魔芋不同生理狀態(tài)的愈傷組織和叢生芽?jī)?nèi)源激素及抗氧化酶研究

蔡陽(yáng)光，段龍飛，覃劍鋒，郭邦利，陳國(guó)愛(ài)，張百忍

安康市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院， 陜西 安康 725021

植物的生長(zhǎng)過(guò)程是植物內(nèi)源各激素水平間的動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程， 內(nèi)源激素對(duì)植物愈傷組織生長(zhǎng)和分化有調(diào)控作用[1]． 但在誘導(dǎo)植物組織分化過(guò)程中， 內(nèi)外源激素之間存在相互作用， 外源激素與內(nèi)源激素的種類和水平有著密切的關(guān)系， 并通過(guò)多種機(jī)理實(shí)現(xiàn)相互作用， 一起構(gòu)成了一個(gè)非常精細(xì)而復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[2-4]． 通過(guò)外源激素的適時(shí)適量運(yùn)用， 可使植物體內(nèi)的生理生化反應(yīng)以及激素水平和種類發(fā)生顯著的變化， 進(jìn)而調(diào)控作物的源庫(kù)關(guān)系[5-7]． 王京偉等[8]研究發(fā)現(xiàn)， 內(nèi)外源激素協(xié)同調(diào)控山丹小鱗莖的分化方向， 且在培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)， 添加的外源激素不同， 小鱗莖的形態(tài)變化也不相同， 對(duì)應(yīng)的內(nèi)源激素水平也發(fā)生了一定的變化． 李本波[9]在杜梨愈傷誘導(dǎo)發(fā)生的研究中指出， 外源激素和內(nèi)源激素在杜梨愈傷組織培養(yǎng)中有著較強(qiáng)的相互作用， 添加不同的單一外源激素， 可促進(jìn)杜梨內(nèi)源激素的合成， 同時(shí)還可以引起激素間的比值發(fā)生變化； 且不同外源激素對(duì)杜梨愈傷組織內(nèi)源激素影響存在一定的差異， 內(nèi)源激素水平或不同內(nèi)源激素間比值與不添加外源激素的愈傷組織間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．

魔芋作為地下球莖類作物， 其離體器官發(fā)生形式與內(nèi)源激素變化及平衡水平相關(guān)[10]． 吝祥根[11]研究指出， 在細(xì)胞分化過(guò)程中， 高水平的內(nèi)源ZR，ZR/IAA比值以及適量的IAA和GA3有利于花魔芋愈傷組織細(xì)胞的分化， 而ABA不利于愈傷組織細(xì)胞的分化； POD α-淀粉酶和PAL活性增加有利于愈傷組織細(xì)胞的再分化， 這些酶可能是以提高細(xì)胞的代謝水平以及提供細(xì)胞分化所需要的物質(zhì)和能量的方式， 發(fā)揮其對(duì)細(xì)胞分化的促進(jìn)作用． 黃丹楓等[12-14]研究指出， 異戊烯基嘌呤類(iPAs)CTK是決定魔芋細(xì)胞分化和器官發(fā)生的內(nèi)源激素； 細(xì)胞內(nèi)異戊烯基嘌呤類細(xì)胞分裂素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的上升與不定芽發(fā)生呈正相關(guān)， 培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素類物質(zhì)的種類和濃度， 影響魔芋愈傷組織細(xì)胞內(nèi)iPAs的生物合成， 從而影響魔芋愈傷組織的細(xì)胞分化、 器官發(fā)生和植株再生； 另外， 內(nèi)源細(xì)胞分裂素iPAs與魔芋不定芽分化正相關(guān)， 通過(guò)促進(jìn)遺傳物質(zhì)的合成， 提高CAT，PAL，POX酶活性而起作用， 同時(shí)分化培養(yǎng)基中適宜的6-BA，IAA濃度與iPAs，CAT活性正相關(guān)， 也促進(jìn)了魔芋不定芽的分化． 胡建斌等[15]對(duì)不同類型的魔芋愈傷組織研究后發(fā)現(xiàn)， 只有結(jié)構(gòu)致密且表面呈瘤狀的愈傷組織(Ⅲ型)才能誘導(dǎo)形成微型薯， 其他類型的愈傷組織(Ⅰ型， Ⅱ型)則傾向于形成不定芽； 進(jìn)一步研究?jī)煞N途徑的愈傷組織中的內(nèi)源激素發(fā)現(xiàn)， 赤霉素與茉莉酸的平衡是調(diào)控魔芋離體形態(tài)建成的主要因素． 魔芋是我國(guó)西部山區(qū)重要的特色經(jīng)濟(jì)作物， 繁殖系數(shù)低， 組織培養(yǎng)是快繁和優(yōu)質(zhì)種質(zhì)保存的重要途徑． 目前魔芋組培主要經(jīng)過(guò)外植體脫分化和再分化進(jìn)行， 在脫分化和再分化過(guò)程中， 受遺傳因素、 培養(yǎng)條件、 生理狀態(tài)、 激素以及次生代謝物質(zhì)的影響， 愈傷組織和叢生芽形態(tài)多樣化且頻率不一致， 如褐化、 僵化、 老化和玻璃化等， 會(huì)對(duì)后續(xù)的繼代培養(yǎng)和形態(tài)建成產(chǎn)生不利影響． 另外對(duì)魔芋離體細(xì)胞脫分化、 再分化和形態(tài)建成的內(nèi)在機(jī)制及其調(diào)控機(jī)制， 內(nèi)源激素對(duì)魔芋離體再生的影響及其作用機(jī)制， 以及各激素間相互影響均需進(jìn)一步驗(yàn)證[16-17]． 本研究以遺傳同質(zhì)、 生理狀態(tài)不同的魔芋愈傷組織和叢生芽作為研究對(duì)象， 通過(guò)測(cè)定其內(nèi)源激素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及SOD，POD，CAT酶的活性， 分析其相關(guān)性， 探明內(nèi)源激素對(duì)形態(tài)建成的影響， 為定向調(diào)控奠定基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

雜交魔芋品種“安魔128”， 安康市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院自主選育的魔芋品種， 2019年種植于該院示范園魔芋繁育基地， 常規(guī)管理， 選取3齡球莖作為外植體組培， 挑選同期不同生長(zhǎng)及分化狀態(tài)的愈傷組織和叢生芽作為檢測(cè)材料．

1.2 組織培養(yǎng)

試驗(yàn)于2020年4月23日在安康市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院魔芋組培中心進(jìn)行． ① 選取1.21 kg健康無(wú)外傷的“安魔128”球莖， 清洗消毒后， 將其均勻切成1 cm3大小， 接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中： MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA+4.2 mg/L瓊脂+30 g/L蔗糖， pH值為5.8～6.0， 每瓶接種1塊， 共227瓶； ② 培養(yǎng)至32 d， 挑選3種不同生長(zhǎng)狀態(tài)的愈傷組織進(jìn)行內(nèi)源激素及酶活檢測(cè)， 每個(gè)處理挑選10瓶； ③ 同時(shí)挑選質(zhì)地堅(jiān)硬、 表面呈顆粒狀的愈傷組織， 平均切分成2塊， 接種于芽分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中： MS+3.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+0.2 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L NAA+4.2mg/L瓊脂+20 g/L蔗糖， pH值為5.8～6.0， 每瓶接種1塊， 共169瓶； ④ 培養(yǎng)至40 d， 挑選不同分化狀態(tài)的叢生芽進(jìn)行內(nèi)源激素及酶活檢測(cè)， 每個(gè)處理挑選10瓶．

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

2020年5月24日挑選3種類型愈傷組織進(jìn)行檢測(cè)， 每種類型挑選10瓶， 愈傷組織平均9.49 g/個(gè)． 2020年7月3號(hào)挑選5種類型叢生芽進(jìn)行檢測(cè)， 每種類型挑選10瓶， 叢生芽平均7.53 g/個(gè)． 采用高效液相色譜法[18-19]測(cè)定GA3，ABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)； 采用酸性茚三酮法[20]測(cè)定脯氨酸(Pro)質(zhì)量分?jǐn)?shù)， 硫代巴比妥酸顯色法[21]測(cè)定MDA質(zhì)量分?jǐn)?shù)； 采用對(duì)鄰苯三酚自氧化法[22]測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)的活性， 參照陳建勛等[23]的方法測(cè)定過(guò)氧化物酶(POD)的活性， 紫外分光光度法[24]測(cè)定過(guò)氧化氫酶(CAT)的活性．

采用酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒測(cè)定6-BA，KT，2，4-D及NAA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)： 取0.5 g經(jīng)液氮處理后的樣品， 充分研磨， 加入PBS， 2 000～3 000 r/min離心20 min， 收集上清液后分裝， 留1份待測(cè)， 其余保存于4 ℃冰箱備用． 往預(yù)先包被6-BA，KT，2，4-D及NAA捕獲抗體的微孔中， 依次加入標(biāo)本、 標(biāo)準(zhǔn)品、 HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體， 經(jīng)過(guò)溫育并徹底洗滌． 用底物TMB顯色， TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色， 并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色． 顏色的深淺和樣品中各激素的多少呈正相關(guān)． 用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值)， 計(jì)算樣品濃度， 用標(biāo)準(zhǔn)品做對(duì)照計(jì)算各指標(biāo)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)， 每個(gè)處理重復(fù)測(cè)定3次．

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用Excel 2003與SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計(jì)分析．

2 結(jié)果與分析

2.1 不同類型魔芋愈傷組織生理指標(biāo)分析

由表1可知， 魔芋愈傷組織類型3的GA3，Pro質(zhì)量分?jǐn)?shù)及抗氧化酶SOD，CAT活性均顯著高于其他2種類型， 同時(shí)ABA，MDA質(zhì)量分?jǐn)?shù)均較低， 表明愈傷組織類型3較類型1和類型2生長(zhǎng)更旺盛， 這與圖1中的外在表現(xiàn)較一致． 類型3愈傷組織分化效果最好， 質(zhì)地堅(jiān)硬松散， 表面有顆粒狀， 呈粉綠色； 類型2分化效果良好， 但質(zhì)地較軟呈水漬狀， 表面暗紅色； 類型1分化不完全， 質(zhì)地堅(jiān)硬不松散， 且伴有褐化現(xiàn)象．

從表1中還可以看出， 愈傷組織類型3中4種內(nèi)源激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著高于類型1和類型2， 且各激素6-BA， KT， 2，4-D， NAA的比例為114∶80∶68∶100， (6-BA+KT+2，4-D)與NAA的比值R=2.62∶1(類型3)<2.71∶1(類型2)<2.89∶1(類型1)． 4種內(nèi)源激素水平間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， 且當(dāng)(6-BA+KT+2，4-D)與NAA的比值R≤2.62時(shí)， 有利于魔芋球莖愈傷組織的分化． 同時(shí)， 在誘導(dǎo)脫分化形成愈傷組織的過(guò)程中， 單獨(dú)使用2，4-D也可誘導(dǎo)愈傷組織的形成， 但形成的愈傷組織較松軟， 難分化； 而使用中低濃度的2，4-D配合6-BA(KT)對(duì)加速細(xì)胞分裂快速形成胚性愈傷具有明顯的作用．

表1 3種類型魔芋愈傷組織生理指標(biāo)比較

圖1 3種不同生長(zhǎng)狀態(tài)的魔芋愈傷組織

2.2 不同類型魔芋叢生芽生理指標(biāo)分析

由表2可知， 類型3魔芋叢生芽GA3，Pro的質(zhì)量分?jǐn)?shù)及抗氧化酶活性均較高， 且ABA，MDA質(zhì)量分?jǐn)?shù)均較低， 較其他類型叢生芽差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義． 結(jié)合圖2叢生芽分化的外在表現(xiàn)， 表明該類型芽處于生理旺盛階段． 類型1叢生芽由于褐化影響了正常的分化和生長(zhǎng)； 類型2叢生芽出現(xiàn)了老化現(xiàn)象， 再生頻率低； 類型4叢生芽與類型3相比， GA3，CAT質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低， 導(dǎo)致有效芽分化數(shù)相對(duì)較少； 類型5叢生芽SOD活性最高， 同時(shí)ABA，MDA質(zhì)量分?jǐn)?shù)也較高， 而GA3，Pro質(zhì)量分?jǐn)?shù)及CAT活性相對(duì)較低， 可能細(xì)胞膜受到氧自由基的傷害， 從而形成外在的玻璃化狀態(tài)以及顯示邊緣水漬狀．

表2 5種類型魔芋叢生芽生理指標(biāo)比較

由表2還可以了解到， 不同類型魔芋叢生芽?jī)?nèi)源激素水平有差異， 類型3各激素6-BA， KT， 2，4-D， NAA的比例為119∶79∶72∶100， (6-BA+KT+2，4-D)與NAA的比值R=2.70∶1， 其中2.37∶1(類型5)<2.53∶1(類型1)<2.62∶1(類型4)<2.70∶1(類型3)<3.12∶1(類型2)． 說(shuō)明對(duì)于魔芋叢生芽分化而言， 細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素總的比值應(yīng)維持在適宜水平， 比值過(guò)高(類型2)， 易出現(xiàn)老化芽現(xiàn)象； 比值過(guò)低又會(huì)導(dǎo)致分化慢， 分化不完整． 另外， 僅KT和NAA差異顯著的類型3和類型4， 芽的分化數(shù)量和形態(tài)也有差異．

在圖2中， 類型3芽密， 質(zhì)地堅(jiān)硬松散， 芽頭呈嫩綠色； 類型4芽密， 呈松散狀， 芽頭多呈粉紅色； 類型1芽少， 質(zhì)地較硬不松散， 伴有部分褐化； 類型2芽密， 質(zhì)地較硬不松散， 芽頭大多呈淺粉色， 并且芽外形呈花瓣?duì)睿?難以形成有效苗； 類型5芽密， 質(zhì)地偏軟不松散， 芽較長(zhǎng)且呈白色或透明狀， 幼苗細(xì)弱且葉片呈水漬狀， 即玻璃化．

圖2 5種不同生理狀態(tài)魔芋叢生芽

2.3 魔芋愈傷組織內(nèi)源激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)及抗氧化酶相關(guān)性分析

由表3可知， 內(nèi)源激素KT和NAA質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間呈極顯著負(fù)相關(guān)， 6-BA和2，4-D質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間呈極顯著正相關(guān)． 6-BA，2，4-D與POD活性之間呈極顯著正相關(guān)， 與SOD活性之間呈顯著負(fù)相關(guān)． NAA與SOD，CAT活性之間呈顯著正相關(guān)， 2，4-D與CAT活性之間呈顯著負(fù)相關(guān)． SOD與CAT之間呈極顯著正相關(guān)， 而與POD之間呈極顯著負(fù)相關(guān)． ABA，Pro和MDA與衰老和逆境脅迫有關(guān)， 與NAA呈極顯著正相關(guān)， 與KT呈負(fù)相關(guān)， 較低的NAA和較高的KT水平有利于愈傷組織的增殖．

表3 魔芋愈傷組織生理指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.4 魔芋叢生芽?jī)?nèi)源激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)及抗氧化酶相關(guān)性分析

由表4可知， 內(nèi)源激素KT與2，4-D，6-BA之間均呈極顯著正相關(guān)， 6-BA，KT及2，4-D與SOD，POD活性之間均呈極顯著或顯著正相關(guān)． KT，2，4-D及NAA質(zhì)量分?jǐn)?shù)與CAT活性之間均呈顯著或極顯著正相關(guān)， 保護(hù)酶SOD與CAT，POD活性之間呈顯著或極顯著正相關(guān)． 另外， SOD，CAT，GA3及Pro與MDA之間呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)， Pro與CAT之間呈極顯著正相關(guān)． 表明KT與2，4-D，6-BA之間相互促進(jìn)， 且內(nèi)源各激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加會(huì)促進(jìn)相關(guān)抗氧化酶活性的增高； 同時(shí)抗氧化酶與相關(guān)生理物質(zhì)間存在相互促進(jìn)與抑制作用． 6-BA與ABA呈極顯著正相關(guān)， NAA與ABA呈極顯著負(fù)相關(guān)， 較低的6-BA和較高的NAA有利于芽的分化．

表4 魔芋叢生芽生理指標(biāo)的相關(guān)性分析

3 討論

劉清等[25]研究指出， 內(nèi)源激素對(duì)水稻愈傷組織的生理表現(xiàn)有著極其重要的影響， 其種類、 質(zhì)量分?jǐn)?shù)及協(xié)調(diào)平衡是水稻愈傷組織形成和分化的關(guān)鍵． 合適的濃度和比例能有效促進(jìn)外植體的脫分化與再分化， 并協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞的分裂、 分化和生長(zhǎng)[26]． 郭敏敏等[27]通過(guò)測(cè)定棉花愈傷組織中的內(nèi)源激素后發(fā)現(xiàn)， 不同內(nèi)源激素適宜的濃度和比例調(diào)節(jié)外植體的脫分化和再分化， 各種激素協(xié)同作用促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化． 本研究也發(fā)現(xiàn)， 對(duì)于魔芋愈傷組織和叢生芽的分化， 內(nèi)源細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的總比值應(yīng)維持在相對(duì)適宜的水平， 且不同組織各細(xì)胞分裂素的作用也有主次之分； 如6-BA， KT， 2，4-D質(zhì)量分?jǐn)?shù)太高會(huì)影響愈傷組織和叢生芽的分化， 導(dǎo)致組織的老化； NAA在一定濃度范圍內(nèi)， 可促進(jìn)組織的生長(zhǎng)分化和提高抗氧化的作用． 肖關(guān)麗等[28]發(fā)現(xiàn)， 植物組織培養(yǎng)過(guò)程中的各種變化與內(nèi)源激素種類、 水平及配比具有重要關(guān)系， 包括對(duì)胚性細(xì)胞及體胚的形成， 以及愈傷組織分化芽和根等均具有顯著影響． 適當(dāng)提高內(nèi)源激素NAA質(zhì)量分?jǐn)?shù)或提高6-BA/NAA， KT/NAA以及(6-BA+KT+2，4-D)/NAA的比值能顯著促進(jìn)愈傷組織及叢生芽的生長(zhǎng)分化， 2，4-D與NAA的比值較大對(duì)促進(jìn)叢生芽分化有抑制作用． 王秀紅[29]研究指出， 內(nèi)源激素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和配比是影響愈傷組織誘導(dǎo)率和綠苗分化率的關(guān)鍵因素之一， 表現(xiàn)為IAA和GA呈負(fù)效應(yīng)， ABA，Z+ZR呈正效應(yīng)； 同時(shí)， 內(nèi)源激素的配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率和綠苗分化率也有一定作用， 表現(xiàn)為IAA/Z+ZR對(duì)愈傷誘導(dǎo)率有一定的正效應(yīng)， Z+ZR/IAA，ABA/IAA對(duì)綠苗分化率呈顯著正相關(guān)． 有研究證實(shí)， 魔芋細(xì)胞內(nèi)CTK，IAA的代謝變化是細(xì)胞分化、 器官發(fā)生的調(diào)節(jié)因子和物質(zhì)基礎(chǔ)， 培養(yǎng)基中激素種類和濃度通過(guò)影響內(nèi)源激素的代謝而起作用， 且影響魔芋細(xì)胞分化的內(nèi)源CTK主要是iPAs類[30]， 這與本研究結(jié)果基本一致． 另外， 魔芋細(xì)胞分化、 器官發(fā)生的生化反應(yīng)順序是： 激素代謝， RNA及DNA合成代謝， 蛋白質(zhì)合成酶系統(tǒng)反應(yīng)． 本研究也發(fā)現(xiàn)， 不同內(nèi)源激素與抗氧化酶間均存在直接或間接相關(guān)作用， 同時(shí)與其他生理物質(zhì)間也存在著相互作用， 從而共同影響愈傷組織和叢生芽的分化和外在形態(tài)．