1 株雞源奇異變形桿菌的分離鑒定及藥敏試驗

熊菊萍，肖瀅宇，張 誠，韓青松，高小龍，李增魁，文 英，仝麗娜

（1.青海大學農(nóng)牧學院，青海 西寧 810016；2.溫州科技職業(yè)學院，浙江 溫州 325006）

奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）是腸桿菌科變形桿菌屬的一種兼性厭氧革蘭陰性桿菌。 該菌廣泛存在于土壤、污水、污泥和動物及人體體表、黏膜、消化道、糞便中，是一種常見的條件致病菌［1］。在一定條件下， 如人體免疫力下降時， 可引起腹瀉、尿道炎、腹膜炎、腦膜炎、菌血癥和敗血癥等疾病，其中以泌尿系統(tǒng)感染最常見［2-4］。 同時，奇異變形桿菌也是引發(fā)細菌性食物中毒的第四大病原菌［5］。 奇異變形桿菌不僅可以感染人，還可以感染牛、羊、豬、犬、兔、狐貍、竹鼠、食蟹猴、大熊貓等多種動物［6-10］。 近年來，因奇異變形桿菌感染引發(fā)的幼畜和家禽發(fā)病或死亡的情況在我國多省份均有報道，且該菌臨床分離率呈上升趨勢，威脅著人類健康和畜禽養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展［10-13］。 并且，為了促進動物生長和減少細菌病發(fā)生， 部分養(yǎng)殖場對抗生素類藥物的不合理、不規(guī)范使用，甚至濫用，加劇了耐藥菌株的出現(xiàn)。 李欣楠等［14］從遼寧肉雞養(yǎng)殖場分離的67 株奇異桿菌， 對11 種抗生素耐藥性普遍較高，其中對黏桿菌素E、氟苯尼考和磺胺異噁唑等9 種藥物耐藥率可達80%。 徐睿等［15］從西昌地區(qū)雞場分離到2 株奇異變形桿菌， 該2 株菌對14 種抗生素耐藥率分別為78.6%和71.4%。 龐洪澤等［16］從秦皇島地區(qū)的雞場中分離到1 株多重耐藥奇異變形桿菌。 多重耐藥性的不斷出現(xiàn)增加了該病防治的難度。因此，調(diào)查了解奇異變形桿菌耐藥性狀況， 對指導青海省養(yǎng)雞場合理用藥具有重要意義。

2019 年11 月， 青海省大通縣某肉雞場的部分雞發(fā)病，初期病雞精神沉郁、羽毛蓬亂，并排出黃綠色和水樣稀糞，后期有雞只死亡。為確定病雞死亡原因，該研究從發(fā)病雞場采集病料，分離到一株疑似菌，經(jīng)革蘭染色鏡檢、生化鑒定、16S rDNA和tuf 特異性基因PCR 擴增與測序后， 鑒定為奇異變形桿菌， 并對分離菌進行了致病性試驗和藥敏試驗， 旨在為禽類奇異變形桿菌病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源

青海省大通縣某肉雞場的部分雞發(fā)病， 臨床癥狀為羽毛蓬亂、精神沉郁并排出黃綠色稀糞。從上述病雞無菌采集肝臟、 脾臟和泄殖腔拭子等作為病料。

1.2 主要試劑

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購自北京奧博星生物技術有限責任公司；MH 瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基購自杭州微生物試劑有限公司；SS 瓊脂、 細菌微量生化鑒定管、 藥敏紙片均購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司； 麥氏比濁管購自溫州市康泰生物科技有限公司； 革蘭染色劑購自北京索萊寶科技有限公司；DL 2 000 DNA Marker 購自天根生化科技有限公司；2×EasyTaq PCR SuperMix購自北京全式金生物技術有限公司； 膠回收試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 試驗動物

10 只2 周齡SPF 白來航雛雞購自濟南賽斯家禽科技有限公司。

1.4 分離培養(yǎng)與染色鏡檢

將采集的病料劃線接種普通營養(yǎng)瓊脂和SS瓊脂，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱18～36 h，并觀察菌落形態(tài)，挑取可疑菌落在營養(yǎng)瓊脂和SS 瓊脂平板上分區(qū)劃線，進行純化。純化后的可疑菌落進行革蘭染色鏡檢。 接種純化后的疑似菌落至營養(yǎng)肉湯，37 ℃振蕩培養(yǎng)18～24 h。

1.5 生化鑒定

將“1.4”項下營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)的細菌用無菌生理鹽水稀釋到0.5 麥氏濃度（約1×108CFU/mL）后， 按照生化鑒定管說明書接種于細菌微量生化鑒定管中，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，參照《伯杰細菌鑒定手冊》（第八版）進行結(jié)果判定。

1.6 細菌16S rDNA 和奇異變形桿菌tuf 基因擴增

使用水煮法提取細菌基因組DNA。 在SS 瓊脂平板上挑取單個菌落接種于2 mL 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)12 h，用微量移液器吸取400 μL 菌液于1.5 mL 離心管中，12 000 r/min 離心2 min，棄去上清液，用無菌水重懸，放入沸水中煮8 min 后，12 000 r/min 離心2 min，取上清液即為DNA 模板，于-20 ℃保存。

設計16S rDNA 和奇異變形桿菌tuf 基因特異性引物，引物序列為16S rDNA-F：CAGGCCTAACACATGCAAGTC，16S rDNA -R：GGGCGGWGTGTACAAGGC， 產(chǎn) 物 大 小 為 1 400 bp；tuf -F：AAATTGTTGAATTAGCAGAAGCA，tuf -R：GCGATTGGGTGGATCAGTTC，產(chǎn)物大小為540 bp。以制備的細菌基因組DNA 為模板進行PCR 擴增，16S rDNA 和tuf 基因擴增反應體系均為：2×Taq Mix 25 μL、上下游引物各1 μL、模板2 μL，無酶滅菌水21 μL；陰性對照反應體系除模板改為無酶滅菌水外，其余組分同上。 16S rDNA 擴增反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。tuf 基因擴增反應條件為：57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s， 其余反應條件同16S rDNA 擴增反應條件。 PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切下目的片段，進行膠回收，將產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結(jié)果與GenBank 上公布的序列進行BLAST 比對。 用DNAStar 軟件進行序列同源性分析，用MEGA 軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.7 雛雞致病性試驗

將10 只2 周齡SPF 雛雞隨機分為試驗組和對照組。 試驗組腹腔注射1 mL 的菌液（1 個麥氏比濁度，約3×108CFU/mL），對照組腹腔注射無菌肉湯1 mL。接種后每隔12 h 觀察并記錄雛雞精神狀況和死亡情況，并對死亡雛雞進行解剖，無菌采集心臟、肝臟和脾臟，進行細菌分離鑒定。

1.8 藥敏試驗

采用K-B 紙片擴散法進行藥敏試驗。 挑取平板純化的菌落， 接種至5 mL 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)12 h。 用生理鹽水將菌液稀釋至0.5 麥氏濃度（約1×108CFU/mL）。 用無菌棉簽蘸取稀釋好的菌液均勻涂抹在MH 瓊脂平板上，并貼上藥敏紙片，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后測量抑菌圈直徑并記錄。 根據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會 （Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI） 推薦的紙片擴散法標準進行結(jié)果判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌的形態(tài)特征和鏡檢結(jié)果

分離菌在SS 瓊脂培養(yǎng)基上為半透明、中央黑色或整個菌落都呈黑色的圓形扁平菌落 （見圖1A）。 革蘭染色鏡檢可發(fā)現(xiàn)長短不一、兩端鈍圓的革蘭陰性桿菌，單個或成簇分布（見圖1B）。

圖1 分離菌株菌落形態(tài)和革蘭染色鏡檢結(jié)果

2.2 生化試驗

分離菌生化鑒定結(jié)果如表1 所示， 苯丙氨酸酶、明膠、鳥氨酸脫羧酶、尿素酶、木糖、脂酶和水楊苷試驗呈陽性；西蒙枸櫞酸鹽、色氨酸肉湯、麥芽糖、 甘露醇和七葉苷水解試驗反應呈陰性，與《伯杰細菌鑒定手冊》中奇異變形桿菌的生化特征相對應。

表1 生化鑒定結(jié)果

2.3 細菌16S rDNA 和tuf 基因擴增

以水煮法制備的DNA 為模板， 用16S rDNA引物通過PCR 成功擴增出1 400 bp 左右的目的條帶，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2。 切膠回收該目的條帶，回收產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。 測序結(jié)果與GenBank 上公布的序列進行BLAST 比對，顯示與奇異變形桿菌同源性高達99.9%。 同時，用奇異變形桿菌特異性tuf 基因特異性引物通過PCR 成功擴增出540 bp 左右的目的條帶，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖3。 將分離株命名為DT1。

圖2 16S rDNA PCR 擴增結(jié)果

圖3 tuf 基因PCR 擴增結(jié)果

2.4 16S rDNA 基因系統(tǒng)進化分析

由圖4 可知，青海大通分離株DT1 與23 個參考株16S rDNA 序列進行比對， 同源性為96.7%～99.9%。 DT1 與孟加拉國水體分離株（GenBank 登錄號：MH010137）、 尼日利亞雞分離株（GenBank登錄號：LC385636）、印度魚分離株（GenBank 登錄號：KU378106）、 中國河南狐貍分離株（GenBank登錄號：EU3643833） 和中國山東人分離株（Gen-Bank 登錄號：GQ259884）同源性最高，達99.9%；與中國河南雞分離株 （GenBank 登錄號：KJ156620）同源性最低，為96.7%。

圖4 16S rDNA 序列同源性比對

對DT1 株與GenBank 中收錄的23 株奇異變形桿菌16S rDNA 序列繪制系統(tǒng)進化樹。由圖5 可知，24 株奇異變形桿菌在進化上分為兩大支，奇異變形桿菌來源廣泛，宿主多，DT1 株與中國河南狐貍分離株（GenBank 登錄號：EU3643833）和中國山東人分離株（GenBank 登錄號：GQ259884）屬于同一分支，遺傳關系最為密切。

圖5 16S rDNA 系統(tǒng)進化樹

2.5 雛雞致病性試驗

試驗組接種菌液8 h 后雛雞開始發(fā)病， 主要表現(xiàn)為精神沉郁、排黃色稀糞；12 h 后，雛雞相繼死亡，至48 h 全部死亡。 并且從死亡雛雞的心臟、肝臟和脾臟中再次分離到該病原菌， 而對照組雛雞全部存活，表明該株奇異變形桿菌具有致病性。

2.6 藥敏試驗

根據(jù)CLSI 藥敏試驗判定標準， 如表2 所示，分離菌對哌拉西林、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢西丁、氨曲南、阿米卡星、卡那霉素、氧氟沙星、美羅培南等藥物高度敏感，對環(huán)丙沙星、奧格門汀中度敏感，對氨芐西林、阿莫西林、頭孢唑啉、萬古霉素、慶大霉素、鏈霉素、阿奇霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、萘啶酸、氯霉素、克林霉素、呋喃妥因、利福平、多黏菌素B、氟苯尼考產(chǎn)生了耐藥性。

表2 藥敏試驗結(jié)果

3 討論

近年來，奇異變形桿菌感染家禽的情況時有報道，并且種雞感染后可垂直傳播給后代，造成雛雞發(fā)病死亡，對養(yǎng)禽業(yè)有較大危害［16］。為查明青海省大通縣某雞場肉雞發(fā)病死亡原因，該研究無菌采集病死雞病料，進行細菌的分離培養(yǎng)鑒定。 目前，細菌分類鑒定方法主要有兩種： 一種是基于形態(tài)學和生化反應的鑒定法，另一種是核酸分類法［17-18］。基于形態(tài)學和生理生化的鑒定法需要對細菌進行純培養(yǎng)，然后進行形態(tài)學觀察，再將純培養(yǎng)物接種生化反應管來加以鑒定，鑒定過程往往費時費力。16S rDNA 大小適中（1.5 kb），其內(nèi)部既含有同類菌之間高度保守的序列， 又含有不同種類菌高度變異的差異序列， 是目前核酸法鑒定細菌種屬的理想靶標，已廣泛應用于細菌分類鑒定上，且操作相對簡便快速［19］。該研究為快速、準確鑒定分離菌類別，在細菌純培養(yǎng)后，挑取平板上的可疑菌落進行了16S rDNA 擴增和測序， 通過與GenBank 中公布的序列比對后， 發(fā)現(xiàn)與奇異變形桿菌同源性最高，為99.9%。 隨后，又對分離的疑似菌同步進行了革蘭染色鏡檢和生化試驗， 進一步確認分離的疑似菌為奇異變形桿菌， 為疾病快速診斷奠定了基礎。

為鑒定該分離菌是否具有致病性， 選擇2 周齡SPF 雛雞進行了攻毒試驗， 結(jié)果表明該奇異變形桿菌具有致病性，雛雞致死率可達100%，并且從病死雞臟器中分離到該菌， 表明發(fā)病雞場病原為該株奇異變形桿菌。細菌病由于血清型多、致病機制復雜、毒力因子眾多，往往缺乏有效的疫苗，抗生素仍是目前防治細菌病的最有效手段。然而，由于抗生素不規(guī)范、不合理使用，使包括奇異變形桿菌在內(nèi)越來越多的細菌產(chǎn)生了多重耐藥性，給細菌病防治帶來一定的困難［19］。 為評價該研究分離的該株奇異變形桿菌耐藥性，選取9 大類27 種藥物進行藥敏試驗，結(jié)果顯示分離菌對青霉素類、β-內(nèi)酰胺類、糖肽類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類的少部分藥物產(chǎn)生了耐藥性， 而對喹諾酮類中的絕大多部分藥物產(chǎn)生了耐藥性，對頭孢類、單酰胺菌素類中的一些藥物高度敏感， 表現(xiàn)為多重耐藥，與先前報道的結(jié)果基本一致［20］。 因此，發(fā)生細菌性疾病時，迅速分離致病菌，進行藥物敏感試驗，選擇敏感藥物對控制疫病至關重要。

4 結(jié)論

從發(fā)病雞場分離到一株奇異變形桿菌， 該菌對雞具有較強的致病性，且表現(xiàn)為多重耐藥。