納米銀避孕泡沫及各組分對(duì)精子活力影響的研究

葉如憲 陳大可

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)(浙江 杭州 310000);2.溫州市人民醫(yī)院(浙江 溫州 325000)

前 言

目前,納米材料廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域,包括工程、化學(xué)、醫(yī)學(xué)等[1]。 其中,納米銀制品由于其具有良好的殺菌效果,被廣泛加入到各種材料中。 如一些食物保鮮材料就是利用納米銀制成,從而達(dá)到食物保鮮的效果[2]。 同時(shí)其也被用于一些婦女保健產(chǎn)品中,周玉海[3]等研究表明納米銀治療萎縮性陰道炎效果顯著。而納米銀避孕泡沫是利用納米銀研制的新型避孕產(chǎn)品,其主要成分為納米銀顆粒、辛苯聚醇(ON-9)以及賦形劑(聚乙烯醇材料等)。 是一種具有避孕、抗菌、潤(rùn)滑三效合一的避孕產(chǎn)品[4]。 相關(guān)研究表明其避孕效果顯著,200 對(duì)育齡夫婦的避孕成功率為98.5%,效果受到受試者的認(rèn)可,大部分人愿意繼續(xù)使用[5]。 但是現(xiàn)階段的研究?jī)H局限于對(duì)納米銀避孕泡沫整體產(chǎn)品的避孕原理研究,而缺乏對(duì)其各組分的避孕作用的研究。 本研究擬通過(guò)探究納米銀避孕泡沫各組分及制劑對(duì)精子活力的影響,以深入了解其避孕機(jī)制,并為其功能效果的改善及相關(guān)避孕產(chǎn)品的研制提供基礎(chǔ)和新思路。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

(一)供試品

20ppm 納米銀溶液(上海滬正納米科技有限公司提供);1.2 辛苯醇醚(ON-9)原液(上海市西寶生物科技有限公司提供)、納米銀避孕泡沫劑原液(廣東同德藥業(yè)有限公司提供);賦形劑(上海市西寶生物科技有限公司提供);500ml 生理鹽水(江蘇四環(huán)生物制藥有限公司提供)

(二)試劑耗材

1.人精液標(biāo)本:9 份,選取有生育能力、禁欲7 天的男性精液,精子活動(dòng)率≥70%,前向運(yùn)動(dòng)精子≥25%,畸形≤20%。

2.大鼠精液標(biāo)本:美國(guó)斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley,SD)大鼠,3 只,雄性,250 ～300g,由上海市西普爾-比凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(滬)2013-0016。 取SD 雄性大鼠雙側(cè)附睪置于無(wú)菌小燒杯中,NS 沖洗后加Tyrode 液4ml,用解剖剪在附睪尾劃一十字形切口后,置37℃水浴箱孵育10 分鐘后,取一滴于玻片上,低倍鏡下(10×10)檢查精子活率,要求活動(dòng)率≥60%;符合條件后吸取0.1ml 加入裝有1.9ml精子稀釋液的小試管中,混勻,靜置3min,取一滴于計(jì)數(shù)板中,高倍鏡(10×40)下計(jì)數(shù)(方法:4 小格精子數(shù)×4×稀釋倍數(shù)(20 倍)×104),根據(jù)計(jì)數(shù)所測(cè)得的密度,加Tyrode液將精液稀釋到107/ml,置37℃水浴中待用。

3.精子稀釋液:取NaHCO33g,,甲醛1ml,加蒸餾水100ml 配制而成。

4. 精子營(yíng)養(yǎng)液(Tyrode 液):稱取NaCl 4. 0g,KCl 0.10g,CaCl20. 10g,MgCl2·6H2O 0. 05g,NaH2PO4·2H2O 0.025g,NaHCO30.50g,Glucose 0.50g,用雙蒸水分次溶解,配至1000ml,溶液配好后密閉,置4℃冰箱保存,實(shí)驗(yàn)前1 天配好。

(三)實(shí)驗(yàn)儀器

電子天平、生物顯微鏡、恒溫水浴箱、渦旋振蕩器,三通道計(jì)時(shí)器

二、實(shí)驗(yàn)方法(精子失活實(shí)驗(yàn))

(一)預(yù)實(shí)驗(yàn):將配制好的不同濃度的納米銀溶液、ON-9、納米銀泡沫劑、賦形劑、生理鹽水和陽(yáng)性對(duì)照組NP-9 分裝于Eppendorf 管并置37℃水浴中保溫待用。分別對(duì)大鼠及人精液進(jìn)行體外抑精試驗(yàn)。 參照Sander-Cramer 法,以全部精子失活為終點(diǎn),測(cè)出藥物在20s ～3min 內(nèi)的有效抑精濃度,根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,確定正式試驗(yàn)劑量和分組。

(二)正式試驗(yàn):根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們確定了正式試驗(yàn)受試品濃度。 具體將配制好的不同濃度的納米銀溶液(20ppm、10ppm、5ppm、2. 5ppm)、ON-9(250ppm、125ppm、62.5ppm)、納米銀泡沫劑(1 ∶8 稀釋、1 ∶32 稀釋、1 ∶64 稀釋、1 ∶128 稀釋、1 ∶256 稀釋)、賦形劑(原液、1 ∶2 稀釋、1 ∶4 稀釋、1 ∶8 稀釋)、生理鹽水和陽(yáng)性對(duì)照組NP-9 分裝于Eppendorf 管并置37℃水浴中保溫待用。 對(duì)大鼠精液及人體精液進(jìn)行體外精子失活試驗(yàn)。

(三)選擇納米銀、ON-9 和賦形劑20 秒完全抑制精子的濃度及以下2 個(gè)濃度,共3 個(gè)濃度,分別觀察并計(jì)算1min 時(shí)納米銀、ON-9 和賦形劑抑制對(duì)大鼠精子活力的抑制率(%)。

(四)參考上述納米銀避孕泡沫各組分有效抑精濃度和作用時(shí)間點(diǎn),將配制好的20s 不能完全抑制大鼠及人精子活力的納米銀溶液10ppm、ON-9 125ppm 和1 ∶8 稀釋比賦形劑按1 ∶1 ∶1 混合后與大鼠精液作用,觀察其在20s ～3min 內(nèi)是否能完全抑制精子活力及作用時(shí)間點(diǎn)。

三、統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果利用SPSS 進(jìn)行統(tǒng)計(jì),數(shù)據(jù)描述采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

一、納米銀避孕泡沫各組分精子體外抑精藥效學(xué)研究

(一)納米銀避孕泡沫各組分對(duì)大鼠精子體外抑精藥效學(xué)研究

納米銀20ppm 體外20 秒內(nèi)可以將大鼠精子全部抑制失活,10ppm 在2min 時(shí)可以將大鼠精子全部抑制失活,5ppm 則在3min 中內(nèi)可以將大鼠精子全部抑制失活;ON-9 250ppm 體外20s 內(nèi)可以將大鼠精子全部抑制失活,125ppm 在2min 時(shí)可以將大鼠精子全部抑制失活,62.5ppm則在3min 中內(nèi)可以將大鼠精子全部抑制失活,賦形劑原液、1 ∶2 稀釋及1 ∶4 稀釋劑量體外20 秒內(nèi)可以將大鼠精子全部抑制失活,1 ∶8 稀釋劑量則在2min 內(nèi)可以將大鼠精子全部抑制失活。 具體見(jiàn)表1。

表1 納米銀避孕泡沫各組分對(duì)大鼠精子的體外有效抑精濃度和時(shí)效關(guān)系

表1 納米銀避孕泡沫各組分對(duì)大鼠及人精子的體外有效抑精濃度和時(shí)效關(guān)系

(二)納米銀避孕泡沫各組分對(duì)人精子體外抑精藥效學(xué)研究

納米銀20ppm 體外20s 內(nèi)可以將人精子全部抑制失活,10ppm 在1min 時(shí)可以將人精子全部抑制失活,5ppm 則在3min 中內(nèi)可以將人精子全部抑制失活;ON-9 250ppm 體外20s 內(nèi)可以將人精子全部抑制失活,125ppm 在1min 時(shí)可以將人精子全部抑制失活,62.5ppm則在3min 中內(nèi)可以將人精子全部抑制失活,賦形劑原液、1 ∶2 稀釋及1 ∶4 稀釋劑量體外20s 內(nèi)可以將人精子全部抑制失活,1 ∶8 稀釋劑量則在2min 內(nèi)可以將人精子全部抑制失活。 這一結(jié)果與大鼠抑精活性結(jié)果類似。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 納米銀避孕泡沫各組分對(duì)人精子的體外有效抑精濃度和時(shí)效關(guān)系(續(xù)前頁(yè))

表2 納米銀避孕泡沫各組分對(duì)人精子的體外有效抑精濃度和時(shí)效關(guān)系

二、納米銀、ON-9 和賦形劑對(duì)大鼠精子抑制率

參考前面納米銀避孕泡沫各組分抑精有效濃度,我們選擇20 秒能完全抑制精子的有效濃度及以下2個(gè)濃度(倍比稀釋),共3 個(gè)濃度,進(jìn)行了加藥1min 時(shí)納米銀、ON-9和賦形劑抑制對(duì)大鼠精子活力的抑制率(%)實(shí)驗(yàn),結(jié)果納米銀20ppm、ON-9 250ppm 和賦形劑1 ∶4 稀釋在20s 內(nèi)對(duì)精子活力的抑制率均為100%,三者各自濃度以下倍比稀釋劑量對(duì)大鼠精子活力抑制率相應(yīng)呈遞減趨勢(shì),有明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系。 詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 納米銀避孕泡沫各組分不同濃度精子活力抑制率(%)

三、納米銀避孕泡沫各組分混合后對(duì)精子作用的失活實(shí)驗(yàn)

(一)納米銀避孕泡沫各組分混合后對(duì)大鼠精子作用的失活實(shí)驗(yàn)

納米銀溶液10ppm、ON-9 125ppm 和1 ∶8 稀釋比賦形劑按1 ∶1 ∶1 等比例混合并與大鼠精液作用后,可在20s 內(nèi)將大鼠精子全部失活,具體見(jiàn)表4。

表4 納米銀避孕泡沫各組分復(fù)方對(duì)大鼠精子的體外有效抑精濃度和時(shí)效關(guān)系

(二)納米銀避孕泡沫各組分混合后對(duì)人精子作用的失活實(shí)驗(yàn)

納米銀溶液10ppm、ON-9 125ppm 和1 ∶8 稀釋比賦形劑按1 ∶1 ∶1 三者等比例混合并與人精液作用后,可在20s 內(nèi)將人精子全部失活,具體見(jiàn)表5。

表5 納米銀避孕泡沫各組分復(fù)方對(duì)人精子的體外有效抑精濃度和時(shí)效關(guān)系

討 論

當(dāng)前避孕方法種類多樣,例如口服避孕藥、宮內(nèi)節(jié)育器及避孕套等。 但不可否認(rèn)的是這些避孕方法都有各自的缺陷。 以宮內(nèi)節(jié)育器為例,性生活體位不正或是患有盆腔炎的婦女,很可能會(huì)引發(fā)性交痛,少數(shù)婦女還會(huì)出現(xiàn)經(jīng)期延長(zhǎng)和經(jīng)血增多的情況[6]。 納米銀是一種陰道內(nèi)的新型避孕藥具,以乳白色的膨脹泡沫附著于陰道粘膜和子宮穹窿的方式來(lái)進(jìn)行避孕[7]。 但是目前對(duì)于該款避孕泡沫的避孕機(jī)制的研究還比較少,本研究擬對(duì)納米銀避孕泡沫進(jìn)行組分分解,利用各組分及其聯(lián)合作用對(duì)大鼠及人精子活力的影響以探究其深層的避孕機(jī)制,為未來(lái)產(chǎn)品改良或其他避孕產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供一定的思路。

我們的研究結(jié)果提示,不管是作用于大鼠精子還是人精子,納米銀避孕泡沫及其各組分對(duì)精子具有滅活作用。 而且由我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示各組分對(duì)精子的殺傷作用隨著各組分濃度的升高而增強(qiáng),這與之前的相關(guān)研究結(jié)果類似,Yoisungnern[8]等發(fā)現(xiàn)納米銀可以明顯抑制小鼠精子的生活力,且呈劑量應(yīng)關(guān)系。 其可以誘發(fā)細(xì)胞凋亡、壞死、DNA 鏈斷裂等[9]。 壬苯醇醚也對(duì)兔、狗、猴及人精子均有殺傷作用[10]。 在我們的實(shí)驗(yàn)中,賦形劑對(duì)體外精子也有一定的殺傷作用,這是在之前的研究中未曾涉及的。 而且上述三種組分在1 ∶1 ∶1的配比下,對(duì)精子殺傷具有協(xié)同相加作用,這為未來(lái)如何調(diào)整避孕泡沫的成分配比以加強(qiáng)其避孕效果提供了新的思路與方向。

本次實(shí)驗(yàn)以藥效學(xué)為主,在納米銀避孕泡沫避孕機(jī)制方面,我們從以下幾點(diǎn)進(jìn)行研究。 納米銀主要通過(guò)抑制精子頂體酶活性,降低精子活力和穿透能力,改變精子形態(tài)來(lái)發(fā)揮殺精避孕的作用。 納米銀避孕泡沫各組分單獨(dú)應(yīng)用對(duì)人精子頂體蛋白酶活性,影響精子尾部膨脹率等(精子膜完整性指標(biāo))均有抑制作用,尤其對(duì)精子頂體蛋白酶的活性影響更為明顯。 頂體蛋白酶位于精子的頭部,它是一種絲氨酸蛋白溶解酶,當(dāng)精子與卵子的透明帶結(jié)合時(shí),頂體酶將活化為二者的結(jié)合提供能量,而納米銀則可以抑制頂體蛋白酶的活性,從而阻止精子與透明帶的結(jié)合,達(dá)到避孕的效果。 通過(guò)進(jìn)一步的研究,將納米銀泡沫各組分混合應(yīng)用后則可以起到協(xié)同的作用,更好的抑制人精子頂體蛋白酶活性,影響精子尾部膨脹率等,從而達(dá)到更高效、更安全的避孕效果;然而,作為精子能量代謝重要物質(zhì)的乳酸脫氫酶,納米銀各組分及混合應(yīng)用后對(duì)人精子乳酸脫氫酶活性則未見(jiàn)明顯抑制作用。 納米銀避孕泡沫成分復(fù)雜,在未來(lái)可以探索其可能涉及的其他避孕機(jī)制,豐富人們對(duì)其認(rèn)識(shí),從而正確開(kāi)發(fā)、對(duì)待與使用避孕產(chǎn)品。

結(jié) 論

納米銀避孕泡沫各組分(納米銀、ON-9 和賦形劑)單獨(dú)使用均具有明顯抑精活性,且三種成分混合具有協(xié)同相加作用。