花旗松素對高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞炎癥損傷的影響及其機(jī)制▲

陳 靜 張 進(jìn)

(1 寶雞職業(yè)技術(shù)學(xué)院教務(wù)處，陜西省寶雞市 721003； 2 寶雞市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，陜西省寶雞市 721000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常見的并發(fā)癥之一，有30%～40%的糖尿病患者最終會發(fā)展為DN[1]。腎小管上皮細(xì)胞損傷是DN的主要特征之一，高血糖可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡并誘發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腎小管損傷[2]。因此，減輕高糖誘發(fā)的腎小管上皮細(xì)胞損傷可能是阻斷DN進(jìn)展的有效策略?；ㄆ焖伤厥菑乃煽浦参镏刑崛〉纳镱慄S酮，具有抗菌、消炎、抗氧化、抗癌等作用[3]。最近研究表明，花旗松素可通過抑制促炎細(xì)胞因子的分泌減少破骨細(xì)胞的生成，對骨質(zhì)疏松具有潛在的治療作用[4]。此外，花旗松素還可以預(yù)防甲醇暴露引起的大鼠視神經(jīng)氧化損傷和炎癥損傷[5]。然而，有關(guān)花旗松素對高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞炎癥損傷的改善作用的研究仍較少。環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類具有穩(wěn)定共價閉合環(huán)的內(nèi)源性非編碼RNA，對糖尿病及其并發(fā)癥進(jìn)展具有重要的調(diào)節(jié)作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)，circRNA circ_0001445在氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)circ_0001445可抑制ox-LDL誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，并抑制細(xì)胞凋亡[7]。但circ_0001445是否與高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞損傷相關(guān)并不清楚。本研究觀察花旗松素對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡及其分泌炎癥因子水平的影響，并基于circ_0001445探討該藥的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人腎小管上皮細(xì)胞購自美國ATCC公司(批號：20190201)；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒、TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司(批號：20181225、20181109)；花旗松素(純度98.9%)購自中國食品藥品檢定研究院(批號：111816-201102)；circ_0001445過表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA-circ_0001445)、質(zhì)粒空載體(pcDNA)、circ_0001445小干擾RNA(si-circ_0001445)、小干擾RNA陰性對照(si-NC)均購自上海吉凱基因公司(批號：20190103、2019106、2019108、2019110)；Annexin Ⅴ-FITC/碘化丙啶凋亡檢測試劑盒購自上海翊圣生物公司(批號：20181114)；人白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)ELISA試劑盒、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA試劑盒、GAPDH兔源多克隆抗體、活化型Caspase(cleaved Caspase)-3兔單克隆抗體、cleaved Caspase-9兔多克隆抗體均購自美國Abcam公司(批號：20181214、20181115、20181005、20180926、20181117)；RIPA緩沖液購自上海遠(yuǎn)慕生物公司(批號：20181016)；化學(xué)發(fā)光試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司(批號：20181203)；PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix EX Taq試劑盒均購自日本Takara公司(批號：20190102、20190113)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組：采用添加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素的DMEM-F12，并置于含5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞，細(xì)胞融合度為80%時采用胰酶消化，按1 ∶3比例傳代培養(yǎng)。將對數(shù)期腎小管上皮細(xì)胞以5×105個/孔接種在6孔板中過夜，利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將2 μg pcDNA、2 μg pcDNA-circ_0001445、2 μg si-NC、2 μg si-circ_0001445分別轉(zhuǎn)染融合度為60%的腎小管上皮細(xì)胞，培養(yǎng)6 h后更換為含血清的培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染48 h時采用實(shí)時熒光定量PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。

將未經(jīng)轉(zhuǎn)染的腎小管上皮細(xì)胞分為5組，包括Con組、HG組、HG+花旗松素-L組、HG+花旗松素-M組、HG+花旗松素-H組。Con組采用含5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM-F12培養(yǎng)液孵育腎小管上皮細(xì)胞，作為一般對照組；HG組采用含25 mmol/L葡萄糖的DMEM-F12培養(yǎng)液孵育腎小管上皮細(xì)胞[8]，作為高糖對照組；HG+花旗松素-L組、HG+花旗松素-M組、HG+花旗松素-H組分別采用含1 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L的花旗松素加25 mmol/L葡萄糖的DMEM-F12培養(yǎng)液孵育腎小管上皮細(xì)胞[9]，作為治療低、中、高劑量花旗松素組。培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

另外，再將經(jīng)過轉(zhuǎn)染的腎小管上皮細(xì)胞分為4組，包括HG+pcDNA組、HG+pcDNA-circ_0001445組、HG+花旗松素+si-NC組、HG+花旗松素+si-circ_0001445組。HG+pcDNA組、HG+pcDNA-circ_0001445組分別采用含25 mmol/L葡萄糖的DMEM-F12培養(yǎng)液孵育經(jīng)轉(zhuǎn)染的腎小管上皮細(xì)胞；HG+花旗松素+si-NC組、HG+花旗松素+si-circ_0001445組分別采用含100 μmol/L花旗松素和含25 mmol/L葡萄糖的DMEM-F12培養(yǎng)液孵育經(jīng)轉(zhuǎn)染的腎小管上皮細(xì)胞。培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測腎小管上皮細(xì)胞凋亡率：采用冰冷的PBS洗滌1.2.1中各組腎小管上皮細(xì)胞1次，用500 μL結(jié)合緩沖液(含5 μL Annexin Ⅴ-FITC和5 μL 碘化丙啶)室溫避光染色20 min，然后采用FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國Beckman Coulter公司)檢測細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=[Annexin Ⅴ(+)碘化丙啶(-)細(xì)胞數(shù)量+Annexin Ⅴ(+)碘化丙啶(+)細(xì)胞數(shù)量]/所有細(xì)胞數(shù)量。每組設(shè)置3個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 ELISA檢測IL-6和TNF-α水平:1.2.1中各組腎小管上皮細(xì)胞處理完畢后，收集細(xì)胞培養(yǎng)的上清液，檢測其IL-6和TNF-α水平，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 Western blot檢測cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)量：將1.2.1中各組腎小管上皮細(xì)胞置于冰上，加入RIPA緩沖液裂解細(xì)胞。將適量蛋白與等體積1×上樣緩沖液混合100 ℃孵育3 min使蛋白變性。每孔中加入30 μg蛋白樣品，進(jìn)行SDS-PAGEA，采用濕式轉(zhuǎn)膜裝置將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用封閉緩沖液室溫孵育2 h。用特異性一抗溶液(cleaved Caspase-3為1 ∶1 000，cleaved Caspase-9為1 ∶1 000，GAPDH為1 ∶2 500)4 ℃搖床孵育過夜。TBST洗膜3次，10 min/次，37 ℃下用二抗溶液(1 ∶1 000)孵育膜1 h，TBST洗膜3次，10 min/次。以GAPDH為內(nèi)參，用化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測免疫條帶，采用ImageJ軟件檢測灰度值,以目的蛋白與內(nèi)參的灰度值比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量。每組設(shè)置3個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 實(shí)時熒光定量PCR檢測circ_0001445表達(dá)水平：使用TRIzol試劑提取1.2.1中各組腎小管上皮細(xì)胞總RNA，使用分光光度計(jì)對獲得的RNA樣品的濃度和純度進(jìn)行定量。濃度和純度合格后，利用PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA樣本反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再用SYBR Premix EX Taq試劑盒進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR。反應(yīng)體系為10×PCR Buffer 2.5 μL，MgSO42.5 μL，dNTPs 2.5 μL，正反向引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，RNase-Free ddH2O補(bǔ)足體系至25 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，63.3 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s。變性、退火和延伸步驟重復(fù)40個循環(huán)。以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參對照，2-ΔΔCt法計(jì)算circ_0001445相對表達(dá)量。circ_0001445上游引物5′-CAAGATGGGCGAAAGTTCACT-3′，下游引物5′-TGTGTTGCTCCATGTCTAATCATT-3′；GAPDH上游引物5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游引物5′-GCAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′。每組設(shè)置3個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用(x±s)表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 花旗松素對高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞凋亡及cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)量的影響 與Con組比較，HG組腎小管上皮細(xì)胞的凋亡率、cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)量均升高(均P<0.05)；與HG組比較，HG+花旗松素-L組、HG+花旗松素-M組、HG+花旗松素-H組腎小管上皮細(xì)胞的凋亡率、cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)量均降低(均P<0.05)，腎小管上皮細(xì)胞的凋亡率、cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)量由高到低均為HG+花旗松素-L組、HG+花旗松素-M組、HG+花旗松素-H組(均P<0.05)。見圖1和表1。

圖1 花旗松素對高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞凋亡及cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)量的影響注：圖A為蛋白條帶圖；圖B為細(xì)胞凋亡流式圖。

表1 各組細(xì)胞凋亡率及cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9蛋白相對表達(dá)量的比較(x±s)

2.2 花旗松素對高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞炎癥因子水平的影響 與Con組比較，HG組腎小管上皮細(xì)胞的IL-6和TNF-α水平均增加(均P<0.05)；與HG組比較，HG+花旗松素-L組、HG+花旗松素-M組、HG+花旗松素-H組腎小管上皮細(xì)胞的IL-6和TNF-α水平均下降(均P<0.05)，腎小管上皮細(xì)胞的IL-6和TNF-α水平由高到低均為HG+花旗松素-L組、HG+花旗松素-M組、HG+花旗松素-H組(均P<0.05)。見表2。

表2 各組細(xì)胞IL-6和TNF-α水平的比較(x±s，pg/mL)

2.3 花旗松素對高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞circ_0001445表達(dá)的影響 與Con組比較，HG組腎小管上皮細(xì)胞的circ_0001445表達(dá)量降低(P<0.05)；與HG組比較，HG+花旗松素-L組、HG+花旗松素-M組、HG+花旗松素-H組腎小管上皮細(xì)胞的circ_0001445表達(dá)量均升高(P<0.05)，腎小管上皮細(xì)胞circ_0001445相對表達(dá)量由低到高為HG+花旗松素-L組、HG+花旗松素-M組、HG+花旗松素-H組(均P<0.05)。見表3。

表3 各組細(xì)胞circ_0001445相對表達(dá)量的比較(x±s)

2.4 circ_0001445過表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞凋亡和炎癥因子水平的影響 與HG+pcDNA組比較，HG+pcDNA-circ_0001445組腎小管上皮細(xì)胞circ_0001445表達(dá)量升高，細(xì)胞凋亡率、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)量、cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)量、IL-6和TNF-α水平均降低(均P<0.05)。見圖2和表4。

圖2 circ_0001445過表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響注：圖A為蛋白條帶圖；圖B為細(xì)胞凋亡流式圖。

2.5 干擾circ_0001445表達(dá)后花旗松素對高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞凋亡、相關(guān)蛋白表達(dá)及炎癥因子水平的影響 與HG+花旗松素+si-NC組比較，HG+花旗松素+si-circ_0001445組腎小管上皮細(xì)胞circ_0001445表達(dá)量降低，細(xì)胞凋亡率、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)量、cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)量、IL-6和TNF-α水平均升高(均P<0.05)。見圖3和表5。

圖3 干擾circ_0001445表達(dá)后花旗松素對高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響注：圖A為蛋白條帶圖；圖B為細(xì)胞凋亡流式圖。

表5 各組細(xì)胞凋亡、相關(guān)蛋白相對表達(dá)量及炎癥因子水平的比較(x±s)

3 討 論

花旗松素已被證實(shí)在多種類型損傷模型中可發(fā)揮保護(hù)作用。例如葉艷瓊等[10]研究發(fā)現(xiàn)，花旗松素可抑制炎性小體表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞凋亡，保護(hù)心肌細(xì)胞免受氧化損傷；Tang等[11]的研究表明，花旗松素可調(diào)節(jié)缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少心肌細(xì)胞凋亡，并能改善大鼠的心功能；Turovskaya等[12]的研究證實(shí)花旗松素通過上調(diào)抗凋亡相關(guān)基因、抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)，下調(diào)促炎因子的表達(dá)，進(jìn)而抑制糖氧剝奪誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞損傷。而花旗松素是否對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎癥損傷具有改善作用鮮見報告。

高血糖刺激可導(dǎo)致過量活性氧生成和氧化應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡[13]；此外，高血糖刺激還導(dǎo)致促炎性因子分泌增加，這些炎癥因子可直接損傷腎小管上皮細(xì)胞[14]。本研究中，高糖干預(yù)后腎小管上皮細(xì)胞凋亡率、促炎因子IL-6和TNF-α水平、促凋亡蛋白cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9表達(dá)量均增加，而花旗松素可明顯抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡和炎癥因子的表達(dá)，并可下調(diào)促凋亡蛋白cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9的表達(dá)，這表明花旗松素對高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥損傷具有改善作用，且其作用呈一定的劑量依賴性。

circRNA是由其前體RNA反向剪切形成的非編碼RNA，其通過調(diào)控炎癥、凋亡、自噬、細(xì)胞增殖等過程參與DN的發(fā)病機(jī)制[15]。研究發(fā)現(xiàn)，circ_0000285在DN小鼠模型腎組織、高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞中的表達(dá)顯著升高，抑制circ_0000285可上調(diào)miR-654-3p進(jìn)而減輕高糖誘導(dǎo)的炎癥損傷[16]。還有研究表明，circACTR2參與高糖誘導(dǎo)的近端腎小管上皮細(xì)胞焦亡、炎癥和纖維化[17]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，circ_0001445在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者血漿中表達(dá)降低，而抗骨質(zhì)疏松治療后血漿中circ_0001445表達(dá)明顯上調(diào)，血漿circ_0001445是潛在的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥診斷標(biāo)志物[18]。此外，肝癌、宮頸癌等腫瘤中circ_0001445表達(dá)下調(diào)，恢復(fù)其表達(dá)能夠抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[19-20]。本研究中，高糖干預(yù)后腎小管上皮細(xì)胞中circ_0001445表達(dá)量降低，而花旗松素可顯著上調(diào)細(xì)胞中circ_0001445的相對表達(dá)量，這提示circ_0001445表達(dá)增加可能是花旗松素對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷發(fā)揮改善作用的重要因素。本研究結(jié)果還顯示，通過轉(zhuǎn)染pcDNA-circ_0001445過表達(dá)circ_0001445，可顯著抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡和炎癥因子的表達(dá)，并降低cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9蛋白的表達(dá)，這與花旗松素的保護(hù)效果類似，提示circ_0001445可能介導(dǎo)花旗松素對高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。本研究結(jié)果還顯示，通過轉(zhuǎn)染si-circ_0001445干擾circ_0001445表達(dá)，可明顯減弱花旗松素對高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡、炎癥因子分泌、cleaved Caspase-3，cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)的影響，這進(jìn)一步證實(shí)花旗松素通過上調(diào)circ_0001445表達(dá)，從而抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。

綜上所述，花旗松素可呈劑量依賴性地減輕高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞凋亡和炎癥因子表達(dá)，其機(jī)制可能為通過上調(diào)circ_0001445表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。這初步揭示了花旗松素抑制高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞炎癥損傷的作用機(jī)制，為花旗松素治療DN提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。