藍刺頭中總黃酮的含量測定

羅愛勤 曹穎男 鐘春燕

廣州新華學院，廣東廣州 510520

藍刺頭是菊科植物藍刺頭（Echinops LatifoliusTausch.）的干燥頭狀花序[1]，收載在《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準蒙藥分冊》[2]中，蒙藥名為扎日阿-烏拉；其藥性苦、稀、輕、柔、鈍、涼，可固骨質、接骨愈傷、清熱止痛，用于骨折、骨熱、刺痛癥、瘡瘍[3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，藍刺頭能顯著改善PMOP大鼠氧化應激狀態(tài)；可交叉調控FoxO/Wnt/β-catenin通路，抑制氧化應激FoxO轉錄，上調Wnt表達,促進模型鼠骨成骨分化、骨形成[4]。蒙藥藍刺頭的化學成分主要包括生物堿類、黃酮類和三萜類等[5]，有多篇文獻報道從藍刺頭中分離出黃酮類化合物，主要為芹菜素及其苷類化合物[5-7]。劉巖等[8]研究發(fā)現(xiàn)藍刺頭總黃酮可通過類雌激素樣作用，降低血清BGP水平，上調去卵巢大鼠ERα和ERβ的表達，從而促進骨形成，調節(jié)骨吸收與骨形成的耦聯(lián)，降低骨轉換率，減少骨丟失，可有效防治絕經后骨質疏松癥。藍刺頭質量標準中僅有性狀鑒別、性味、功能主治、用法用量和貯藏項目，沒有指標成分的含量測定項，本課題擬建立一個適合藍刺頭總黃酮的含量測定方法，為評價藍刺頭藥材質量提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

BS210S型電子天平（德國Sartorius）、Agilent8453-E紫外分光光度計（美國）、KQ-400GKDV超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）

1.2 試藥

芹菜苷標準品（上海銘博生物科技有限公司，批號B200823，≥98.0%），藍刺頭藥材（保定仙德中藥銷售公司，批號191011、191101、191201），其他試藥均為分析純，純化水。

2 方法與結果

2.1 標準品溶液的制備

取芹菜苷標準品適量，精密稱定，置100 ml量瓶中，加60%乙醇制備成每毫升含芹菜苷0.30 mg的溶液，即得。

2.2 供試品溶液的制備

取藍刺頭藥材（批號191101），粉碎使通過60目篩，再取藥材粉末1 g，精密稱定，置錐形瓶中，加入60%乙醇100 ml，稱定重量，超聲提取1.5 h，放冷，補足損失重量，濾過，收集濾液，即得。

2.3 顯色劑和測定波長確定

取芹菜苷標準品溶液0.1 ml和供試品溶液0.5 ml，分別加入5%三氯化鋁溶液3.0 ml反應15 min后，按照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則0401紫外-可見分光光度法（UV-Vis）[9]，于200～600 nm波長范圍內進行光譜測定，見圖1～2。

圖1 芹菜苷標準溶液UV-Vis圖

圖2 供試品溶液UV-Vis圖

從圖1～2中可看出，芹菜苷標準品和供試品與5%三氯化鋁溶液反應后，在吸收帶Ⅱ中有一波長為275±2 nm的共同吸收峰，因此確定5%三氯化鋁溶液為顯色劑，275 nm為測定波長。

2.4 線性關系考察

取芹菜苷標準品溶液，精密吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml，分別置10 ml量瓶中，加5%三氯化鋁溶液3 ml，再加60%乙醇至刻度，搖勻，放置30 min，在275 nm波長處進行吸光度測定，以吸光度為縱坐標，芹菜苷質量濃度為橫坐標，進行線性回歸分析，得回歸方程為Y=0.0357X-0.0065（r=0.9999），芹菜苷質量濃度在3.28～32.80 μg/ml范圍內與吸光度值呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗

取芹菜苷標準品溶液，精密量取0.3 ml，按照2.3項下的線性關系考察條件進行測定，連續(xù)測6次，得到標準溶液吸光度值分別為0.3433、0.3475、0.3479、0.3460、0.3466、0.3468，相對標準偏差（RSD）為0.473%，表明本測定法精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液分別于顯色后30、45、60、75、90、120 min進行測定，測得吸光度值分別為0.4425、0.4413、0.4400、0.4389、0.4379、0.4228，RSD為1.660%，表明供試品溶液中總黃酮顯色后在2 h內穩(wěn)定性良好。

2.7 重復性試驗

取藍刺頭藥材（批號191101）6份，每份約1 g，精密稱定，按照2.2項下的方法制備樣品溶液，精密吸取樣品溶液0.5 ml置10 ml量瓶中，測定吸光度，代入回歸方程計算樣品溶液中總黃酮的質量濃度，供試品溶液中總黃酮的質量濃度（μg/ml）=（吸光度值+0.0065）/0.0357；再計算藥材中總黃酮的含量（含量%=供試品溶液中總黃酮的質量濃度×10-6×稀釋倍數(shù)/取樣量×100%；稀釋倍數(shù)=10×100 ml/0.5 ml=2000），見表1。

從表1結果可知，藍刺頭藥材的總黃酮平均含量為2.33%，RSD=0.956%（n=6），表明本法具有良好的重復性。

表1 重復性試驗結果

2.8 準確度試驗

采用加樣回收法，取藍刺頭藥材（批號191101）6份，每份約0.6 g，精密稱定，準確加入芹菜苷溶液1 ml（13.00 mg/ml），按照2.2項下的方法制備樣品溶液，精密吸取樣品溶液0.5 ml進行測定，計算實測量和回收率，見表2。

從表2結果可知，本法所測得的回收率均為95%～105%，RSD=0.923%，符合考察要求。

表2 準確度試驗結果

2.9 總黃酮含量測定

取藍刺頭藥材（批號191011、191101、191201），分別按2.2項下的方法制備樣品溶液，精密吸取樣品溶液0.5 ml置10 ml量瓶中，測定吸光度，計算藥材中總黃酮的含量，見表3。

從表3結果可知，本法測定3批藍刺頭藥材中總黃酮的平均含量為2.30%，3批藍刺頭藥材的總黃酮含量較接近。

表3 3批藍刺頭藥材中總黃酮的含量

3 討論

具有3’，4’-鄰二酚羥基的黃酮類化合物，能與亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉試劑反應產生紅色物質，并在500 nm處有吸收，但該法專屬性不強[10]，因為含鄰二酚羥基的非黃酮類物質，如綠原酸、咖啡酸、原兒茶醛等[11]也呈陽性反應，而不具有鄰二酚羥基的黃酮類物質則不能被測定出來。芹菜素及其苷類化合物是5，7，4’-三羥基黃酮類化合物，結構中無鄰二羥基，與亞硝酸鈉、硝酸鋁和氫氧化鈉試劑反應無紅色物質產生，在500 nm處也無吸收。目前有文獻[12-14]報道，采用三氯化鋁比色法測定植物中的總黃酮含量，主要因為此法在誤差范圍內準確度較高，對黃酮類化合物的專屬性較強，顯色反應時黃酮類物質反應較強，而色素、酚酸等非黃酮類物質的反應極弱。

芹菜苷結構中的5-羥基、4-羰基，能與5%三氯化鋁溶液反應產生在紫外光275±2 nm處有吸收的絡合物[15]，本研究利用此原理建立測定法測得藍刺頭藥材中總黃酮含量約為2.30%，與李爽等[16]研究檢測結果23.57 mg/g和舒合拉·朱馬別克等[17]研究檢測結果26.65 mg/g基本一致。本測定法經方法學驗證重復性、精密度、穩(wěn)定性和準確度較好，且操作簡便、快捷，成本低，有一定實用價值，值得推廣，但是紫外-可見分光光度法也有不足之處，僅適用于微量分析，對于高濃度物質，吸光度和濃度之間的關系會發(fā)生偏離。以HPLC法測定幾個主要黃酮成分的含量，能更精準地評價和反映中藥材中總黃酮的質量[18]，本項目課題目前也在進一步開展HPLC法測定黃酮成分的研究。