超高效液相色譜法測定貽貝中苯和二甲苯的代謝物

胡芬靜，彭虹暉，廖思揚(yáng)，宋立玲，傅謐妮，周秀錦*

(1.舟山海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心，浙江舟山 316000；2.舟山福來聚食品有限公司，浙江舟山 316000；3.中華人民共和國杭州海關(guān)，浙江杭州 310007)

苯系物作為有機(jī)溶劑和稀釋劑的主要成分，已被廣泛應(yīng)用于單獨(dú)和混合物中其他化學(xué)品的合成。已有的研究表明，苯系物多存在于海水和沉積物中，由于其生物降解時間長，對海洋生態(tài)系統(tǒng)造成長期和較大的危害。紫貽貝因營養(yǎng)豐富、肉質(zhì)鮮美且繁殖速度很快，目前已經(jīng)成為主要海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)貝類之一。貽貝是典型的濾食性雙殼貝類，代謝率較低，被廣泛用于全球海洋污染的生物監(jiān)測中。N-Acetyl-S-(phenyl)-l-cysteine(PMA)因其半衰期較長，和反，反-粘康酸(，-Muconic acid，MU)均為有效和敏感的苯代謝標(biāo)志物。二甲苯3種同分異構(gòu)體在人體內(nèi)被氧化成-、-和-甲苯酸，然后與甘氨酸結(jié)合，以-、-和-甲基硫尿酸的形式在尿液中排泄。甲基硫尿酸作為生物標(biāo)記物研究二甲苯與暴露水平的相關(guān)性。

苯和二甲苯代謝物的檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)、高效液相色譜-高分辨飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-TOF/MS)等，但研究對象大多是尿液、土壤、牙齒等基質(zhì)，前處理方法有直接離心處理、液液萃取和固相萃取等方法。但是目前鮮見貽貝樣品中苯和二甲苯代謝物的研究報道，該研究貽貝樣品采取鹽酸酸化、乙酸乙酯提取、氯化鈉防止乳化、正己烷脫脂等前處理方法，結(jié)合超高效液相色譜技術(shù)，建立適合貽貝中苯和二甲苯代謝物的二級管陣列檢測器-超高效液相色譜(PAD-UPHC)檢測方法，并應(yīng)用于東海沿岸貽貝中苯和二甲苯代謝物的檢測。

1 材料與方法

SHIMADZU Nexera X2 Lc-30A液相色譜儀配二極管檢測器(日本SHIMADZU公司)；XS105 分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；ST-16R 型高速冷凍離心機(jī)(美國Thermo 公司)；氮吹儀(美國Organomation公司)；乙腈、甲醇、甲酸、正己烷(色譜純，美國Sigma-Aldrich 公司)；2-甲基馬尿酸(2-MHA)、3-甲基馬尿酸(3-MHA)、 4-甲基馬尿酸(4-MHA)、N-Acetyl-S-(phenyl)-l-cysteine(PMA)、反，反-粘康酸(MU)標(biāo)準(zhǔn)品(美國Sigma Chemicals；St.Louis，MO.)；鹽酸、氯化鈉(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

取5.0 g樣品于50 mL離心管，加10 mL 0.2 mol/L鹽酸溶液和2.0 g氯化鈉，用均質(zhì)器以1 000 r/min均質(zhì)1 min，20 mL乙酸乙酯提取，超聲5 min，漩渦混合30 s后，4 ℃、9 000 r/min離心5 min，收集乙酸乙酯層，殘留物再用15 mL乙酸乙酯重復(fù)提取一次，合并乙酸乙酯。收集液在40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮近干，殘渣用1.0 mL流動相溶解，再用3.0 mL乙腈飽和的正己烷脫脂2次，下層液體過0.22 μm微孔濾膜后，待測。

色譜柱為Waters ACQUITY UPLC? HSS T3 C色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)，進(jìn)樣盤溫度4 ℃，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量2.0 μL。流動相A相為15 mmol/L 乙酸銨，B相為甲醇；流速0.2 mL/min，檢測波長為235 nm，流動相梯度洗脫如表1所示。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Mobile phase gradient elution procedure

在空白貽貝中加入系列濃度的苯和二甲苯代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻后按“.”和“.”進(jìn)行樣品前處理和檢測，以峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與分析

苯和二甲苯代謝物屬于含有羧基的有機(jī)酸類物質(zhì)，為獲得較高的重現(xiàn)性和分離效果，流動相中加入一定的酸可以抑制羧基解離，該研究選取0.1%乙酸-甲醇、15 mmol/L 乙酸銨-甲醇和15 mmol/L 乙酸銨(0.1%乙酸)-甲醇為流動相，梯度洗脫，其中用0.1%乙酸-甲醇為流動相時，4-MHA和3-MHA分離度不理想；用15 mmol/L 乙酸銨(0.1%乙酸)-甲醇作為流動相，4-MHA和3-MHA峰型拖尾現(xiàn)象明顯；選擇15 mmol/L乙酸銨-甲醇為流動相，梯度洗脫，目標(biāo)物色譜峰形尖銳對稱。二甲苯代謝物在反相色譜柱及極性流動相中的分離和保留效果較好。考察Waters ACQUITY UPLC CSH TM C色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)、Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C色譜柱(150 mm×2.1 mm，1.8 μm)和Waters ACQUITY UPLC? BEH C色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，最后選擇了分離度更好的Waters ACQUITY UPLC? HSS T3 C色譜柱，在15 mmol/L 乙酸銨-甲醇溶液流動相體系下，可以實(shí)現(xiàn)4-MHA和3-MHA分離，5 種目標(biāo)物的分離效果見圖1。

圖1 5種苯和二甲苯代謝物的標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.1 Chromatograms of the five metabolites of benzene and xylene standard solution

貝類樣品含有豐富的蛋白質(zhì)、磷脂、分泌黏液、色素等雜質(zhì)，基質(zhì)較為復(fù)雜，常用提取凈化方法多為液液萃取。該研究考察了乙酸乙酯、二氯甲烷-異丙醇(5∶1)、三氯甲烷-異丙醇(5∶1)3種提取液的萃取效率，結(jié)果表明3種提取液的提取效率沒有明顯差別，但是二氯甲烷-異丙醇(5∶1)和三氯甲烷-異丙醇(5∶1)提取液中含有色素基質(zhì)相對較多，而乙酸乙酯提取時會出現(xiàn)乳化現(xiàn)象。該研究以乙酸乙酯為提取液，優(yōu)化了提取方法，為防止乳化現(xiàn)象，加入2.0 g氯化鈉，不僅有效防止了乳化現(xiàn)象的發(fā)生，且在均質(zhì)時最大化地分散了貝類樣品，增大了樣品和乙酸乙酯的接觸效果，提高了乙酸乙酯的萃取效率。最后采用正己烷液液分層凈化，有效消除了樣品中脂肪的干擾，最終貽貝樣品前處理后二甲苯代謝物回收率為85.8%～110.6%。

在優(yōu)化條件下，采用貽貝樣品基質(zhì)加標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，以峰面積對相應(yīng)質(zhì)量濃度進(jìn)行回歸分析，5種苯和二甲苯代謝物在各自線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(>0.99)；以3倍信噪比為基準(zhǔn)，得到5種化合物的方法檢出限(LOD)，以10倍信噪比為基準(zhǔn)，得到方法定量限(LOQ)。具體見表2。

表2 苯和二甲苯代謝物的線性方程、決定系數(shù)、LOD和LOQTable 2 Linear equation，determination coefficient，LOD and LOQ of the metabolites of benzene and xylene

為驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度，在空白貽貝樣品中添加高、中、低 3個不同濃度的苯和二甲苯代謝物進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，按“.”和“.”條件檢測，每一濃度平行測定7次。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表3)，5種苯和二甲苯代謝物的平均回收率為83.40%～113.10%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)不大于8.62%。

隨機(jī)購買舟山各菜場的貽貝樣品，采用該方法，檢測了東海海域貽貝共45個樣品中苯和二甲苯代謝物含量，顯示45批貽貝樣品中均未檢測到苯和二甲苯代謝物，結(jié)果表明舟山地區(qū)貽貝質(zhì)量相對安全。

表3 苯和二甲苯代謝物的平均回收率和RSDTable 3 Average recovery rate and RSD of the metabolites of benzene and xylene

3 結(jié)論

該研究建立了貽貝中5種苯和二甲苯代謝物的二極管陣列檢測器-超高效液相色譜分析測定方法，結(jié)果表明該方法的線性、靈敏度、檢出限和回收率等技術(shù)指標(biāo)均滿足檢測方法的要求。5種苯和二甲苯代謝物的回收率在83.40%～113.10%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)不大于8.62%，分離效果和重復(fù)性好，應(yīng)用該方法對本地區(qū)的貽貝樣品進(jìn)行了分析，未發(fā)現(xiàn)貽貝樣品中含有苯和二甲苯代謝物。