• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    三葉青突變體的理化成分評(píng)價(jià)與分子鑒定

    2022-09-21 12:52:48董云哲金澤蘭林宏峻沈曉霞高志偉周志丹王忠華
    核農(nóng)學(xué)報(bào) 2022年10期
    關(guān)鍵詞:近緣總皂苷類群

    董云哲 金澤蘭 林宏峻 沈曉霞 高志偉 周志丹 王忠華,*

    (1 浙江萬里學(xué)院生物技術(shù)研究所,浙江 寧波 315100;2 浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,浙江 杭州 311402;3 杭州中澤生物科技有限公司,浙江 杭州 310023)

    三葉青(TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg),又名蛇附子、金線吊葫蘆、石老鼠等,為葡萄科崖爬藤屬多年生常綠草質(zhì)蔓生藤本植物,廣泛分布于我國中部、東部、南部諸省[1-3]。三葉青自明代《本草綱目》首次記載[4]以來,被廣泛用于清熱、解毒、消炎、止痛、驚厥、肺炎、肝炎、腦膜炎、蛇蟲叮咬[5]等病癥;近年來,其在抗炎[6]、抗氧化[7]、抗癌[7-11]等方面的作用被不斷驗(yàn)證;三葉青中多糖[8,12]、黃酮[13]、酚酸[4]、礦物質(zhì)、氨基酸等藥理成分對(duì)細(xì)胞[8,10]、機(jī)體[14-15]的作用機(jī)制已被逐步闡明,尤其為癌癥治療提供了新的視野與研究方向[16-17]。然而,目前三葉青的種質(zhì)資源大部分來自野生或地方種,種質(zhì)資源匱乏問題已成為三葉青產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸之一。因此,近年來雜交、快繁、突變、轉(zhuǎn)錄代謝等多種種質(zhì)研究技術(shù)被不斷應(yīng)用到三葉青優(yōu)良種質(zhì)培育的研究中,且取得了一定進(jìn)展[18]。同時(shí),杭州中澤生物科技有限公司、浙江大學(xué)等單位使用60Co-γ輻射育種技術(shù),以新選育的三葉青新品種澤青1號(hào)為親本進(jìn)行誘變育種,獲得了一批突變體,為三葉青新品種選育提供了資源條件。

    目前,前人關(guān)于三葉青分子鑒定或親緣遺傳的研究以不同品種三葉青居多[19-25],在品種選育、遺傳、進(jìn)化的研究上具有一定限制性,使其研究范圍只能局限在生物分類學(xué)的種及以上層級(jí)中,對(duì)種內(nèi)優(yōu)良品種的選育貢獻(xiàn)度有限,對(duì)種內(nèi)品種選育、進(jìn)化分析參考價(jià)值同樣具有局限性。因此本試驗(yàn)所用的三葉青突變體為60Co-γ射線處理澤青1號(hào)得到,彌補(bǔ)了上述前人所選材料的不足,使得本研究兼具科研和商業(yè)價(jià)值。此外,多數(shù)前人研究中僅以總酮含量為不同品種三葉青的差異指標(biāo),缺乏其他指標(biāo)的對(duì)比,其試驗(yàn)結(jié)果說服力有限。鑒于此,本試驗(yàn)以澤青1號(hào)突變體為研究對(duì)象,采用現(xiàn)代分析技術(shù)進(jìn)行多糖、總酮、礦物質(zhì)、氨基酸等多種藥效成分的檢測,以期明確這些突變體的育種利用價(jià)值,綜合篩選適宜商業(yè)種植的品系,為三葉青的多元化定向化育種提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料與儀器

    材料為三葉青澤青1號(hào)及其突變體101、102、103、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、120、123、124、125、126、127、130、131、132的葉片與成熟塊根,以及中澤、廣西、ZD-2的葉片與成熟塊根。葉片采集日期為2021年4月15日。其中突變體采用200 Gy的60Co-γ射線處理三年生的澤青1號(hào)種子培育而成,三葉青塊根在40℃下干燥后磨粉,過100目篩備用,葉片置于-80℃超低溫冰箱中備用。

    ICAP6300電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀,美國Thermo;L8900全自動(dòng)氨基酸分析儀,日本HITACH;Acquity/NamoUPLC/Synapt G2 MS/LC-MS液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國Waters;Barnstead LabTower EDI 超純水儀,美國Thermo;ETHOS 1微波消解儀,意大利Milestone;SQP電子分析天平,型號(hào)BSA124 S,德國Sartorius。

    試劑為:牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、考馬斯亮藍(lán)G250、無水乙醇(分析純)、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、硫酸(分析純)、礦物質(zhì)元素混標(biāo)溶液(國家有色金屬及電子材料分析測試中心)、硝酸(優(yōu)級(jí)純)、甲醇(色譜純)、氨水(色譜純)、乙腈(色譜純)。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 總物質(zhì)含量測定 建立總糖(可溶多糖)、總酮、總皂苷、總蛋白(可溶蛋白質(zhì))、總酚的五因素(溶劑濃度、料液比、超聲功率、溫度、時(shí)間)五水平正交體系共25組,以澤青1號(hào)干粉為材料篩選最優(yōu)試驗(yàn)方案:稱取1.0 g澤青1號(hào)干燥粉末,按照正交表試驗(yàn)組依次控制條件進(jìn)行。超聲結(jié)束,冷卻至室溫,用該試驗(yàn)組濃度乙醇溶劑補(bǔ)足失重,4℃靜置過夜,3次重復(fù)。

    1.2.2 礦物質(zhì)含量測定 混標(biāo)溶液Al、As、Ba、Cr、Cu、Fe、Mg、Mn、Pb、Zn,5%硝酸(優(yōu)級(jí)純)梯度稀釋,以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),信號(hào)強(qiáng)度為縱坐標(biāo),建立線性回歸方程。精密稱取0.300 0 g藥材粉末于聚四氟乙烯消解罐中,加入優(yōu)級(jí)純濃硝酸5 mL、雙氧水3 mL,裝入微波消解儀中進(jìn)行消解,10 min升溫至180℃,全程40 min,冷卻至室溫后取出,5%硝酸定容至10 mL,4℃保存,3次重復(fù)。樣本定容液置于電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀上機(jī)測定,具體步驟參考儀器說明書。

    1.2.3 游離氨基酸含量測定 選定澤青1號(hào)、101、103、107、109、112、113、114、126、中澤、廣西共11個(gè)株系突變體,3次重復(fù)。稱取1 g樣品,用50 mL 0.04 mol·L-1鹽酸(優(yōu)級(jí)純)浸提30 min;搖勻后過濾,吸取濾清液2 mL于離心試管中,加入8%磺基水楊酸2 mL,混勻,靜置15 min;10 000 r·min-1離心10 min;取上清液,過0.22 μm膜后全自動(dòng)氨基酸分析儀上機(jī),輸出圖譜換算單位含量分析,具體步驟參考儀器說明書。

    1.2.4 DNA條形碼分析 使用DP360多糖多酚植物基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取突變體葉片DNA,使用E035 2×Fast Pfu Master Mix(上海近岸蛋白質(zhì)科技有限公司)按說明書添加DNA與引物ITS4(5′-T C C T C C G C T T A T T G A T A T GC-3′)反應(yīng)體系(50 μL)進(jìn)行PCR擴(kuò)增;對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳(電泳條件:135V/135 mA/35 min),分離特異性條帶并割膠回收送至杭州擎科生物公司測序;通過Sequencing Analysis 5.2分析峰圖數(shù)據(jù),并使用DNAMAN、MEGA-X MEGA7.0等進(jìn)行多序列比對(duì)、突變位點(diǎn)篩選、同源性分析、BLAST比對(duì)、特異引物與探針設(shè)計(jì)等操作。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 正交體系分析

    三葉青超聲提取正交體系中25組方案各組總糖、總酮、總皂苷、總蛋白、總酚的單位含量分布(圖1)和濃度分布(圖2)顯示,第1、第8、第15、第17及第24組提取效果較好,最優(yōu)提取方案為:取1.0 g樣品粉末置于50 mL離心管,向離心管中加入25 ml 50%乙醇,將離心管置于超聲設(shè)備中;超聲設(shè)備控溫60℃,以功率400 W對(duì)樣品溶液持續(xù)超聲處理25 min。正交體系中25組方案的總物質(zhì)單位含量(圖1)顯示,25組含量折線之間縱向增幅不同、不相交且整體趨勢相同,表明總糖、總酮、總皂苷、總蛋白、總酚五類總物質(zhì)間具有一定相關(guān)性。

    2.2 總物質(zhì)相關(guān)性分析

    以正交體系所得最優(yōu)提取方案提取26份三葉青樣本的總物質(zhì),以澤青1號(hào)的總糖、總酮、總皂苷、總蛋白、總酚的單位含量為對(duì)照,計(jì)算各突變體總糖、總酮、總皂苷、總蛋白、總酚的含量,通過含量差異以Kendalls、Pearson、Spearman函數(shù)計(jì)算總糖、總酮、總皂苷、總蛋白、總酚之間的相關(guān)系數(shù)(圖3),結(jié)果表明,在26份樣本中,總糖、總酮、總皂苷三者之間具有極顯著相關(guān)性,總糖、總酮、總皂苷三者與總酚之間具有顯著相關(guān)性,總蛋白與其他總物質(zhì)相關(guān)性普遍較低。

    2.3 總物質(zhì)含量差異

    以澤青1號(hào)的總糖、總酮、總皂苷、總蛋白、總酚單位含量百分制差異(表1)為對(duì)照,輔以傅里葉紅外變換光譜(圖4)初步篩選出125、126、127、130、131、132共6個(gè)具有含量優(yōu)勢、潛在定向育種價(jià)值的突變體。

    注:G1:總糖;G2:總酮;G3:總皂苷;G4:總蛋白;G5:總酚。下同。Note:G1: Total polysaccharides. G2: Total ketones. G3: Total saponins. G4: Total protein. G5: Total phenols. The same as following.圖1 三葉青超聲提取正交體系25組方案各組總糖、總酮、總皂苷、總蛋白、總酚的單位含量分布Fig.1 Unit content distribution of total polysaccharides,total ketones,total saponins,total proteins,and total phenols in 25 groups of orthogonal ultrasound extraction system of T.hemsleyanum

    圖2 三葉青超聲提取正交體系中總糖、總酮、總皂苷、總蛋白、總酚的濃度嶺圖分布Fig.2 Concentration ridge map distribution of total polysaccharides,total ketones,total saponins,total proteins,and total phenols in orthogonal ultrasound extraction system of T.hemsleyanum

    圖3 三葉青中總糖、總酮、總皂苷、總蛋白、總酚之間的Kendalls、Pearson、Spearman相關(guān)系數(shù)Fig.3 Kendalls,Pearson and Spearman correlation coefficients of total polysaccharides,total ketones,total saponins,total proteins and total phenols in T.hemsleyanum

    2.4 礦物質(zhì)含量分析

    2.4.1 礦物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)限量分析 26份三葉青樣本礦物質(zhì)元素單位含量(圖5)顯示,在突變體113、123、124和131中未檢出As元素,其他元素在26份樣本中均有檢出,且含量不同。

    急性闌尾炎是一種常見的外科疾病。該疾病的特征是轉(zhuǎn)移性右下象限疼痛。這種疾病在年輕人中很常見[1-3]。前一天,臨床上急性闌尾炎主要是手術(shù)切除[4],如果延誤診斷和治療,可能會(huì)引起嚴(yán)重并發(fā)癥。早期癥狀高熱,嘔吐等癥狀嚴(yán)重者將導(dǎo)致穿孔,使患者的健康受到嚴(yán)重影響[5]。因此,在診所采取合理有效的治療和護(hù)理干預(yù)是非常重要的。本研究的目的是調(diào)查中醫(yī)和西醫(yī)護(hù)理干預(yù)對(duì)急性闌尾炎的臨床療效及其對(duì)急性闌尾炎患者生活質(zhì)量的影響,為臨床治療提供指導(dǎo)。

    礦物質(zhì)單位含量基礎(chǔ)指標(biāo)顯示,最大單位含量Al(1 285.689 mg·kg-1)、Fe(323.711 mg·kg-1)、Mg(2 297.569 mg·kg-1)、Zn(156.906 mg·kg-1)均在100.000 mg·kg-1以上;最大單位含量As(1.861 mg·kg-1)、 Ba(81.070 mg·kg-1)、Cr(7.201 mg·kg-1)、 Cu(12.451 mg·kg-1)、Mn(97.527 mg·kg-1)、 Pb(1.967 mg·kg-1)均在100.000 mg·kg-1以下。參照《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》[26],重金屬及有害元素Cu、As和Pb在標(biāo)準(zhǔn)限量范圍內(nèi)(Cu≤20.0 mg·kg-1、 As≤2.0 mg·kg-1、Pb≤5.0 mg·kg-1),均符合要求。

    2.4.2 礦物質(zhì)含量差異 各突變體目標(biāo)元素含量差異(圖5、6)表明,澤青1號(hào)對(duì)目標(biāo)元素的貯存能力普遍高于大部分突變體,但部分突變體中As、Ba、Cu、Mg、Mn、Pb、Zn等元素的含量高于澤青1號(hào),而在Cr、Fe、Al的指標(biāo)中以澤青1號(hào)最高。以上述指標(biāo)篩選出103、107、112、113等4個(gè)部分元素含量高于澤青1號(hào)的突變體(圖9)。

    突變體103、107中As含量高于澤青1號(hào)(1.501 5 mg·kg-1>1.115 7 mg·kg-1、 1.860 5>1.115 7 mg·kg-1),107中Cu含量亦高于澤青1號(hào)(12.451 2 mg·kg-1> 7.703 7 mg·kg-1),但均未超出限量;107、112中Mg含量高于澤青1號(hào)(2 242.025 4 mg·kg-1>2 125.264 5 mg·kg-1、 2 297.569 2 mg·kg-1>2 125.264 5 mg·kg-1),112、113中Mn含量高于澤青1號(hào)(227.630 8 mg·kg-1>217.765 8 mg·kg-1、253.747 7 mg·kg-1>217.765 8 mg·kg-1);此外,Cr、Fe、Al含量則均以澤青1號(hào)為最高(7.201 0、323.711 3、1 285.689 1 mg·kg-1)。

    表1 26個(gè)三葉青樣本總糖、總酮、總皂苷、總蛋白、總酚的單位含量百分制差異Table 1 The percentage difference of total polysaccharides,total ketones,total saponins,total proteins and total phenols in 26 samples of T.hemsleyanum /%

    圖4 澤青1號(hào)及其突變體的傅里葉紅外變換光譜圖Fig.4 Fourier transform spectra of 11 samples from Zeqing 1 and its mutants

    注:編號(hào)100為澤青1號(hào)。Note:Number 100 indicate Zeqing 1.圖5 26個(gè)三葉青樣本的礦物質(zhì)元素單位含量分布Fig.5 Mineral element unit content distribution of 26 samples from T.hemsleyanum

    2.4.3 礦物質(zhì)相關(guān)性分析 對(duì)Al、As、Ba、Cr、Cu、Fe、Mg、Mn、Pb、Zn共10項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果表明(圖8),目標(biāo)元素間具有普遍的顯著相關(guān)性,集中在Al、Fe、Mg、Zn、Mn 5個(gè)元素中;Fe與Mn具有相近的分布特征,Al、Mg、Zn則分布特征相差較大,反映了突變對(duì)部分礦物質(zhì)代謝通路影響的相似程度,與其正態(tài)分布基本符合(圖9)。

    圖6 26份三葉青樣本在各元素中的百分制權(quán)重Fig.6 The percentage proportion of 26 samples of T.hemsleyanum in each mineral element

    2.4.4 礦物質(zhì)主成分分析 載荷系數(shù)表明,所有研究項(xiàng)對(duì)應(yīng)的共同度值均高于0.4,表明研究項(xiàng)和主成分之間有著較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性,主成分可以有效地從Al、As、Ba、Cr、Cu、Fe、Mg、Mn、Pb、Zn提取出信息??芍鲜鲈鼐哂辛己玫妮d荷性,可作為三葉青各突變體株系的特征性成分(圖10)。

    2.5 游離氨基酸含量分析

    2.5.1 游離氨基酸含量差異 結(jié)果表明,Cys、Leu在11突變株系中均未檢出;Asp、Thr、Glu、Gly、Ala、Val、Phe、Lys、His、Arg 10種游離氨基酸在11株系中均有檢出;Ser只在101株系中檢出;Met在101、114、126 3個(gè)株系中未檢出,其他株系均有檢出;Tyr只在109株系樣品中檢出,其他株系均未檢出。107、109、112、113突變株系的特征性氨基酸和總氨基酸量均高于澤青1號(hào)(圖11)。有研究表明,總氨基酸能明顯降低肝臟丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)活性、肝臟指數(shù)和丙二醛含量,提高活菌超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性,對(duì)肝臟損傷具有良好的保護(hù)作用[27-28];總氨基酸作用于肝癌細(xì)胞HepG2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上具有良好效果[22]。因此篩選出107、109、112、113四個(gè)具有成分育種潛力的突變體。

    2.5.2 游離氨基酸相關(guān)性 Asp、Thr、Glu、Gly、Ala、Val、Phe、Lys、His、Arg、Ser、Met、Ile、Tyr 14項(xiàng)相關(guān)性分析(圖12),結(jié)合各游離氨基酸的正態(tài)檢驗(yàn)(表2)分布結(jié)果表明,各突變體中各元素間沒有顯著的相關(guān)性,但Asp、Glu、Val、Phe等少數(shù)幾個(gè)元素在部分突變體中具有相似的含量分布特征,反映了突變對(duì)部分氨基酸代謝通路影響的相似程度。

    圖7 澤青1號(hào)及其突變體103、107、112、113的礦物質(zhì)含量差異Fig.7 Differences of the mineral content of Zeqing 1 and its mutants 103,107,112,113

    圖8 三葉青礦物質(zhì)間相關(guān)性分析Fig.8 Correlation analysis between the minerals in T. hemsleyanum

    表2 澤青1號(hào)及其突變體的游離氨基酸正態(tài)性檢驗(yàn)分析Table 2 Analysis of the normality test of free amino acids of Zeqing 1 and its mutants

    圖9 26份三葉青樣本在10個(gè)特征元素中的正態(tài)分布Fig.9 The normal distribution of 26 samples of T.hemsleyanum in 10 characteristic mineral elements

    圖10 26份三葉青樣本的礦物質(zhì)二維、三維主成分分布Fig.10 The two-dimensional and three-dimensional distribution of principal component of mineral elements in 26 samples of T.hemsleyanum

    2.6 DNA條形碼分析

    2.6.1 DNA提取和ITS引物擴(kuò)增 擴(kuò)增結(jié)果(圖13)顯示,突變體123未檢出條帶,其余突變體膠圖中1 000、750、500 bp位點(diǎn)附近均產(chǎn)生清晰、明亮、特征性一致的條帶分布;而后對(duì)突變體123共進(jìn)行7次重復(fù)試驗(yàn)后均未檢出條帶。結(jié)果表明,澤青1號(hào)突變?yōu)?23株系過程中與ITS引物結(jié)合位點(diǎn)處發(fā)生突變,導(dǎo)致引物無法結(jié)合而未擴(kuò)增出條帶,但其余株系未出現(xiàn)此類突變,可擴(kuò)增出特征性一致的條帶。

    2.6.2 突變體與近緣崖爬藤屬植物序列分析 使用 MEGA-X 對(duì)三葉青突變體ITS4引物擴(kuò)增帶進(jìn)行序列比對(duì),并與符淵淼[18]公布的三葉青近緣種屬植物的ITS4擴(kuò)增條帶序列進(jìn)行差異分析(圖14),結(jié)果顯示,澤青1號(hào)突變類群與近緣種屬序列間具有豐富的變異位點(diǎn),且澤青1號(hào)突變類群間具有較高的同源性,澤青1號(hào)突變類群與其近緣種可直觀地區(qū)分開。

    使用MEGA7.0以Neighbor-Joining構(gòu)建突變類群與近緣種屬序列的起源進(jìn)化樹Original Tree(圖15)與自舉共識(shí)樹(Bootstrap Consensus Tree),進(jìn)化樹均顯示可將近緣種屬聚為一類與突變類群顯著區(qū)分;DNAMAN所構(gòu)建的Original Tree與MEGA7.0所構(gòu)建的Original Tree(圖15)結(jié)果相似,且顯示澤青1號(hào)突變類群與其近緣種屬序列組僅有49%的同源性,而突變體間同源性多近似為100%,均表明可以顯著區(qū)分澤青1號(hào)突變類群與其近緣種。

    總體結(jié)果表明,所選引物ITS4可以良好地區(qū)分澤青1號(hào)及其突變體與其部分近緣種屬物種,初步認(rèn)為ITS4具有作為澤青1號(hào)突變類群與近緣種屬區(qū)分條形碼的潛力。

    圖11 澤青1號(hào)及其突變體107、109、112、113的游離氨基酸含量差異Fig.11 Differences in free amino acid contents of Zeqing 1 and its mutants 107,109,112 and 113

    2.6.3 突變體間序列分析 使用DNAMAN對(duì)多變體序列比對(duì),從中提取一段包含豐富變異位點(diǎn)序列片段,該序列長度為160 bp[包含空位(gaps)],該組片段多序列比對(duì)后顯示:在提取序列一致性95.33%的基礎(chǔ)上,以澤青1號(hào)為參照共產(chǎn)生244個(gè)突變位點(diǎn),包括置換、缺失和插入3種突變類型,占總突變體提取序列的6.35%,可以對(duì)澤青1號(hào)單個(gè)突變體進(jìn)行區(qū)分。在此基礎(chǔ)上可以設(shè)計(jì)探針或特征引物,直接從PCR擴(kuò)增條帶泳圖進(jìn)行不同突變體的判斷,這種方法可為后期突變株系的追蹤和應(yīng)用提供有效的幫助。此外,該段序列的同源性分析顯示同源性在93%~99%之間,具有高度相似性。

    圖12 三葉青游離氨基酸間相關(guān)性分析Fig.12 Correlation analysis between the free amino acid in T.hemsleyanum

    2.6.4 遺傳距離分析 使用MEGAX進(jìn)行遺傳距離分析,澤青1號(hào)突變類群及其近緣種屬的成對(duì)遺傳距離(Pairwise Distance)結(jié)果顯示,澤青1號(hào)突變類群各突變體間距離在0~0.167之間,近緣種屬各突變體間距離在0.108~1.279之間,而澤青1號(hào)突變類群突變體與近緣種屬突變體間距離則在0.474~1.587之間,表明澤青1號(hào)突變類群與近緣種屬間具有明顯差異,這種差異在DNA片段各處均有延伸,這種差異也是ITS4作為條形碼的基礎(chǔ)。

    此外,MEGAX的遺傳距離分析顯示,澤青1號(hào)突變類群及其近緣種屬的總平均遺傳距離(Overall Mean Distance)為0.54;突變類群與近緣種屬的種內(nèi)平均遺傳遺傳距離(Within Mean Group Distance)分別為0.044、0.144,組間平均遺傳距離(Between Group Mean Distance)為0.993,組間平均凈遺傳距離(Net Between Group Mean Distance)為0.899,這與Pairwise Distance所得結(jié)論相同。

    使用MGEAX對(duì)參照DNAMAN多序列比對(duì)所獲得的保守且變異位點(diǎn)特異、相對(duì)豐富的160 bp(部分突變體序列包含gaps)序列片段進(jìn)行遺傳距離分析,結(jié)果顯示,澤青1號(hào)突變類群各突變體間距離Pairwise Distance在0.006 40~0.116 96之間,Overall Mean Distance為0.059 99,Within Mean Group Distance為0.060 70,說明澤青1號(hào)突變類群間在具有高度保守、高度同源性的前提下依舊可以產(chǎn)生相對(duì)豐富的變異位點(diǎn),由ITS4所建立的條形碼兼具種屬鑒別和種間分子鑒定的功能。

    2.6.5 突變類群的BLAST比對(duì) 以2.6.3提取的澤青1號(hào)160 bp序列進(jìn)行BLAST比對(duì)(程序參數(shù):discontiguous megablast)篩選出前100組來源石斛、擬南芥、棉花、蓮藕、荔枝、馬鈴薯、可可豆、杜鵑等多種植物的相似序列,序列相似度最高為89.89%。

    圖13 三葉青樣本的DNA引物擴(kuò)增結(jié)果Fig.13 Results of DNA of primer amplificationof samples of T.hemsleyanum

    圖14 26份三葉青樣本與近緣種的多序列比對(duì)Fig.14 Multiple sequence alignment of between 26 samples and its closely related species of T.hemsleyanum

    圖15 基于26份三葉青樣本與23個(gè)近緣種的ITS序列構(gòu)建同源樹Fig.15 The Original Tree based on ITS sequences of 26 samples and its 23 closely related species of T.hemsleyanum

    此外,通過DNAMAN對(duì)ITS4所擴(kuò)增片段的測序結(jié)果進(jìn)行多序列比對(duì),將澤青1號(hào)的保守序列全部提取,得到一段517 bp突變豐富的片段并進(jìn)行BLAST比對(duì),篩選出前100組來源可可豆、甜瓜、羅漢果、番茄、野黃花、毛竹、茉莉花等多種植物、藻類的相似序列,序列相似度最高為74.48%;同時(shí),對(duì)所提取的517 bp片段進(jìn)行二次提取,分別得到500、400、300、200、100 bp片段,并進(jìn)行BLAST比對(duì),所得最高序列相似度依次為74.48%、74.48%、74.48%、73.27%、72.92%。結(jié)果表明,在避免目標(biāo)序列長度過短和保證目標(biāo)序列具有一定保守性的前提下,從三葉青中所提取的目標(biāo)序列與BLAST檢索序列的序列相似度穩(wěn)定在70%~80%之間,說明在三葉青中僅需要一段具有一定保守性的小片段即可實(shí)現(xiàn)種屬鑒別和種間分子鑒定;同時(shí),提取序列的檢索量與相似度和提取序列的長度與保守程度相關(guān),提取序列長度與檢索序列物種多樣性一定程度上成反比,應(yīng)盡可能包含高度保守和相對(duì)保守區(qū),同時(shí)保證序列長度。

    2.6.6 突變類群的DNA條形碼構(gòu)建 對(duì)澤青1號(hào)及其突變體序列進(jìn)行DNAMAN多序列比對(duì),結(jié)果顯示突變位點(diǎn)較為平均地分布于各突變體中,同時(shí)發(fā)現(xiàn)幾段極度保守、穩(wěn)定的不連續(xù)片段,僅少數(shù)位點(diǎn)產(chǎn)生突變(圖13),以此獲得一段擬DNA條形碼的序列:5′-T G G G G A A A T G C T C A A A A A T A C C A T A T C C C C T A C C T C A A A C T C T A G G T C C C T A C G G G G A T T G C C C G A T T A A C T T T T G T G T C G G G C T T G G G A A A T T T T C G G A C T A T C C C T T A T A A C T T T G A T C T T A T C A C A A G G C A C T T G A A C A A T T T C C G G A C C T A C T A A T T T C C T T T C C C C T A C C T C G C C C C A A C A G A C T G A A G T T C A A C A T T T C C G T C C A T A A A G A G C C T C A T A A G G G G C C A T A C C A A T A C T G G T C T G A T A A C T G T T A T T G T A T G C A A A C T C C A T C A G G G A T A G A T G G G C G T C C C A G C T C C C T C T A A A C T C C A T A A C A C A T G C C CT-3′使用該序列進(jìn)行BLAST比對(duì),結(jié)果與2.6.5的比對(duì)結(jié)果相似,序列相似度均在80%以下,最終認(rèn)為該段序列可以作為三葉青澤青1號(hào)及其突變體類群的DNA條形碼序列。

    3 討論

    60Co輻射誘變技術(shù)是當(dāng)前植物種質(zhì)資源開發(fā)的重要手段,如目前已對(duì)朝天椒[29]、小麥[30]、水稻[31]等多種作物進(jìn)行了相關(guān)研究。本試驗(yàn)所用的三葉青突變體是采用200 Gy60Co-γ射線處理三葉青高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)新品種澤青1號(hào)所得。因此在材料選擇上具有科研和商業(yè)雙向價(jià)值,一方面篩選出的優(yōu)良突變體可直接應(yīng)用于商業(yè)種植,另一方面澤青1號(hào)及其突變體是研究種質(zhì)進(jìn)化與分子標(biāo)記技術(shù)的適宜樣本,是進(jìn)行分子改良的基礎(chǔ)材料。前人關(guān)于三葉青理化性質(zhì)的研究多僅以總黃酮含量為不同品種三葉青的差異指標(biāo)[32-34],缺乏其他總物質(zhì)含量的對(duì)比。本試驗(yàn)使用中高濃度的有機(jī)乙醇溶劑進(jìn)行五類不同極性的組分提取,構(gòu)建五因素五水平正交試驗(yàn)驗(yàn)證該方法實(shí)用性,篩選優(yōu)化體系;此外,本研究創(chuàng)新性地使用50%乙醇溶劑超聲一體化提取總糖、總酮、總皂苷、總蛋白質(zhì)、總酚五類不同極性的物質(zhì),完成多類物質(zhì)總含量測定與相關(guān)性分析,能夠在極大程度上節(jié)省人力物力,縮短操作流程,提高原材料利用率,為植物組分提取類研究提供有效的參考基礎(chǔ)。

    圖16 26份三葉青樣本中一段ITS序列保守序列的位點(diǎn)突變結(jié)果Fig.16 Results of site mutation in a ITS sequence conserved in 26 samples of Tetrastigma hemsleyanum

    尹明華等[19]利用簡單重復(fù)序列(Simple sequence repeat,SSR)熒光標(biāo)記分析了64個(gè)三葉青種質(zhì)樣本的遺傳多樣性和親緣關(guān)系,結(jié)果表明,遺傳相似系數(shù)變化范圍為0.115 4~0.954 5、遺傳距離變化范圍為 0.000 0~3.218 1,遠(yuǎn)高于本研究中突變體類群遺傳距離(Pairwise Distance在0.006 40~0.116 96之間,Overall Mean Distance為0.059 99,Within Mean Group Distance為0.060 70),但與突變類群突變體與近緣種屬突變體間距離(0.474~1.587)存在交集,說明尹明華等[19]所用64個(gè)種質(zhì)樣本間的親緣關(guān)系、種間距離差異較大,所有樣本處于種間水平,且部分樣本可能處于屬間水平;而突變體類群間分析種內(nèi)水平研究。根據(jù)以上研究推測,三葉青所在的崖爬藤屬植物的種間界限遺傳距離在0.116 96~0.474 00以上、3.218 10以下范圍內(nèi)。此外尹明華等[20-22]又分別使用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(random amplified polymorphic DNA,RAPD)、微衛(wèi)星分子標(biāo)記(inter-simple sequence repeat,ISSR)、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記(sequence-related amplified polymorphism,SRAP)對(duì)上述64個(gè)三葉青種質(zhì)樣本的遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行分析,所得結(jié)論與上述研究結(jié)果相符,表明SSR、RAPD、ISSR、SRAP四種分子標(biāo)記方式適用于種屬水平的分子鑒定,不適用于種內(nèi)水平。

    DNAMAN多序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn),本研究的突變位點(diǎn)分布并不均勻。結(jié)果顯示TTT、AAA小片段序列極度保守,基本不發(fā)生突變,同時(shí)CCCC、GGGG小片段序列同樣非常保守,不易突變。推測是由于相同堿基之間由于鍵能、鍵角等物理性質(zhì)極為接近或相同,因此更易形成相對(duì)穩(wěn)固的化學(xué)鍵,對(duì)外界誘導(dǎo)突變的抗性增加[35-36]。

    由于本研究的對(duì)比序列較短,導(dǎo)致無法使用MEGA-X構(gòu)建N-J(K-2)同源樹,因此在后續(xù)研究中有必要提取分子量較大的序列進(jìn)行分析,以放大同源性差異方便比對(duì)。本研究還發(fā)現(xiàn),DNAMAN所得Bootstrap Consensus Tree結(jié)果受程序模式、序列長短和運(yùn)算次數(shù)的影響,導(dǎo)致有時(shí)Bootstrap Consensus Tree運(yùn)算沒有正向的參考價(jià)值。

    4 結(jié)論

    本研究以正交方法構(gòu)建并優(yōu)化了三葉青總糖、總酮、總皂苷、總酚、總蛋白5種總物質(zhì)一體化提取測定的有機(jī)溶劑超聲提取體系,并結(jié)合礦物質(zhì)、游離氨基酸兩指標(biāo)篩選出103、107、109、112、113、125、126、127、130、131、132具有潛在定向育種價(jià)值的突變體;另外研究表明三葉青突變體中的總糖、總酮、總皂苷三者單位含量與總酚之間呈顯著相關(guān),Al、Fe、Mg、Zn、Mn 5個(gè)元素間也呈顯著相關(guān)。

    猜你喜歡
    近緣總皂苷類群
    谷子近緣野生種的親緣關(guān)系及其利用研究
    三七總皂苷調(diào)節(jié)PDGF-BB/PDGFR-β的表達(dá)促進(jìn)大鼠淺表Ⅱ°燒傷創(chuàng)面愈合
    薏苡種質(zhì)資源ISSR分子標(biāo)記篩選及親緣關(guān)系分析
    三七總皂苷緩釋片處方的優(yōu)化
    中成藥(2018年6期)2018-07-11 03:01:10
    三七總皂苷膠束狀態(tài)與超濾分離的相關(guān)性
    中成藥(2017年8期)2017-11-22 03:18:44
    黑石頂自然保護(hù)區(qū)土壤動(dòng)物功能類群對(duì)季節(jié)動(dòng)態(tài)的響應(yīng)
    北細(xì)辛及其近緣植物葉片顯微結(jié)構(gòu)比較研究
    HPLC-ESI-MS法在西洋參總皂苷提取工藝研究中的應(yīng)用
    檢疫性雜草假高粱與近緣植物種子的波譜鑒別方法
    2011年春夏季黃海和東海微型浮游動(dòng)物類群組成及其攝食的研究
    精品久久久久久久久久免费视频| 久9热在线精品视频| 久久香蕉国产精品| 哪里可以看免费的av片| 日韩欧美国产一区二区入口| 欧美+日韩+精品| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 亚洲成人久久爱视频| 午夜福利免费观看在线| 亚洲成人中文字幕在线播放| 亚洲精品亚洲一区二区| 波野结衣二区三区在线 | 两个人看的免费小视频| 色av中文字幕| 麻豆成人午夜福利视频| 午夜精品在线福利| 亚洲黑人精品在线| 美女黄网站色视频| 一级a爱片免费观看的视频| 在线观看免费视频日本深夜| 一区二区三区国产精品乱码| 亚洲不卡免费看| 俺也久久电影网| or卡值多少钱| 国产91精品成人一区二区三区| 成人三级黄色视频| 一区二区三区高清视频在线| 精品日产1卡2卡| tocl精华| 免费观看人在逋| 久久99热这里只有精品18| 免费在线观看影片大全网站| 成人国产综合亚洲| 看黄色毛片网站| 制服人妻中文乱码| 在线免费观看不下载黄p国产 | 国产成人a区在线观看| 欧美中文日本在线观看视频| 亚洲最大成人手机在线| 嫩草影院精品99| 免费av毛片视频| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产一区二区三区视频了| 一个人看视频在线观看www免费 | 亚洲18禁久久av| 亚洲精品成人久久久久久| 亚洲专区中文字幕在线| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 精品不卡国产一区二区三区| 天堂网av新在线| 国产日本99.免费观看| 91久久精品国产一区二区成人 | 美女黄网站色视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲色图av天堂| 亚洲在线观看片| 亚洲国产中文字幕在线视频| 久99久视频精品免费| 午夜亚洲福利在线播放| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产男靠女视频免费网站| 国产三级中文精品| 99视频精品全部免费 在线| 搞女人的毛片| 久久久久久久久中文| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 欧美成人免费av一区二区三区| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| a在线观看视频网站| av视频在线观看入口| av在线天堂中文字幕| 性色av乱码一区二区三区2| av在线天堂中文字幕| 深爱激情五月婷婷| 亚洲av美国av| 久久亚洲精品不卡| 日本五十路高清| 波多野结衣高清无吗| 91在线观看av| 国产在线精品亚洲第一网站| 亚洲久久久久久中文字幕| 最新中文字幕久久久久| 99国产极品粉嫩在线观看| 精品福利观看| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 久久久久国内视频| 最近最新中文字幕大全免费视频| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 俺也久久电影网| 在线观看午夜福利视频| 免费大片18禁| 午夜免费观看网址| 日本与韩国留学比较| 欧美一区二区精品小视频在线| 少妇高潮的动态图| 成年版毛片免费区| 一级毛片女人18水好多| 三级毛片av免费| xxxwww97欧美| 亚洲欧美激情综合另类| 女警被强在线播放| 久99久视频精品免费| 久久九九热精品免费| 午夜福利在线观看吧| 一夜夜www| 一个人免费在线观看的高清视频| 久久99热这里只有精品18| 亚洲成人精品中文字幕电影| 日本免费一区二区三区高清不卡| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产免费男女视频| 色综合婷婷激情| 国产精品99久久久久久久久| 欧美激情久久久久久爽电影| 又紧又爽又黄一区二区| 男女那种视频在线观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 亚洲18禁久久av| 亚洲片人在线观看| 国产一区二区在线观看日韩 | 最好的美女福利视频网| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲一区二区三区色噜噜| 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产精品国产高清国产av| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 一级毛片高清免费大全| 日韩欧美在线乱码| 老司机深夜福利视频在线观看| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 久久香蕉精品热| 久久精品人妻少妇| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 国产一级毛片七仙女欲春2| 免费在线观看影片大全网站| 欧美一区二区精品小视频在线| 婷婷精品国产亚洲av在线| 国产一区在线观看成人免费| 最新中文字幕久久久久| 午夜免费观看网址| 长腿黑丝高跟| 国产精品爽爽va在线观看网站| 午夜亚洲福利在线播放| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 免费搜索国产男女视频| 午夜福利在线观看吧| 桃红色精品国产亚洲av| 久久久色成人| 一级作爱视频免费观看| 成人av在线播放网站| 在线看三级毛片| 欧美中文日本在线观看视频| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲国产中文字幕在线视频| 高清在线国产一区| 亚洲国产欧美网| 白带黄色成豆腐渣| 欧美日韩精品网址| 国产精品99久久99久久久不卡| 一进一出抽搐gif免费好疼| 日本五十路高清| 人人妻人人澡欧美一区二区| 少妇人妻一区二区三区视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 免费看a级黄色片| 亚洲乱码一区二区免费版| 国产成人系列免费观看| 国产私拍福利视频在线观看| 99在线人妻在线中文字幕| 嫩草影院精品99| 老鸭窝网址在线观看| 毛片女人毛片| 亚洲欧美日韩高清专用| 操出白浆在线播放| 免费看日本二区| 国产精品久久久久久久久免 | 国产成人欧美在线观看| 国产精品久久久久久久久免 | 日日干狠狠操夜夜爽| 嫁个100分男人电影在线观看| 在线观看日韩欧美| 免费看日本二区| 最近最新中文字幕大全电影3| 欧美乱色亚洲激情| 欧美不卡视频在线免费观看| 亚洲中文字幕日韩| 一进一出抽搐gif免费好疼| 欧美在线黄色| 日韩欧美三级三区| 听说在线观看完整版免费高清| 久久精品91无色码中文字幕| 午夜激情欧美在线| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美 | 99久久精品热视频| 一二三四社区在线视频社区8| or卡值多少钱| 69人妻影院| 久久九九热精品免费| 午夜精品久久久久久毛片777| 两人在一起打扑克的视频| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 内地一区二区视频在线| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 中文亚洲av片在线观看爽| 热99在线观看视频| 免费看美女性在线毛片视频| 熟女人妻精品中文字幕| 两个人看的免费小视频| 亚洲色图av天堂| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 日日干狠狠操夜夜爽| 精品无人区乱码1区二区| 怎么达到女性高潮| 亚洲最大成人中文| 91久久精品电影网| 一二三四社区在线视频社区8| 狠狠狠狠99中文字幕| 在线免费观看不下载黄p国产 | 成年女人永久免费观看视频| www.www免费av| 老司机午夜福利在线观看视频| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 中文字幕熟女人妻在线| 色视频www国产| 手机成人av网站| 国产三级在线视频| 精品久久久久久久毛片微露脸| 深爱激情五月婷婷| 精品欧美国产一区二区三| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 欧美+日韩+精品| 欧美三级亚洲精品| 最新中文字幕久久久久| 少妇的逼好多水| 免费人成视频x8x8入口观看| 亚洲人与动物交配视频| 日本在线视频免费播放| 香蕉久久夜色| 国产高清视频在线播放一区| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 色吧在线观看| 观看美女的网站| 亚洲最大成人手机在线| 亚洲人成网站在线播| 99热精品在线国产| 国产精品1区2区在线观看.| 国产男靠女视频免费网站| 一区福利在线观看| 久久精品综合一区二区三区| 亚洲黑人精品在线| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 黄色丝袜av网址大全| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 亚洲国产高清在线一区二区三| 国产三级中文精品| 久久久成人免费电影| 日本a在线网址| 国产成人av教育| 成人亚洲精品av一区二区| 麻豆一二三区av精品| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产高潮美女av| 午夜福利欧美成人| 哪里可以看免费的av片| 久久亚洲真实| 久9热在线精品视频| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 看片在线看免费视频| 白带黄色成豆腐渣| 亚洲精品亚洲一区二区| 久久亚洲精品不卡| 麻豆国产97在线/欧美| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 成人av在线播放网站| 欧美另类亚洲清纯唯美| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 老司机在亚洲福利影院| 国产爱豆传媒在线观看| eeuss影院久久| 岛国视频午夜一区免费看| 18禁在线播放成人免费| 性色avwww在线观看| 免费在线观看成人毛片| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 69av精品久久久久久| 亚洲国产色片| 亚洲男人的天堂狠狠| 18+在线观看网站| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 91在线精品国自产拍蜜月 | 欧美乱码精品一区二区三区| 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 一进一出好大好爽视频| 国产伦人伦偷精品视频| 欧美乱妇无乱码| 国产成人啪精品午夜网站| 欧美日本视频| 亚洲电影在线观看av| 搡老岳熟女国产| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 中亚洲国语对白在线视频| 国产97色在线日韩免费| 国产成人a区在线观看| h日本视频在线播放| 国产三级在线视频| 亚洲内射少妇av| 最后的刺客免费高清国语| 又爽又黄无遮挡网站| 免费一级毛片在线播放高清视频| 国产精品99久久99久久久不卡| av中文乱码字幕在线| 哪里可以看免费的av片| 国产成人影院久久av| 成人亚洲精品av一区二区| 国产伦在线观看视频一区| 久久久久久人人人人人| 在线免费观看的www视频| 丝袜美腿在线中文| 国产97色在线日韩免费| 亚洲中文日韩欧美视频| 婷婷精品国产亚洲av在线| 一个人免费在线观看电影| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 在线国产一区二区在线| 91字幕亚洲| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 青草久久国产| 在线播放国产精品三级| 全区人妻精品视频| 黄色女人牲交| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 亚洲久久久久久中文字幕| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 亚洲 国产 在线| 哪里可以看免费的av片| 高清毛片免费观看视频网站| 色尼玛亚洲综合影院| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 18禁黄网站禁片免费观看直播| or卡值多少钱| 夜夜夜夜夜久久久久| 欧美日韩国产亚洲二区| 亚洲精品一区av在线观看| 99国产综合亚洲精品| 美女 人体艺术 gogo| 可以在线观看毛片的网站| 不卡一级毛片| 国产精品免费一区二区三区在线| 在线观看免费午夜福利视频| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 欧美+亚洲+日韩+国产| 淫秽高清视频在线观看| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 国产亚洲精品一区二区www| 精华霜和精华液先用哪个| 天美传媒精品一区二区| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 在线观看66精品国产| 亚洲av免费在线观看| 一进一出抽搐动态| www日本在线高清视频| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 男插女下体视频免费在线播放| 国产成人av激情在线播放| 一区二区三区高清视频在线| 精品久久久久久久毛片微露脸| 欧美一级毛片孕妇| 亚洲专区国产一区二区| 丰满人妻一区二区三区视频av | 欧美极品一区二区三区四区| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 一级a爱片免费观看的视频| 91在线精品国自产拍蜜月 | 无遮挡黄片免费观看| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 老司机福利观看| 中文亚洲av片在线观看爽| 免费高清视频大片| 99精品久久久久人妻精品| 国产亚洲精品一区二区www| 亚洲精品日韩av片在线观看 | 女人被狂操c到高潮| 手机成人av网站| 嫩草影院精品99| 午夜激情福利司机影院| 搡老熟女国产l中国老女人| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 精品欧美国产一区二区三| 看黄色毛片网站| 欧美+亚洲+日韩+国产| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产av一区在线观看免费| 免费在线观看影片大全网站| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲av不卡在线观看| 九九在线视频观看精品| 国产三级黄色录像| 91麻豆av在线| 老汉色∧v一级毛片| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 特大巨黑吊av在线直播| 一个人看的www免费观看视频| 久久亚洲精品不卡| www.www免费av| 国产欧美日韩精品一区二区| 亚洲成人精品中文字幕电影| 丝袜美腿在线中文| 国产在线精品亚洲第一网站| 又紧又爽又黄一区二区| 黄片小视频在线播放| 日韩有码中文字幕| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 一区二区三区激情视频| 久久久久久久午夜电影| 色av中文字幕| 精品国产亚洲在线| 18禁在线播放成人免费| 午夜久久久久精精品| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 99久国产av精品| 国产极品精品免费视频能看的| 综合色av麻豆| 亚洲avbb在线观看| 悠悠久久av| 香蕉丝袜av| 欧美国产日韩亚洲一区| 国产三级在线视频| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 欧美一区二区精品小视频在线| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 成熟少妇高潮喷水视频| 小说图片视频综合网站| 麻豆国产97在线/欧美| 欧美一级毛片孕妇| 不卡一级毛片| 我要搜黄色片| 国产色爽女视频免费观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 精品免费久久久久久久清纯| 九色国产91popny在线| 午夜福利18| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产午夜福利久久久久久| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 亚洲av成人精品一区久久| 色在线成人网| 国产亚洲精品久久久com| 内射极品少妇av片p| 在线免费观看的www视频| 最新在线观看一区二区三区| bbb黄色大片| 国产中年淑女户外野战色| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 深爱激情五月婷婷| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 欧美又色又爽又黄视频| 在线观看午夜福利视频| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 日韩精品青青久久久久久| 日韩高清综合在线| 成人一区二区视频在线观看| 少妇丰满av| 三级毛片av免费| 在线a可以看的网站| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产伦在线观看视频一区| 久久久久久国产a免费观看| av黄色大香蕉| 国产主播在线观看一区二区| 又爽又黄无遮挡网站| 国产精品综合久久久久久久免费| 久久亚洲真实| 在线观看舔阴道视频| 99精品欧美一区二区三区四区| 中出人妻视频一区二区| 在线观看av片永久免费下载| 欧美成人一区二区免费高清观看| 天天一区二区日本电影三级| 乱人视频在线观看| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 91av网一区二区| 禁无遮挡网站| 91在线观看av| 99热只有精品国产| 又爽又黄无遮挡网站| 999久久久精品免费观看国产| 国产伦人伦偷精品视频| 午夜精品一区二区三区免费看| www日本黄色视频网| 成人av在线播放网站| 手机成人av网站| 久久久久久大精品| 欧美大码av| 精品久久久久久,| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产毛片a区久久久久| 色综合站精品国产| 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲精品在线观看二区| 男插女下体视频免费在线播放| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产成年人精品一区二区| 婷婷丁香在线五月| 中文字幕av成人在线电影| 亚洲精品影视一区二区三区av| 在线国产一区二区在线| 免费电影在线观看免费观看| 免费看日本二区| 91字幕亚洲| 美女cb高潮喷水在线观看| 亚洲欧美日韩东京热| 国产精品日韩av在线免费观看| 黄色丝袜av网址大全| 色在线成人网| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 国产精品98久久久久久宅男小说| 最近视频中文字幕2019在线8| 国产综合懂色| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产中年淑女户外野战色| 久久精品91蜜桃| 亚洲黑人精品在线| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 99久久成人亚洲精品观看| 成人三级黄色视频| 午夜激情福利司机影院| 欧美三级亚洲精品| 亚洲国产精品成人综合色| 中文资源天堂在线| 天堂√8在线中文| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美 | 一级作爱视频免费观看| 99视频精品全部免费 在线| 亚洲精品成人久久久久久| 午夜老司机福利剧场| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 久久香蕉国产精品| 99热这里只有是精品50| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 狂野欧美激情性xxxx| 波多野结衣高清无吗| 国产真实乱freesex| 熟女电影av网| 啪啪无遮挡十八禁网站| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 国产探花在线观看一区二区| 国产精品,欧美在线| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 亚洲欧美日韩高清专用| 小说图片视频综合网站| а√天堂www在线а√下载| 一个人看视频在线观看www免费 | 亚洲一区二区三区不卡视频| 九色成人免费人妻av| 国产精品一区二区免费欧美| 欧美午夜高清在线| 欧美中文综合在线视频| 午夜福利欧美成人| 成年女人毛片免费观看观看9| 日本五十路高清| 亚洲人与动物交配视频| 一区二区三区高清视频在线| 青草久久国产| 熟女电影av网| 久久久久九九精品影院| 欧美日韩综合久久久久久 | 亚洲欧美激情综合另类| 国产av在哪里看| 免费在线观看成人毛片| 亚洲 国产 在线| 日韩有码中文字幕| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产淫片久久久久久久久 | 婷婷丁香在线五月| 在线视频色国产色| 又爽又黄无遮挡网站| 午夜影院日韩av| 很黄的视频免费| 久久久久亚洲av毛片大全| 亚洲成人久久爱视频| 一区二区三区高清视频在线| 国产欧美日韩一区二区精品| 日本黄色视频三级网站网址| 日韩高清综合在线| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 黄片大片在线免费观看| 99视频精品全部免费 在线| 18美女黄网站色大片免费观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 免费观看的影片在线观看| 12—13女人毛片做爰片一| 桃色一区二区三区在线观看| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 性欧美人与动物交配| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产精品久久久久久久久免 | 国产精品电影一区二区三区| 少妇的逼好多水| 丁香六月欧美| 成人特级av手机在线观看| 少妇的逼水好多| 黄色视频,在线免费观看| 国产伦在线观看视频一区| 一个人免费在线观看电影| 在线十欧美十亚洲十日本专区|