三葉木通種質(zhì)資源形態(tài)學(xué)標(biāo)記的遺傳多樣性分析

楊西萌，李桂香，潘玉芳，石多麗，孫正瓊，眭順照，李名揚(yáng)

西南大學(xué) 園藝園林學(xué)院， 重慶 400715

三葉木通(Akebiatrifoliata)為木通科(Lardizabalaceae)木通屬(Akebia)落葉木質(zhì)藤本植物， 莖蔓柔軟多姿， 花紫紅色， 花期長(zhǎng)達(dá)2個(gè)月之久， 具有很好的觀賞和園林應(yīng)用價(jià)值[1-3]． 此外， 三葉木通為中國(guó)傳統(tǒng)的中藥材， 其根、 藤莖、 果實(shí)等具有通筋活絡(luò)、 解毒和消炎等功效， 其果實(shí)為肉質(zhì)蓇葖果， 色香味俱全， 是珍稀的綠色水果和保健食品， 是極具發(fā)展前景的經(jīng)濟(jì)樹(shù)種[1-3]．

對(duì)三葉木通的研究目前集中在種質(zhì)資源調(diào)查[4]、 栽培種植[5]、 病原菌鑒定[6]、 藥用價(jià)值[7]、 果實(shí)化學(xué)成分和果實(shí)貯藏保鮮[8]、 應(yīng)用分子標(biāo)記開(kāi)展遺傳多樣性分析[9-10]、 指紋圖譜研究[11]等方面， 最近有文獻(xiàn)報(bào)道三葉木通染色體水平的基因組序列[12]． 盡管在三葉木通種質(zhì)資源遺傳多樣性評(píng)價(jià)上已有部分研究， 但研究涉及到的三葉木通種質(zhì)資源不夠全面[13]， 并且還未能建立官方的“三葉木通描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)”．

形態(tài)學(xué)標(biāo)記是種質(zhì)資源遺傳多樣性評(píng)價(jià)較為簡(jiǎn)單有效， 且表現(xiàn)直觀的方法[14]． 其結(jié)合主成分、 相關(guān)性和聚類分析等方法[15]， 已廣泛運(yùn)用于經(jīng)濟(jì)植物的種質(zhì)資源研究[16-21]． 本研究運(yùn)用形態(tài)學(xué)標(biāo)記方法， 以貴州、 湖南、 秦嶺地區(qū)收集的96份三葉木通實(shí)生種質(zhì)資源為樣本， 對(duì)19個(gè)性狀進(jìn)行相關(guān)性分析、 主成分分析和聚類分析， 綜合分析其表型遺傳多樣性， 為三葉木通種質(zhì)創(chuàng)新奠定一定的物質(zhì)基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支撐．

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

96份供試材料為實(shí)生種質(zhì)資源． 2015-2018年間從湖南、 貴州、 秦嶺片區(qū)采集的野生三葉木通資源， 采集后種植于重慶鄭清紫藤公園．

1.2 數(shù)據(jù)采集整理

1.2.1 形態(tài)記載標(biāo)準(zhǔn)

試驗(yàn)于2019年7-10月進(jìn)行， 每份種質(zhì)資源在約4 m2的小區(qū)內(nèi)， 以行距2 m、 株距2 m的密度種植； 2019年未噴施農(nóng)藥． 參考李秀華等[22]的調(diào)查方法， 對(duì)三葉木通表型性狀記載標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行整理(表1和表2)． 對(duì)每份實(shí)生種質(zhì)資源的10個(gè)數(shù)量性狀和9個(gè)質(zhì)量性狀進(jìn)行田間調(diào)查， 以此分析三葉木通實(shí)生資源的表型遺傳多樣性．

表1 三葉木通表型數(shù)量性狀記載標(biāo)準(zhǔn)

表2 三葉木通表型質(zhì)量性狀記載標(biāo)準(zhǔn)

1.2.2 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理及統(tǒng)計(jì)分析

通過(guò)excel軟件對(duì)96份實(shí)生種質(zhì)資源的表型性狀進(jìn)行匯總， 對(duì)10個(gè)數(shù)量性狀進(jìn)行描述統(tǒng)計(jì)， 計(jì)算9個(gè)質(zhì)量性狀的頻率分布與遺傳多樣性指數(shù)(Shannon-Wiener index，H′)． 利用SPSS 23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析、 主成分分析和聚類分析， 聚類分析采用平方歐氏距離瓦爾德法的系統(tǒng)聚類分析方法， 遺傳距離為平方歐式距離[23]．

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)量性狀差異分析

依據(jù)三葉木通實(shí)生種質(zhì)資源的果縱徑、 果橫徑、 小葉長(zhǎng)、 小葉寬、 頂葉長(zhǎng)、 頂葉寬、 葉柄長(zhǎng)、 小葉長(zhǎng)寬比和頂葉長(zhǎng)寬比等10個(gè)數(shù)量性狀的數(shù)據(jù)分析(表3)， 在不同三葉木通實(shí)生種質(zhì)資源間， 變異系數(shù)均大于10%， 范圍在12.9%～41.4%之間． 10個(gè)數(shù)量性狀變異系數(shù)由大到小依次為： 葉柄長(zhǎng)41.4%、 頂葉寬17.6%、 果縱徑16.8%、 頂葉長(zhǎng)寬比16.5%、 小葉寬16.4%、 小葉長(zhǎng)15.8%、 頂葉長(zhǎng)15.6%、 果縱橫徑比14.5%、 小葉長(zhǎng)寬比13.3%、 果橫徑12.9%．

表3 三葉木通種質(zhì)資源的數(shù)量性狀的差異與多樣性

2.2 質(zhì)量性狀遺傳多樣性分析

依據(jù)表4， 三葉木通實(shí)生種質(zhì)資源的果實(shí)性狀， 果量在10～20顆(含10和20顆)占比較多， 有39.5%， 其次是小于10顆的果量， 占36.0%， 大于20顆的占24.4%； 果色有66.3%是黃色， 紫色與粉色的占比分別是17.4%與16.3%； 坐果類型， 分散著生與成簇著生的占比為51.2%與46.5%， 穗狀著生的比例為2.3%； 果染病率在75%～100%之間的占比較多， 為44.2%， 接下來(lái)依次是果染病率0～25%，25%～50%，50%～75%， 分別占比24.4%，19.8%，11.6%． 三葉木通實(shí)生種質(zhì)資源的葉片性狀， 不同葉色頻率從高到低依次是綠、 暗綠、 亮綠， 頻率分別為63.5%，27.1%，9.4%； 不同葉片質(zhì)地頻率從高到低依次是革質(zhì)、 厚革質(zhì)、 薄革質(zhì)， 頻率分別為88.5%，9.4%，2.1%； 不同葉形頻率從高到低依次是闊卵形、 卵形、 尖端凹入卵形、 邊緣淺裂卵形， 頻率分別為45.8%，22.9%，20.8%，10.4%； 不同葉染病率頻率從高到低依次是50%～75%，25%～50%，0～25%，75%～100%， 頻率分別為36.5%，30.2%，19.8%，13.5%． 三葉木通實(shí)生種質(zhì)資源的株型性狀， 一般株型占比較高為43.8%， 其次是疏散株型的占比為36.5%， 再次是緊湊株型的占比為19.8%．

Shannon遺傳多樣性指數(shù)范圍在0.59～1.85， 除了株型外的8個(gè)質(zhì)量性狀都大于1.00．

表4 三葉木通種質(zhì)資源質(zhì)量性狀的分布頻率與遺傳多樣性指數(shù)

2.3 三葉木通表型性狀的相關(guān)性分析

由表5可知， 果量與果色、 坐果類型、 果染病率、 株型、 果縱徑、 果橫徑、 果實(shí)縱橫徑比呈極顯著正相關(guān)， 與葉染病率呈顯著正相關(guān)； 果色與坐果類型、 果縱徑、 果橫徑、 果實(shí)縱橫徑比呈極顯著相關(guān)， 與株型呈顯著相關(guān)； 坐果類型與果染病率、 株型、 果縱徑、 果橫徑、 果縱橫徑比呈極顯著正相關(guān)； 果染病率與果縱徑、 果橫徑、 果縱橫徑比呈極顯著正相關(guān)， 與葉染病率呈顯著正相關(guān)； 葉色與葉染病率呈極顯著正相關(guān)； 葉質(zhì)與葉形、 小葉長(zhǎng)、 小葉寬、 頂葉長(zhǎng)呈顯著正相關(guān)； 葉形與小葉長(zhǎng)、 葉柄長(zhǎng)、 小葉長(zhǎng)寬比呈極顯著正相關(guān)， 與頂葉長(zhǎng)呈顯著正相關(guān)； 葉染病率與株型呈極顯著正相關(guān)； 株型與小葉長(zhǎng)、 小葉寬、 頂葉長(zhǎng)、 頂葉寬、 果實(shí)縱橫徑比呈極顯著正相關(guān)， 與葉柄長(zhǎng)呈顯著正相關(guān)； 果縱徑與果橫徑、 小葉寬、 頂葉寬、 果實(shí)縱橫徑比呈極顯著正相關(guān)， 與小葉長(zhǎng)呈顯著正相關(guān)； 果橫徑與小葉寬、 果實(shí)縱橫徑比呈極顯著正相關(guān)； 小葉長(zhǎng)與小葉寬、 頂葉長(zhǎng)、 頂葉寬、 小葉長(zhǎng)寬比呈極顯著正相關(guān)， 與葉柄長(zhǎng)、 果實(shí)縱橫經(jīng)比呈顯著正相關(guān)； 小葉寬與頂葉長(zhǎng)、 頂葉寬、 小葉長(zhǎng)寬比、 頂葉長(zhǎng)寬比呈極顯著正相關(guān)， 與果實(shí)縱橫徑比呈顯著正相關(guān)； 頂葉長(zhǎng)與頂葉寬、 小葉長(zhǎng)寬比呈極顯著正相關(guān)， 與葉柄長(zhǎng)、 頂葉長(zhǎng)寬比呈顯著正相關(guān)； 頂葉寬與葉柄長(zhǎng)、 頂葉長(zhǎng)寬比呈極顯著正相關(guān)， 與小葉長(zhǎng)寬比、 果實(shí)縱橫徑比呈顯著正相關(guān)； 小葉長(zhǎng)寬比與頂葉長(zhǎng)寬比呈極顯著正相關(guān)． 根據(jù)對(duì)三葉木通實(shí)生種質(zhì)資源的19個(gè)性狀進(jìn)行相關(guān)性分析的結(jié)果， 各個(gè)性狀相互聯(lián)系， 在利用資源的時(shí)候要對(duì)各個(gè)性狀進(jìn)行綜合考量．

表5 三葉木通種質(zhì)資源19個(gè)表型性狀相關(guān)性分析

2.4 三葉木通表型性狀的主成分分析

主要信息集中在前4個(gè)主成分中(表6)， 累積貢獻(xiàn)率為64.714%， 第1主成分特征值為5.057， 貢獻(xiàn)率為26.616%， 果實(shí)縱橫徑比、 果縱徑、 果橫徑、 坐果類型、 果量、 果色是主要指標(biāo)， 此類性狀主要與果實(shí)性狀有關(guān)； 第2主成分特征值為3.413， 貢獻(xiàn)率為17.965%， 小葉長(zhǎng)、 頂葉長(zhǎng)、 頂葉寬、 小葉寬是主要指標(biāo)， 此類性狀主要與葉片長(zhǎng)寬有關(guān)； 第3主成分特征值為2.189， 貢獻(xiàn)率為11.519%， 小葉長(zhǎng)寬比、 頂葉長(zhǎng)寬比是主要指標(biāo)， 此類性狀主要與葉片形態(tài)指標(biāo)有關(guān)； 第4主成分特征值為1.637， 貢獻(xiàn)率為8.614%， 葉染病率與葉色、 葉柄長(zhǎng)是主要指標(biāo)， 此類性狀主要與植株染病情況有關(guān)； 第2，3，4主成分都與葉片性狀相關(guān)．

表6 三葉木通種質(zhì)資源19個(gè)表型性狀的主成分分析

2.5 三葉木通表型性狀的聚類分析

對(duì)三葉木通實(shí)生種質(zhì)資源的19個(gè)性狀進(jìn)行聚類分析(圖1)， 在遺傳距離為7.5時(shí)， 96份三葉木通實(shí)生種質(zhì)資源被分成3類(表7和表8)．

第Ⅰ類， 有42份三葉木通實(shí)生種質(zhì)資源， 果葉較大、 果染病率較高為該類實(shí)生種質(zhì)資源的特征； 第Ⅱ類， 包含44份三葉木通實(shí)生種質(zhì)資源， 此類實(shí)生種質(zhì)資源的果實(shí)與葉片比第Ⅰ類小， 且果染病率較低； 第Ⅲ類， 有10份三葉木通實(shí)生種質(zhì)資源， 該類實(shí)生種質(zhì)資源在調(diào)查期間無(wú)果實(shí)著生、 葉片較小且株型較為松散．

表7 不同類群數(shù)量性狀的平均值與變異系數(shù)

圖1 三葉木通種質(zhì)資源表型性狀聚類分析

表8 不同類群果染病率與株型的分布頻率

3 討論

三葉木通作為我國(guó)的特有種， 分布較廣、 遺傳資源豐富， 是一種極具藥用價(jià)值、 食用價(jià)值、 觀賞價(jià)值和園林應(yīng)用價(jià)值的經(jīng)濟(jì)植物． 但三葉木通當(dāng)前開(kāi)發(fā)度不高， 并且因不合理的采伐， 其種質(zhì)資源遭到一定程度的破壞． 因此需要加強(qiáng)對(duì)三葉木通植物資源的保護(hù)力度， 進(jìn)行種質(zhì)資源的調(diào)查、 收集、 整理、 鑒定、 評(píng)價(jià)[4]． 但目前， 因?yàn)闆](méi)有官方推出的“三葉木通描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)”， 所以對(duì)三葉木通種質(zhì)資源的研究而言， 不論是前期種質(zhì)的鑒定、 評(píng)價(jià)， 還是后期針對(duì)目標(biāo)性狀的育種創(chuàng)新， 都會(huì)有所限制． 本研究在李秀華[23]制定的“三葉木通種質(zhì)資源特性描述規(guī)范表”的基礎(chǔ)上， 結(jié)合本研究供試材料的表型特征， 補(bǔ)充葉片質(zhì)地、 葉形、 葉色、 葉染病率、 果實(shí)數(shù)量、 坐果類型、 果染病率等性狀描述， 為“三葉木通描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)”的推出， 提供一定程度的參考依據(jù)．

對(duì)三葉木通種質(zhì)資源表型性狀進(jìn)行測(cè)定與分析， 10個(gè)數(shù)量性狀變異系數(shù)均大于10%． 李秀華[23]對(duì)73份三葉木通種質(zhì)16個(gè)數(shù)量性狀的研究結(jié)果表明， 葉片指標(biāo)變異較小， 遺傳比較穩(wěn)定． 本研究的葉柄長(zhǎng)、 頂葉寬是變異系數(shù)最高的2個(gè)數(shù)量性狀， 葉柄長(zhǎng)變異系數(shù)達(dá)41.4%， 表明本批種質(zhì)在葉片指標(biāo)上變異較為豐富． 9個(gè)質(zhì)量性狀的遺傳多樣性指數(shù)除葉片質(zhì)地外， 都大于1.00， 3個(gè)遺傳多樣性指數(shù)最大的是葉染病率、 果染病率和葉形． 結(jié)合數(shù)量性狀與質(zhì)量性狀多樣性的分析， 本研究供試種質(zhì)資源材料變異系數(shù)、 遺傳多樣性指數(shù)較高， 遺傳多樣性較豐富， 為三葉木通種質(zhì)創(chuàng)新育種的理想材料．

統(tǒng)計(jì)得到48對(duì)性狀極顯著相關(guān)， 由此可見(jiàn)， 確定目標(biāo)性狀后有針對(duì)性地對(duì)三葉木通種質(zhì)資源進(jìn)行評(píng)價(jià)篩選時(shí)， 要結(jié)合多種性狀指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)． 主成分分析將96份三葉木通種質(zhì)資源的19個(gè)表型性狀整合為4個(gè)主成分， 累積貢獻(xiàn)率達(dá)到64.714%． 第1-4主成分分別主要與果實(shí)性狀、 葉片長(zhǎng)寬、 葉片形態(tài)、 植株染病情況相關(guān)． 此4類主成分相關(guān)的主要性狀特征即為本研究供試材料表型多樣化的主要因素[25]． 結(jié)合相關(guān)性分析， 4個(gè)主成分的主要性狀， 彼此間是具有一定相關(guān)性， 在進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新育種工作期間， 可以利用本研究得到的4個(gè)主成分因子， 提升育種創(chuàng)新的效率．

聚類分析將96份三葉木通種質(zhì)資源劃分為3大類群． 第Ⅰ類群下的種質(zhì)特征為果實(shí)、 葉片較大， 第Ⅱ類為果實(shí)染病率較低， 或是比較有抗病能力的類群， 第Ⅲ類為無(wú)果實(shí)著生、 株型疏散類型． 各類群別特征明顯， 為不同育種目標(biāo)提供更有針對(duì)性的種質(zhì)基礎(chǔ)． 例如， 若是針對(duì)培育觀果的種質(zhì)， 可以在第Ⅰ類種質(zhì)中篩選； 若是注重果實(shí)品質(zhì)， 有助于果實(shí)的產(chǎn)量銷售等， 則在第Ⅱ類群體中； 若是作為藤本植物運(yùn)用于城市綠化中， 無(wú)果實(shí)著生的材料或更有利于城市環(huán)境(第Ⅲ類)． 聚類分析較好地將供試材料進(jìn)行區(qū)分與整理， 為其以后的創(chuàng)新利用提供依據(jù)．

本研究通過(guò)對(duì)96份三葉木通種質(zhì)資源19個(gè)表型性狀的調(diào)查觀測(cè)、 表型多樣性分析， 為“三葉木通種質(zhì)資源的描述規(guī)范與數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)”的制定提供一定的參考． 研究發(fā)現(xiàn)供試資源類型較豐富， 變異較大， 對(duì)豐富我國(guó)三葉木通資源種質(zhì)庫(kù)的多樣性和三葉木通優(yōu)質(zhì)種質(zhì)的選育具有較高價(jià)值． 但缺少對(duì)本批三葉木通種質(zhì)資源花、 種子相關(guān)性狀表型的觀測(cè)， 后續(xù)還應(yīng)加大力度完善； 表型性狀的觀測(cè)受外界環(huán)境的影響較大， 還應(yīng)進(jìn)行多年監(jiān)測(cè)以及結(jié)合分子標(biāo)記對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行更完整的遺傳多樣性評(píng)價(jià)．