限性。其各自優(yōu)缺點(diǎn)的總結(jié)見表1。

表1 微流控芯片-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)主要接口技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)Table 1 The main advantages and disadvantages of microfluidic chip-mass spectrometry interface technology

2 微流控芯片-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在細(xì)胞代謝研究中的應(yīng)用

細(xì)胞作為生命活動(dòng)的基本結(jié)構(gòu)和功能單元，其微環(huán)境發(fā)生微小變化將導(dǎo)致生物體的生理功能異常，造成機(jī)體病理變化，形成疾病。細(xì)胞代謝中間產(chǎn)物或分泌的小分子是細(xì)胞微環(huán)境的重要組成部分。因此，從分子水平分析細(xì)胞代謝產(chǎn)物，以探究細(xì)胞代謝功能、信號(hào)傳導(dǎo)通訊及微環(huán)境變化，已成為疾病機(jī)制研究及活性藥物篩選的重要研究方向。隨著科技發(fā)展，各種體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)不斷完善，其中微流控芯片細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)因可高度模擬體內(nèi)動(dòng)態(tài)微環(huán)境而廣泛應(yīng)用于各種體外細(xì)胞或器官模型的建立及應(yīng)用［2，4］。微流控芯片技術(shù)具有微型化、集成化、微米級(jí)尺度空間與良好的操作性能等特點(diǎn)，通過聯(lián)合多種檢測系統(tǒng)可進(jìn)行相應(yīng)細(xì)胞生物功能分析，最常用的有光學(xué)、電化學(xué)、質(zhì)譜等檢測方法。由于微流控芯片細(xì)胞培養(yǎng)樣品量小、目標(biāo)分析物含量低、樣品成分復(fù)雜等因素，芯片細(xì)胞培養(yǎng)代謝物及分泌物分析以采用微流控芯片-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)為主。

細(xì)胞代謝物的微流控芯片-質(zhì)譜聯(lián)用分析技術(shù)，除接口外，最關(guān)鍵的是芯片功能設(shè)計(jì)，目前已有各種功能的芯片被研發(fā)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，可靈活變化芯片表面修飾、連接電極、通道直徑、長度等相關(guān)參數(shù)，制備相應(yīng)功能的芯片開展細(xì)胞代謝分析。Zhong等［41］設(shè)計(jì)了一種新型無需標(biāo)記的定量測定微流控芯片，使細(xì)胞分泌物在芯片通道內(nèi)基質(zhì)上吸附富集，基于肽含量與通道帶長之間的線性關(guān)系，通過MS成像測定通道長度對(duì)細(xì)胞分泌肽進(jìn)行定量分析，測得了氯化鉀（KCl）量升高后刺激海兔袋細(xì)胞神經(jīng)元分泌的酸性肽和α-袋細(xì)胞肽的含量。該方法穩(wěn)定、無需標(biāo)記，通常用于小型化微流控設(shè)備的離線表征。Li等［42］報(bào)道了一種新的微流控平臺(tái)，設(shè)計(jì)的芯片集成了電池大小般用于快速單細(xì)胞裂解的高壓區(qū)域，可用于電泳分離的微流控通道以及用于MS檢測電離的納米電噴霧發(fā)射器，該平臺(tái)利用雙納米電極細(xì)胞裂解技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞自動(dòng)分析與質(zhì)譜檢測。在此基礎(chǔ)上，開發(fā)了用于單細(xì)胞自動(dòng)分析的微芯片電泳-質(zhì)譜法（MCE-MS）（圖1A），該方法整合細(xì)胞導(dǎo)入、細(xì)胞裂解和MCE-MS分析為一個(gè)周期，此過程由計(jì)算機(jī)控制可進(jìn)行連續(xù)分析，成功測定了不同條件下PC-12細(xì)胞中多巴胺（DA）和谷氨酸（Glu）的含量差異，表明其所提出的MCE-MS分析平臺(tái)在細(xì)胞水平的研究中具有很大潛力。Li等［40］制備了一種納米金修飾的多孔硅芯片聯(lián)用SALDI-MS檢測谷胱甘肽（GSH），成功檢測不同細(xì)胞以及不同藥物條件刺激下腫瘤細(xì)胞裂解液中的GSH水平（圖1B）。Brown等［43］采用微流控芯片構(gòu)建體外神經(jīng)血管單元（NVU）培養(yǎng)模型（圖1C），給予炎癥刺激后收集神經(jīng)血管單元培養(yǎng)基，經(jīng)過系列樣品處理后，再進(jìn)行質(zhì)譜分析。De Bem等［44］首次在微流控芯片上體外模擬牛子宮器官芯片（圖1D），與MS聯(lián)用測定不同濃度葡萄糖和胰島素處理后細(xì)胞分泌蛋白組的變化，從而揭示母體葡萄糖和胰島素改變對(duì)子宮功能的影響機(jī)制。Jellali等［45］采用微流控生物芯片大鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)與氣相色譜-質(zhì)譜代謝組學(xué)分析相結(jié)合的方法，揭示了農(nóng)藥滴滴涕（DDT）、撲滅司林（PMT）及其混合物毒性的生物標(biāo)志物。綜上所述，微流控芯片-質(zhì)譜聯(lián)用分析中細(xì)胞培養(yǎng)模式涵蓋單細(xì)胞、多細(xì)胞、器官芯片等多種細(xì)胞培養(yǎng)分析類型，微流控芯片的功能具有多樣性，與質(zhì)譜聯(lián)用可高通量、快速、準(zhǔn)確測定目標(biāo)代謝產(chǎn)物；此外，根據(jù)細(xì)胞代謝產(chǎn)物的性質(zhì)差異，在細(xì)胞代謝質(zhì)譜檢測過程中，微流控芯片可與液相色譜-質(zhì)譜、MALDI-MS和氣相色譜-質(zhì)譜等多種方法結(jié)合進(jìn)行檢測。

圖1 微流控芯片-質(zhì)譜聯(lián)用用于細(xì)胞代謝分析Fig．1 Cell metabolism analysis by microfluidic chip-mass spectrometry

早期微流控芯片-質(zhì)譜聯(lián)用分析細(xì)胞代謝物常用離線檢測，此過程往往需要進(jìn)行樣品預(yù)處理，但由于微流控平臺(tái)細(xì)胞培養(yǎng)分析系統(tǒng)的體積有限，傳統(tǒng)離線樣品預(yù)處理消耗量較大或有損失，不利于樣品實(shí)際情況的檢測。近年來，為提高平臺(tái)的集成度和自動(dòng)化程度，避免離線法中的樣品丟失，在線預(yù)處理及檢測相繼被研發(fā)并應(yīng)用。自2008年以來，本課題組開展了一系列微流控芯片-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)研究［46-62］，通過不斷改進(jìn)微流控芯片-質(zhì)譜聯(lián)用接口技術(shù)，將microSPE柱集成到細(xì)胞培養(yǎng)芯片中，構(gòu)建了細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞代謝樣品在線處理與質(zhì)譜聯(lián)用在線檢測平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞代謝及藥物體外篩選一體化操作，并與島津公司合作研發(fā)出世界上第一款商品化的微流控芯片-質(zhì)譜聯(lián)用在線細(xì)胞培養(yǎng)與檢測分析設(shè)備。Wei等［46］構(gòu)建了一種多通道微流控芯片-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)（圖2A），用以監(jiān)測不同條件下Aβ42誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞谷氨酸的分泌，該系統(tǒng)在芯片細(xì)胞培養(yǎng)與質(zhì)譜（ESI-Q-TOF MS）連接中間設(shè)計(jì)加入了多通道微型提取芯片，可去除鹽和蛋白質(zhì)的干擾。Gao等［47］將微流控芯片細(xì)胞培養(yǎng)-固相萃?。⊿PE）與在線電噴霧電離四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（ESI-Q-TOF MS）相結(jié)合（圖2B），集成了細(xì)胞培養(yǎng)、代謝產(chǎn)生、樣品預(yù)處理、檢測等功能單元，可用于相關(guān)的細(xì)胞/藥物代謝研究，建立了一種表征細(xì)胞/藥物代謝產(chǎn)物的新方法。此外，Wei等［48］還開展了微流控芯片細(xì)胞共培養(yǎng)耦合質(zhì)譜進(jìn)行相關(guān)代謝物分析（圖2C），證實(shí)了PC12細(xì)胞釋放多巴胺對(duì)GH3細(xì)胞生長激素分泌的抑制作用，該研究為闡述細(xì)胞與細(xì)胞之間通訊微環(huán)境機(jī)制提供了有利的研究平臺(tái)。Liu等［49］制備了一種用于細(xì)胞代謝研究的在線多通道微流控芯片-質(zhì)譜平臺(tái)（圖2D），無需任何前處理，采用紙噴霧電離法即可直接進(jìn)行樣品實(shí)時(shí)在線檢測，并通過預(yù)編程和自動(dòng)方式實(shí)現(xiàn)了不同通道正常細(xì)胞和癌癥細(xì)胞中乳酸的質(zhì)譜檢測。

圖2 微流控芯片-質(zhì)譜聯(lián)用用于細(xì)胞代謝分析Fig．2 Cell metabolism analysis via microfluidic chip-mass spectrometry

3 微流控芯片-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在藥物代謝中的應(yīng)用

傳統(tǒng)研究來看，開發(fā)一種新藥往往需10年左右的時(shí)間，其中藥物活性的篩選是藥物研發(fā)第一步，也是最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。藥物篩選以體外細(xì)胞作用活性為第一關(guān)卡，但傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)以靜態(tài)培養(yǎng)為主，無法很好地模擬體內(nèi)動(dòng)態(tài)微環(huán)境，造成藥物篩選活性與體內(nèi)作用之間的活性差異，不能更加準(zhǔn)確地篩選得有效藥物。微流控芯片技術(shù)的發(fā)展，使得體外細(xì)胞動(dòng)態(tài)培養(yǎng)成為可能，通過微流體控制可高度模擬細(xì)胞體內(nèi)微環(huán)境。近年來，微流控芯片單細(xì)胞培養(yǎng)、多細(xì)胞共培養(yǎng)、器官芯片構(gòu)建等技術(shù)的發(fā)展為新藥物的快速開發(fā)提供了新的方案［2，4］。

藥物研發(fā)第一步，是明確藥物可吸收入體發(fā)揮作用，科學(xué)家們通常以藥物滲透性評(píng)價(jià)藥物吸收情況。微流控芯片-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)用于藥物研發(fā)，藥物滲透性評(píng)價(jià)是第一步。本課題組前期構(gòu)建了一種微流控芯片-質(zhì)譜聯(lián)用裝置［50］，以姜黃素為模型藥物，探究了體外流體動(dòng)態(tài)模擬時(shí)其濃度的變化，結(jié)果測得其滲透性與文獻(xiàn)報(bào)道一致，證明該裝置在藥物滲透性研究方面的可行性。Chen等［51］研發(fā)了一款穩(wěn)定同位素標(biāo)記輔助的微流控芯片電噴霧質(zhì)譜（SIL-chip-ESI-MS）平臺(tái)（圖3A），用于細(xì)胞代謝的定性和定量分析，結(jié)果證明芯片-ESI-MS系統(tǒng)可選擇性和定量分析細(xì)胞藥物吸收和代謝物，具有高的穩(wěn)定性、靈敏度和重復(fù)性。藥物吸收入體后，明確其實(shí)際作用成分是原形藥物或藥物代謝產(chǎn)物，仍然是新藥有效性、安全性研究的重點(diǎn)。2012年，Gao等［52］集成了一種高通量微流控芯片-質(zhì)譜聯(lián)用藥物篩選技術(shù)裝置，集多梯度發(fā)生器、系列微型細(xì)胞培養(yǎng)室及SPE固相微萃取柱于一體，與質(zhì)譜聯(lián)用分析了HepG2和Caco-2細(xì)胞吸收甲氨蝶呤的情況，該方法具有試劑消耗最少、靈敏度高、高通量、快速和在線檢測等特點(diǎn)，可用于實(shí)時(shí)研究活細(xì)胞藥理學(xué)和動(dòng)力學(xué)。此后，Mao等［53］構(gòu)建了同時(shí)用于細(xì)胞培養(yǎng)、代謝物分析和細(xì)胞毒性分析的微流控裝置，成功模擬藥物在人體肝臟的代謝情況，并可以測定藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性與藥物/代謝物濃度之間的關(guān)系；Zhang等［54］基于微流控芯片細(xì)胞共培養(yǎng)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，成功建立了體外肝-腫瘤模型，測定了卡培他濱代謝產(chǎn)物；Liu等［55］制備了一種用于細(xì)胞代謝研究的在線多通道微流控芯片-質(zhì)譜分析平臺(tái)，采用紙噴霧電離法直接進(jìn)行樣品的實(shí)時(shí)在線檢測，揭示了α-氰基-4-羥基肉桂酸酯對(duì)不同類型癌細(xì)胞的抑制作用及劑量-依賴信息均有差異；Wu等［56］采用直接高壓電離的方式作用于微流控芯片共培養(yǎng)細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)藥物環(huán)磷酰胺樣品電離，耦聯(lián)質(zhì)譜檢測其變化；Jie等［57］研制了一種中空纖維雙層微流控芯片以制備體外腸-肝模型（圖3B），建立藥物經(jīng)腸吸收于肝臟代謝功能，成功用于藥物的吸收和代謝研究，為體外細(xì)胞功能模型和藥物吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝提供了科學(xué)平臺(tái)；Zheng等［58］基于微流控芯片耦合質(zhì)譜多功能分析平臺(tái)，連續(xù)給藥作用于芯片培養(yǎng)腔內(nèi)腫瘤細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)微囊模型，聯(lián)合質(zhì)譜檢測腫瘤細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)和共培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)液中的藥物吸收差異，以揭示腫瘤治療過程中的耐藥性；Xu等［59］開展了一種流體分離輔助均質(zhì)流壓微流控芯片-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)（圖3C），可實(shí)時(shí)檢測25-羥基維生素D3代謝產(chǎn)物24，25-二羥基維生素D3的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)代謝產(chǎn)物在正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞中的含量有顯著差異；Lin等［60］通過集成微流控芯片-質(zhì)譜聯(lián)用裝置，構(gòu)建了腫瘤血管網(wǎng)絡(luò)模型和細(xì)胞共培養(yǎng)微環(huán)境（圖3D），研究了載藥納米粒子在腫瘤周圍血管生態(tài)位中的藥物傳遞與代謝分析；Fan等［61］基于微流控芯片-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對(duì)去鐵胺誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞缺氧代謝過程小分子進(jìn)行測定，結(jié)合分子生物學(xué)方法揭示了紅景天苷減輕BV2小膠質(zhì)細(xì)胞缺氧炎癥損傷的作用機(jī)制；Han等［62］采用微流控芯片-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，實(shí)時(shí)監(jiān)測7-羥基香豆素（7-OHC）對(duì)不同細(xì)胞外pH環(huán)境下微流體培養(yǎng)細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)乳酸含量的增加可促進(jìn)7-OHC非活性代謝成分的形成，提示細(xì)胞外低pH環(huán)境會(huì)削弱7-OHC的抗癌作用。經(jīng)過多年的研究工作積累，本課題組構(gòu)建了一種成熟的微流控芯片-質(zhì)譜聯(lián)用分析設(shè)備，該設(shè)備集成了多通道微流控芯片，可用于細(xì)胞培養(yǎng)和樣品凈化富集，并可通過毛細(xì)管與質(zhì)譜連接。整個(gè)系統(tǒng)由7個(gè)部分組成，包括微流道細(xì)胞培養(yǎng)芯片、微注射泵送液單元、細(xì)胞培養(yǎng)單元、細(xì)胞進(jìn)樣和代謝物提取單元、色譜預(yù)處理與分析單元、質(zhì)譜檢測單元及軟件控制單元，實(shí)現(xiàn)了芯片上細(xì)胞動(dòng)態(tài)培養(yǎng)、實(shí)時(shí)顯微觀察和代謝物自動(dòng)化提取及測定，已成為高通量、低成本的細(xì)胞代謝和藥物篩選研究在線分析平臺(tái)［51-53，59-63］。

圖3 微流控芯片-質(zhì)譜聯(lián)用用于藥物代謝分析Fig．3 Drug metabolism analysis by microfluidic chip-mass spectrometry

細(xì)胞代謝與藥物代謝的微流控芯片-質(zhì)譜聯(lián)用分析中，芯片細(xì)胞培養(yǎng)從單個(gè)細(xì)胞、多細(xì)胞到器官芯片多個(gè)層次，開展了細(xì)胞自身代謝微環(huán)境、細(xì)胞與細(xì)胞之間代謝通訊、多功能器官芯片代謝及藥物作用機(jī)制等方面的研究。在現(xiàn)有研究中，以1種細(xì)胞或細(xì)胞共培養(yǎng)研究居多，針對(duì)單細(xì)胞代謝研究甚少。近年來，單個(gè)細(xì)胞分析逐漸成為人們研究細(xì)胞異質(zhì)性及其所處微環(huán)境的焦點(diǎn)，微流控芯片單細(xì)胞質(zhì)譜分析也逐漸應(yīng)用到該領(lǐng)域。Xie等［64］首次證明了微流控芯片和基質(zhì)輔助激光解吸/電離質(zhì)譜（MALDI-MS）的結(jié)合，可用于高通量和自動(dòng)單細(xì)胞磷脂質(zhì)分析（圖4A）；Huang等［65］基于微流控芯片建立了一種單細(xì)胞原位提取質(zhì)譜分析方法（圖4B），能夠在線提取單細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)譜分析，成功用于檢測單細(xì)胞磷脂酰膽堿；Liu等［66］基于微流控芯片技術(shù)建立一種微流體表面萃取器（MSE）（圖4C），與質(zhì)譜聯(lián)用成功分析了3種腫瘤細(xì)胞表面的磷脂分子，發(fā)現(xiàn)不同癌細(xì)胞的磷脂分子含量存在顯著差異。從上述研究可以發(fā)現(xiàn)，微流控芯片-質(zhì)譜聯(lián)用單細(xì)胞分析主要聚焦在脂質(zhì)和磷脂的研究，對(duì)單細(xì)胞代謝研究較少，這可能與單個(gè)細(xì)胞代謝產(chǎn)物的含量太少有關(guān)。近期，本課題組開發(fā)了一種具有液壁的雙功能開放平臺(tái)（圖4D），用于實(shí)時(shí)監(jiān)測和原位捕獲/分析腫瘤細(xì)胞［67］。采用液滴按需噴墨打印技術(shù)，創(chuàng)建了含單細(xì)胞的液滴陣列，基于腫瘤獨(dú)特的代謝現(xiàn)象（“Warburg effect”），根據(jù)分泌的乳酸含量，可從正常細(xì)胞中識(shí)別和分離出腫瘤細(xì)胞，基于微升水平的液滴體積，可迅速達(dá)到可檢測的濃度。隨后，去除液壁和加入基質(zhì)，透明導(dǎo)電薄膜（ITO）玻璃上的腫瘤細(xì)胞可通過質(zhì)譜（MS）直接分析。該研究為單細(xì)胞代謝物檢測開辟了新途徑，或可為后續(xù)單細(xì)胞非靶向代謝檢測提供有利的參考依據(jù)。

圖4 微流控芯片-質(zhì)譜聯(lián)用用于單細(xì)胞分析Fig．4 Single cell analysis by microfluidic chip-mass spectrometry

4 總結(jié)與展望

經(jīng)過20多年的發(fā)展，微流控芯片-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)已經(jīng)成為細(xì)胞生物學(xué)研究的重器，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞代謝和藥物篩選（包括藥物吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝等）研究中，尤其是集細(xì)胞培養(yǎng)、樣品富集處理、質(zhì)譜聯(lián)用一體化，實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測細(xì)胞與藥物代謝變化功能等諸多優(yōu)勢，受到廣大生命科學(xué)和醫(yī)藥科學(xué)研究工作者的青睞。給科研工作帶來福音的同時(shí)，微流控芯片-質(zhì)譜聯(lián)用也存在諸多需完善的問題。首先，如何使干擾因素盡可能小地將二者聯(lián)用是未來待完善的工作。目前，二者之間接口主要是ESI源和MALDI源，ESI源接口相對(duì)MALDI源接口發(fā)展更為成熟，應(yīng)用更多。MALDI源接口目前以離線檢測為主，檢測時(shí)間相對(duì)較長，或可深入優(yōu)化接口，探究可快速產(chǎn)生共結(jié)晶的基質(zhì)，減少共結(jié)晶時(shí)間，也是提升樣品檢測速率的有效途徑。ESI電離源目前主要用于細(xì)胞代謝、藥物小分子、多肽和一定質(zhì)量范圍內(nèi)的蛋白等分子分析，MALDI電離源主要用于核酸、蛋白質(zhì)等大分子檢測。目前，體外細(xì)胞疾病模型或藥物活性篩選研究中，通常將細(xì)胞代謝小分子和蛋白質(zhì)的研究分開，以質(zhì)譜技術(shù)探究小分子不同環(huán)境下的變化差異，以分子生物學(xué)方法探究小分子涉及到通路中的蛋白變化，最后綜合二者變化差異借助計(jì)算機(jī)方法進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。但往往二者所取樣品大多不是同一批，可能存在一定的差異性。未來若設(shè)計(jì)一種ESI源與MALDI源并聯(lián)接口的微流控芯片-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)平臺(tái)，以ESI測定細(xì)胞培養(yǎng)中小分子，以MALDI源測定細(xì)胞蛋白質(zhì)，同時(shí)在線測得樣品差異代謝物與相關(guān)差異蛋白，更能完整體現(xiàn)和說明細(xì)胞微環(huán)境及病理改變機(jī)制。

細(xì)胞代謝分析與藥物代謝評(píng)估是新藥篩選與開發(fā)的重要途徑，在維持人類健康中具有重大意義。隨著各種生命科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，微流控芯片-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)將更加完善，進(jìn)而加快新藥開發(fā)進(jìn)程，并為開發(fā)更加安全、有效的藥物提供有利的技術(shù)支撐。