體液piRNA作為疾病潛在生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展

鄔燕倩，俞 翀，沈 鷺，鄭浩然，洪葉挺

（1.杭州醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院生物工程學(xué)院，浙江 杭州 311300；2.浙江省人民醫(yī)院泌尿外科，浙江 杭州 310014；3.溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)院，浙江 溫州 325035）

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，篩選出高特異性和高靈敏度的生物標(biāo)志物，實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的快速、精準(zhǔn)診斷，是目前醫(yī)學(xué)研究的一個(gè)重要方向。體液細(xì)胞外RNA（extracellular RNA，exRNA）具有成為新型生物標(biāo)志物的可能。有研究發(fā)現(xiàn)，PIWI蛋白相互作用RNA（PIWI-interacting RNA，piRNA）可穩(wěn)定地存在于血液（血清、血漿）、尿液、唾液、精液等體液中。在病理狀態(tài)下，體液中piRNA出現(xiàn)顯著的差異表達(dá)，而這些差異表達(dá)的piRNA可作為一種潛在的新型生物標(biāo)志物，用于疾病的預(yù)測(cè)、診斷和預(yù)后。本文就各種疾病狀態(tài)下，人體液中piRNA的差異表達(dá)作一綜述。

1 piRNA的結(jié)構(gòu)與功能

piRNA是從動(dòng)物生殖細(xì)胞中分離得到的一類與生殖細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的新型內(nèi)源性非編碼小RNA[1-2]，具有動(dòng)物特異性，長(zhǎng)度為24～33 nt。在結(jié)構(gòu)上，大部分piRNA以單鏈形式存在，其5'端第1位具有單磷酸化和尿嘧啶偏好性，3'末端有2'-O-甲基化修飾，并與Argonaute蛋白家族中的PIWI蛋白相互作用[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，piRNA在沉默轉(zhuǎn)座子、調(diào)節(jié)基因表達(dá)及抵抗病毒感染中發(fā)揮著重要作用[4]。piRNA與PIWI蛋白結(jié)合形成piRNA-PIWI復(fù)合物，通過(guò)抑制轉(zhuǎn)座子的跳躍、調(diào)控表觀遺傳和介導(dǎo)mRNA的翻譯等形式參與調(diào)控精子的發(fā)生和腫瘤等疾病的發(fā)生、發(fā)展[5-6]。

2 體液piRNA的發(fā)現(xiàn)和來(lái)源

2013年，HUANG等[7]對(duì)血漿外泌體中的RNA進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)血漿外泌體中存在piRNA。2016年，F(xiàn)REEDMAN等[8]和YUAN等[9]發(fā)現(xiàn)血漿中穩(wěn)定存在piRNA。FREEDMAN等[8]通過(guò)測(cè)序和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）分析了血漿中的RNA，發(fā)現(xiàn)血漿中普遍存在piRNA。YUAN等[9]對(duì)50名健康對(duì)照者和142名癌癥患者（結(jié)直腸癌、前列腺癌和胰腺癌）的血漿外囊泡進(jìn)行了RNA測(cè)序，發(fā)現(xiàn)血漿外囊泡中穩(wěn)定存在大量piRNA。BAHN等[10]通過(guò)二代測(cè)序發(fā)現(xiàn)唾液中存在piRNA。HONG等[11]采用RNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)精漿中存在大量piRNA。EL-MOGY等[12]采用二代測(cè)序?qū)Σ煌w液（全血、血漿、血清、唾液、無(wú)細(xì)胞唾液、尿液和無(wú)細(xì)胞尿液）中的RNA進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)piRNA在各種體液中均有表達(dá)。目前已知piRNA的分泌主要有2種形式：一種是游離的piRNA，直接由細(xì)胞分泌；另一種是piRNA被選擇性地包裹在外泌體和微小體等膜性結(jié)構(gòu)中，然后由細(xì)胞分泌進(jìn)入體液[13]。

3 體液piRNA作為診斷疾病的潛在生物標(biāo)志物的價(jià)值

piRNA 3'端的特異性甲基化修飾提示piRNA在體液中比較穩(wěn)定。有研究結(jié)果顯示，piRNA無(wú)論是反復(fù)凍融還是室溫保存都比較穩(wěn)定[11]。此外，體液中的piRNA在特定疾病狀態(tài)下會(huì)出現(xiàn)差異表達(dá)。因此，體液中piRNA有作為新型生物標(biāo)志物的潛能。

3.1 外周血中piRNA在不同疾病中的差異表達(dá)

3.1.1 消化系統(tǒng)腫瘤患者外周血中piRNA的差異表達(dá) 消化系統(tǒng)腫瘤主要包括胃癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、膽囊癌等，此類患者外周血中piRNA的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。CUI等[14]發(fā)現(xiàn)胃癌患者外周血piR-651和piR-823表達(dá)顯著低于健康對(duì)照者（P＜0.001），且外周血piR-823水平與腫瘤TNM分期和轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（P值分別為0.027、0.026），提示piRNA有作為胃癌發(fā)生、發(fā)展評(píng)估指標(biāo)的潛力。GU等[15]的研究結(jié)果顯示，膽管癌和膽囊癌患者血漿外泌體piR-10506469表達(dá)顯著升高，術(shù)后血漿外泌體piR-10506469和piR-20548188表達(dá)顯著降低，提示血漿外泌體中差異表達(dá)的piRNA可作為膽管癌和膽囊癌輔助診斷及術(shù)后評(píng)估的潛在生物標(biāo)志物。另外，piRNA還被認(rèn)為是結(jié)直腸癌篩查、診斷和預(yù)后評(píng)估的潛在生物標(biāo)志物。有研究結(jié)果顯示，piR-28876和 piR-5937診斷結(jié)腸癌具有較高的敏感性（75.0%、72.0%）和特異性（70.0%、72.5%），與癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）和糖類抗原19-9（carbohydrate antigen19-9，CA19-9）相比，piRNA診斷結(jié)腸癌具有更高的敏感性，且piRNA與CEA、CA-199聯(lián)合檢測(cè)的診斷敏感性更高（86%）[16]。QU等[17]在結(jié)直腸癌患者血清中鑒定出5種差異表達(dá)的piRNA（piR-001311、piR-004153、piR-017723、piR-017724和piR-020365），可用于結(jié)直腸癌的輔助診斷并發(fā)現(xiàn)piR-017724還可作為結(jié)腸癌患者預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物。MAI等[18-19]的研究結(jié)果顯示，在結(jié)直腸癌患者中，piR-54265具有致癌作用，其血清水平與腫瘤組織水平呈正相關(guān)（r=0.53，P＜0.001）；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，血清piR-54265可作為結(jié)直腸癌早期診斷的生物標(biāo)志物（敏感性為85.7%，特異性為65.1%）；患者術(shù)后血清piR-54265水平顯著降低（P=0.000 5），復(fù)發(fā)時(shí)會(huì)再次顯著增高（P=0.014），表明血清piR-54265可作為結(jié)直腸癌篩查、早期診斷和預(yù)后評(píng)估的潛在的生物標(biāo)志物。piR-823已被證明在多種癌癥中表達(dá)失調(diào)，是多種癌癥診斷和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物[5]。SABBAH等[20]發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者血清和癌組織中piR-823表達(dá)顯著升高，其血清水平與結(jié)直腸癌分期呈正相關(guān)（P＜0.001），尤其在晚期（TNM分期Ⅲ～Ⅳ期）結(jié)直腸癌患者中，piR-823水平顯著升高。WANG等[21]的研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸患者血清piR-020619和piR-020450表達(dá)顯著上調(diào)，與結(jié)直腸癌TNM分期（Ⅰ～Ⅱ期）有關(guān)，或可作為早期結(jié)直腸癌潛在的新型生物標(biāo)志物。

3.1.2 血液系統(tǒng)疾病患者外周血中piRNA的差異表達(dá) CORDEIRO等[22]的研究結(jié)果顯示，霍奇金淋巴瘤患者血清piR-651表達(dá)量顯著降低，且與無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期相關(guān)，在治療完全緩解后，血清piR-651表達(dá)量上升至健康人的水平。YAN等[23]的研究結(jié)果顯示，多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓piR-823表達(dá)量明顯高于健康對(duì)照者（P＜0.01），piR-823的表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A（DNA methyltransferase 3A，DNMT3A）和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B（DNA methyltransferase 3B，DNMT3B）表達(dá)量顯著升高，促使DNA高甲基化，沉默腫瘤抑制基因的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生、發(fā)展。LI等[24]的研究結(jié)果顯示，多發(fā)性骨髓瘤患者外周血外囊泡中piR-823呈高表達(dá)，且與腫瘤分期晚期及不良預(yù)后有關(guān)，提示外囊泡中的piR-823可作為多發(fā)性骨髓瘤診斷和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物；另外，他們進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)piR-823可伴隨多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞分泌的外泌體傳遞到內(nèi)皮細(xì)胞中，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)血管生成，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。有研究結(jié)果顯示，多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓上清液外泌體中的piR-004800表達(dá)量顯著升高，且與多發(fā)性骨髓瘤的分期呈正相關(guān)[25]。由此可見(jiàn)，piRNA與霍奇金淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

3.1.3 其他疾病患者外周血中piRNA的差異表達(dá) YANG等[26]發(fā)現(xiàn)，心力衰竭患者血清外泌體中piRNA存在差異表達(dá)，其中piR-020009和piR-006426下調(diào)最顯著，提示piRNA或可作為心力衰竭潛在的生物標(biāo)志物。SUNDAR等[27]系統(tǒng)分析了吸煙者、慢性阻塞性肺疾病患者和非吸煙者血漿外囊泡中的小RNA表達(dá)譜，結(jié)果顯示，piR-012753在慢性阻塞性肺疾病組與非吸煙組之間有明顯差異；piR-016735在吸煙組與慢性阻塞性肺疾病組之間存在明顯差異。JIA等[28]分析了非綜合征型唇腭裂患者血漿外泌體中的piRNA表達(dá)譜，鑒定出3種可作為非綜合征型唇腭裂產(chǎn)前診斷生物標(biāo)志物的piRNA（piR-009228、piR-016659、piR-020496）。SABO等[29]的研究結(jié)果顯示，膀胱癌患者血漿外泌體中的piR-5936表達(dá)量隨病情嚴(yán)重程度的增加而升高。KUMAR等[30]發(fā)現(xiàn)，男性不育組血清piR-26399水平顯著高于健康對(duì)照組（P=0.032），提示血清piR-26399可作為男性不育的潛在生物標(biāo)志物。

總之，piRNA可以穩(wěn)定存在于外周血中，且在特定的病理生理狀態(tài)下會(huì)呈現(xiàn)顯著的差異表達(dá)，提示外周血piRNA具有作為疾病新型生物標(biāo)志物的潛力。

3.2 精液piRNA在男性不育狀態(tài)下的差異表達(dá)

2014年，VOJTECH等[31]首先報(bào)道在精漿外泌體中存在piRNA。2016年，HONG等[11]系統(tǒng)分析了正常對(duì)照者、弱精癥患者和無(wú)精癥患者精漿piRNA的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)男性不育組精漿piRNA的種類和含量均顯著減少和降低，大樣本量驗(yàn)證結(jié)果顯示，弱精癥和無(wú)精癥患者精漿中有5種piRNA（piR-31068、piR-31925、piR-43771、piR-43773和piR-30198）含量顯著下降，這5種piRNA可以作為弱精癥、無(wú)精癥輔助診斷的潛在的新型生物標(biāo)志物。2021年，HONG等[13]又對(duì)精漿中差異表達(dá)最顯著的piR-1207（piR-31068）和piR-2107（piR-31925）進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，piR-1207和piR-2107主要分布于精漿外泌體中，且弱精癥患者精漿外泌體中的含量顯著降低。CHEN等[32]分析了非梗阻性無(wú)精癥患者中成功取到精子組和未成功取到精子組精漿外囊泡中的小RNA表達(dá)譜，結(jié)果顯示，有8個(gè)piRNA在成功取到精子組和未成功取到精子組之間存在顯著差異，其中piR-61927可作為判斷非梗阻性無(wú)精癥患者能否成功取到精子的潛在的生物標(biāo)志物。piRNA主要表達(dá)于生殖細(xì)胞，其對(duì)于沉默生殖細(xì)胞基因組轉(zhuǎn)座元件和調(diào)控生殖細(xì)胞基因表達(dá)至關(guān)重要，而piRNA的異常表達(dá)也被認(rèn)為是男性不育的潛在原因[33]。因此，精漿piRNA的特異性表達(dá)可作為輔助診斷男性不育等疾病的潛在生物標(biāo)志物。

3.3 尿液中piRNA在疾病狀態(tài)下的差異表達(dá)

ILIEV等[34]的研究結(jié)果顯示，腎細(xì)胞腎癌患者尿液piR-823表達(dá)顯著高于對(duì)照者（P=0.015 6），其診斷腎細(xì)胞腎癌的受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線下面積為0.74，表明尿液piR-823對(duì)于腎細(xì)胞腎癌有較好的輔助診斷價(jià)值。MARKERT等[35]發(fā)現(xiàn)尿液piR-018849和piR-019324可用于鑒別前列腺癌和前列腺增生。由此可見(jiàn)，特異性表達(dá)的piRNA有助于腎臟、泌尿系統(tǒng)疾病的輔助診斷和病情監(jiān)測(cè)。

3.4 唾液piRNA在疾病狀態(tài)下的差異表達(dá)

唾液是最易獲取且無(wú)創(chuàng)的體液。唾液中的小RNA，如微小RNA（microRNA，miRNA）、環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）、轉(zhuǎn)移RNA衍生的小RNA（tRNA-derived small RNA，tsRNA）可作為多種疾病潛在的生物標(biāo)志物[36-38]。BAHN等[10]證實(shí)唾液中piRNA含量豐富，且主要位于外泌體中，并提示唾液piRNA可能來(lái)源于唾液腺、口腔黏膜等。因此，唾液中的piRNA或可作為口腔疾病潛在的生物標(biāo)志物。

4 總結(jié)和展望

目前，關(guān)于不同體液中的piRNA是否可作為疾病早期診斷和預(yù)后評(píng)估標(biāo)志物的研究已有一定的進(jìn)展。體液中鑒定出的piRNA已展現(xiàn)出作為多種疾病早期診斷和預(yù)后評(píng)估生物標(biāo)志物的潛力，見(jiàn)表1。但目前相關(guān)研究涉及的疾病種類和數(shù)量還相對(duì)較少，體液piRNA識(shí)別和量化也無(wú)統(tǒng)一的方法，不同方法得出的檢測(cè)結(jié)果之間存在一定的差異，對(duì)于體液piRNA的研究尚處于初始階段。

表1 體液piRNA在不同疾病中的表達(dá)及臨床價(jià)值

隨著體液中外囊泡分離以及核酸測(cè)序和定量檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，體液piRNA的數(shù)據(jù)庫(kù)會(huì)日益完善，piRNA的種類及含量會(huì)被精準(zhǔn)識(shí)別和定量，同時(shí)，體液中piRNA水平的診斷標(biāo)準(zhǔn)也會(huì)被統(tǒng)一。相信隨著分子診斷技術(shù)的快速發(fā)展和piRNA分子機(jī)制研究的深入，體液piRNA極有可能發(fā)展成為一種疾病預(yù)防、早期診斷和預(yù)后評(píng)估的新型生物標(biāo)志物。