慢傳輸型便秘動物模型構(gòu)建方法的研究進(jìn)展▲

范明明 林 偉 韓海瑞 張嘉裕 王 順

(黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院,黑龍江省哈爾濱市 150000)

【提要】 慢傳輸型便秘是一種常見的功能性便秘，腸道傳輸功能受阻、腸內(nèi)容物阻滯、傳輸時間延長為其疾病特點(diǎn)，其發(fā)病機(jī)理目前尚未完全明確，需要借助穩(wěn)定可靠的動物模型進(jìn)行深入研究。近年來有學(xué)者通過單因素、雙因素、復(fù)合因素等方法成功制備大鼠、小鼠等慢傳輸型便秘動物模型。本文對近年來慢傳輸型便秘動物模型的常用構(gòu)建方法的相關(guān)研究進(jìn)行綜述。

功能性便秘是一類需要排除器質(zhì)性腸道病變、全身系統(tǒng)性疾病及藥物引起繼發(fā)性便秘的常見功能性腸病，臨床表現(xiàn)以排便困難、排便不暢、排便時間延長或排便次數(shù)減少為主，且不滿足腸易激綜合征的診斷標(biāo)準(zhǔn)。臨床上功能性便秘可分為慢傳輸型便秘(slow transit constipation,STC)、出口梗阻型便秘和混合型便秘。STC是功能性便秘中發(fā)病率較高的便秘類型，又稱結(jié)腸無力[1]，主要以結(jié)腸蠕動能力減弱、傳輸能力下降、傳導(dǎo)時間延長為特點(diǎn)[2]；臨床表現(xiàn)主要有排便顯著困難、排便次數(shù)明顯減少、便意感減弱或消失伴腹脹、病情反復(fù)發(fā)作等[3]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國功能性便秘患病率約為3.8%[4]，STC患者占功能性便秘患者的 45.5%[5]。目前，STC 的病理生理機(jī)制尚未完全清楚，治療方法尚未形成統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，且療效欠佳，患者病情易反復(fù)，可不同程度地降低患者的生活質(zhì)量。有研究表明，STC患病率隨年齡的增長而升高[6]，輕者伴有焦慮、抑郁等癥狀[7]，重者常可出現(xiàn)急性腸梗阻、腸壞死穿孔、心腦血管疾病等[8]，該病已經(jīng)成為嚴(yán)重影響人們?nèi)粘Ｉ畹南到y(tǒng)疾病之一。

根據(jù)STC的臨床特點(diǎn)，中醫(yī)學(xué)將其歸屬為“便秘”?！端貑枴吩啤按竽c者，傳道之官，變化出焉”，飲食入胃，經(jīng)脾胃運(yùn)化、小腸泌別清濁，糟粕下輸大腸而形成大便。若平日喜食辛辣、酒及厚味，日久腸胃積熱,傷津耗氣；平素情志抑郁善嘆息，久則氣機(jī)郁滯，大腸傳導(dǎo)無力；素體虛弱，或病后、產(chǎn)后及年老體虛之人，陰虛內(nèi)燥，血虛不潤，陽虛不煦，腸道濡養(yǎng)溫煦不足，日久大便艱澀難下[9]。該病病位在大腸，與肺肝脾腎密切相關(guān)。中醫(yī)藥治療STC具有耐受性好、療效可靠、副作用小等優(yōu)點(diǎn)。為明確中醫(yī)藥治療STC的機(jī)制，需要運(yùn)用西藥聯(lián)合中醫(yī)證候因素建立穩(wěn)定可靠的中醫(yī)證候STC模型。本文分別從西醫(yī)、中醫(yī)的角度對近年來采用單因素、雙因素、復(fù)合因素等方法建立STC模型的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 單因素造模方法

1.1 洛哌丁胺法 外周阿片受體激動劑洛哌丁胺可減慢胃腸蠕動，延長腸內(nèi)容物排出時間，上調(diào)大鼠結(jié)腸黏膜水通道蛋白4、水通道蛋白8的表達(dá)水平，促進(jìn)腸腔內(nèi)水的吸收，且不易透過血腦屏障而無明顯抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用。鄭舒澤等[10]以濃度為0.6 mg/mL的鹽酸洛哌丁胺按10 mL/(kg·d)的劑量給予小鼠灌胃，2次/d，連續(xù)給藥7 d后，小鼠出現(xiàn)首粒黑便排出時間延長、排便粒數(shù)減少等表現(xiàn)，小鼠結(jié)腸黏膜層上皮細(xì)胞破損或缺失，杯狀細(xì)胞減少，固有層及黏膜下層輕度炎性細(xì)胞浸潤，肌層明顯變薄，提示造模成功。此法所建立的STC模型穩(wěn)定可靠且安全，不易造成動物死亡。

1.2 復(fù)方地芬諾酯或復(fù)方苯乙哌啶法 復(fù)方地芬諾酯與復(fù)方苯乙哌啶均由鹽酸地芬諾酯和硫酸阿托品按比例混合而成,可興奮胃腸道平滑肌,減弱結(jié)腸蠕動,延遲腸內(nèi)糞便排出,促進(jìn)腸內(nèi)水吸收,減少腺體分泌,起到止瀉作用,且可導(dǎo)致便秘[11]。萬葉敏等[12]將雌雄大鼠分籠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，給予大鼠自由飲水的同時，給予含有復(fù)方苯乙哌啶的飼料按8 mg/(kg·d)飼養(yǎng),連續(xù)喂養(yǎng)120 d,制備STC模型，每隔5 d記錄大鼠糞便粒數(shù)及含水量、大鼠體重；造模結(jié)束后，大鼠精神萎靡，活動減少，皮毛枯槁少光澤，進(jìn)食及飲水量減少，體重增長緩慢或停止增長，糞便粒數(shù)明顯減少，糞便小而干硬伴有黑便，提示造模成功。采用此法制備STC模型，耗時周期較長，但模型穩(wěn)定，不易反復(fù)。

1.3 嗎啡法 阿片類藥物作用于胃腸μ受體是產(chǎn)生阿片類藥物相關(guān)便秘的重要原因[13]。嗎啡與胃腸μ受體結(jié)合阻礙乙酰膽堿的釋放，進(jìn)而使腸道平滑肌收縮功能減弱，并使各種消化液的分泌受到抑制,腸道對水的吸收增加,肛門括約肌收縮增強(qiáng)導(dǎo)致便秘[14]。許海塵等[15]對適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d的小鼠給予2.5 mg/(kg·d)的鹽酸嗎啡皮下注射，連續(xù)注射45 d，以小鼠平均每日糞便重量減輕、腸道推進(jìn)率下降作為STC模型制備成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)。此方法較為常用，但嗎啡有明顯的呼吸抑制作用，具有一定的安全隱患。

1.4 瀉劑結(jié)腸法 大黃水煎劑中的結(jié)合型蒽醌苷是大黃瀉下機(jī)制中的主要成分，可被大腸中的細(xì)菌酶水解為游離型大黃酸蒽醌和大黃酸[16]，長期服用大黃等瀉劑可導(dǎo)致結(jié)腸神經(jīng)系統(tǒng)紊亂和相應(yīng)的功能缺失，對瀉劑的反應(yīng)性降低，阻礙結(jié)腸蠕動功能，形成“瀉劑結(jié)腸”[17]，其是STC的一種重要類型。黃偉等[18]采用含大黃素的飼料喂養(yǎng)小鼠,以100 mg/(kg·d)為初始劑量，隨后每日劑量增加1倍,增至800 mg/(kg·d)時約一半的小鼠出現(xiàn)稀便,然后維持此劑量至稀便完全消失；再以1 600 mg/(kg·d)為起始劑量,日增1倍，最終劑量為6 400 mg/(kg·d)并循環(huán)3次，整個療程共82 d，成功建立STC模型。貢鈺霞等[19]對黃偉等[18]的STC造模方法進(jìn)行改良，以濃度為20 mg/mL的大黃酸液給予大鼠灌胃，第1循環(huán)給予12 mL/kg大黃酸液灌胃，隔日1次，直至80%的大鼠稀便消失；第2循環(huán)灌喂5 d停2 d，劑量及用法同第1循環(huán)，直至80%的大鼠稀便消失；第3循環(huán)再給予16 mL/kg大黃酸液灌胃，灌喂5 d停2 d，直至80%大鼠稀便消失。第3循環(huán)結(jié)束后給予16 mL/kg大黃酸液持續(xù)灌胃 1 周，以腸道推進(jìn)率降低作為STC大鼠造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。上述研究結(jié)果表明，大黃灌胃制備STC模型具有簡便易行、模型穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，且大黃價格低廉、來源廣，便于獲取。然而，相較于大黃酸制備STC模型，大黃灌胃的劑量不確定性較大，造模后期易導(dǎo)致動物出現(xiàn)水電解質(zhì)紊亂、免疫力下降等[20]。目前，對于采用大黃水煎劑或大黃酸灌胃構(gòu)建的STC動物模型的灌胃劑量、灌胃階段、各階段持續(xù)時間等尚未達(dá)成共識。

1.5 冰水灌胃法 有研究報(bào)告，冰冷鹽水刺激可導(dǎo)致小鼠空腸、回腸和近端結(jié)腸肌層神經(jīng)叢的腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生變化，根據(jù)該原理制作的動物便秘模型，即使終止冰水刺激后，亦具有一定的穩(wěn)定性[21]。此外，5-羥色胺4受體可以促進(jìn)豚鼠回腸平滑肌松弛，冷水刺激后胃腸平滑肌細(xì)胞內(nèi)一氧化氮含量增加，進(jìn)而上調(diào)5-羥色胺表達(dá)減緩腸的蠕動[22]。林強(qiáng)等[23]采用0 ℃～4 ℃的生理鹽水給予大鼠灌胃，2 mL/次， 1次/d，連續(xù)14 d，構(gòu)建STC大鼠模型，以大鼠結(jié)腸縱行肌收縮幅度、頻率下降和結(jié)腸推進(jìn)率降低作為建模成功的標(biāo)準(zhǔn)。該方法建立的STC大鼠模型出現(xiàn)皮毛枯槁、畏寒少動、神情呆滯等癥狀，與中醫(yī)陽虛證基本相符。冰水造模簡便易行，但實(shí)驗(yàn)周期較長且模型不穩(wěn)定，故在中醫(yī)藥治療STC的研究中已較少采用。

2 雙因素造模方法

2.1 嗎啡法+耗氣傷津法 嗎啡皮下注射可以阻礙乙酰膽堿的釋放，從而抑制胃腸道平滑肌細(xì)胞收縮。林仁敬等[24]先給予大鼠皮下注射2.5 mg/kg 的鹽酸嗎啡，1次/d，連續(xù)注射45 d，同時在皮下注射鹽酸嗎啡15 d后，給予配方顆粒(組方為青皮、枳殼、附子)按13.0 g/kg灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃30 d，以制備STC模型。造模結(jié)束后，大鼠表現(xiàn)出少動、皮毛枯黃無光澤、舌質(zhì)淡略胖大、少津、排便次數(shù)減少、顆粒粗大且硬等情況，解剖見結(jié)腸中糞便呈串珠狀或球狀，質(zhì)地干硬，提示成功建立氣陰兩虛型STC模型。造模所用的配方顆粒組方中的青皮、枳殼可破氣耗氣，且附子可燥熱傷陰，長期服用易傷津耗氣，采用該法建立STC模型符合氣陰兩傷的臨床表現(xiàn)。

2.2 復(fù)方地芬諾酯+白醋法 中醫(yī)有“味過于酸,脾氣乃絕”及“欲令脾實(shí),食勿太酸”等理論，過食酸味，易致脾虛則水濕不運(yùn)，易脾陽而致陽虛。復(fù)方地芬諾酯中的鹽酸地芬諾酯可直接作用于腸平滑肌，消除局部黏膜的蠕動反射進(jìn)而減弱腸蠕動，同時增加腸的節(jié)段性收縮并促進(jìn)腸道內(nèi)水分吸收；而阿托品可減慢腸道蠕動，抑制腸液分泌。霍黎生等[25]將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)6 d后，于造模前1 d禁食不禁水24 h。造模期間，上午先給予2.0 mg/100 g復(fù)方地芬諾酯灌胃,間隔6 h后給予1.0 mL/100 g的山西白醋灌胃，1次/d，連續(xù)15 d，制備大鼠STC模型。以大鼠體重下降、大便粒數(shù)減少及含水量降低、小腸推進(jìn)率下降為建模成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)；結(jié)果顯示造模結(jié)束后,大鼠出現(xiàn)皮毛枯槁且少光澤、活動減少、倦怠嗜臥、反應(yīng)遲鈍、 食少 、消瘦的癥狀，符合中醫(yī)陽虛表現(xiàn)。采用該法建立的STC模型具有復(fù)制簡單、實(shí)用、經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。

2.3 鹽酸洛哌丁胺+氫化可的松法 鹽酸洛哌丁胺可抑制腸道蠕動，促進(jìn)腸道內(nèi)水分吸收，進(jìn)而導(dǎo)致便秘。糖皮質(zhì)激素通過抑制下丘腦-垂體-靶腺軸，進(jìn)而抑制促腎上腺皮質(zhì)激素的釋放，從而使大鼠出現(xiàn)畏寒肢冷、精神不振、被毛疏松少光澤等癥狀[26]。白克運(yùn)等[27]給予大鼠3.0 mg/kg洛哌丁胺懸液灌胃，并給予氫化可的松注射液25.0 mg/(kg·d) 后肢肌肉注射，連續(xù)21 d，以大鼠首粒黑便排出時間延長為陽虛型STC模型制備成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)。采取該法建立的STC模型符合中醫(yī)學(xué)陽虛的臨床表現(xiàn)，且所制備的陽虛型STC模型具有易于控制、成模時間短等優(yōu)點(diǎn)。

2.4 復(fù)方地芬諾酯+自身糞便法 用小鼠自身糞便研磨后灌胃，可引起小鼠急性細(xì)菌性腹膜炎,造成腸道動力障礙而引起便秘，多用于胃腸積熱型便秘的造模。復(fù)方地芬諾酯可抑制腸道蠕動收縮，促進(jìn)腸內(nèi)水分的吸收與抑制腸液分泌，進(jìn)而導(dǎo)致便秘。鄭豐杰等[28]取小鼠糞便少許加生理鹽水制成0.1 g/L的混懸液，按1.0 mL/只對小鼠進(jìn)行灌胃，1次/d，連續(xù)3 d；于第5～7天，再給予2.0 mg/kg的復(fù)方地芬諾酯灌胃，0.3 mL/只，1次/d，連續(xù)3 d，制備小鼠STC模型；造模后小鼠皮毛枯黃毛躁、無光澤，精神倦怠、活動減少、食少、糞便少而硬，表明STC造模成功。該胃腸積熱制備法取材便捷、模型簡單，但應(yīng)注意動物自身糞便宜臨用現(xiàn)配。

2.5 復(fù)方地芬諾酯+限水法 復(fù)方地芬諾酯中的鹽酸地芬諾酯可抑制腸道收縮，促進(jìn)腸內(nèi)水分的吸收，而阿托品可抑制腸液分泌，減弱腸道蠕動進(jìn)而導(dǎo)致便秘。因此，復(fù)方地芬諾酯可導(dǎo)致機(jī)體津液耗損，使胃腸失于濡潤，“無水則舟難行”，大便艱澀難出。馬雪巍等[29]采用10.0 mg/kg的復(fù)方地芬諾酯加4.0 mL生理鹽水制成濃度為50%的復(fù)方地芬諾酯混懸液，并對大鼠進(jìn)行限水處理，即給予正常飲水量的1/3，約10.0 mL/d；每日給予大鼠灌胃4次，第 1 次灌胃復(fù)方地芬諾酯混懸液3.0 mL，其余3次分別灌胃超純水2.0 mL、3.0 mL、2.0 mL，連續(xù)灌胃7 d；造模后大鼠糞便干硬量少、呈褐色顆粒狀，精神倦怠，活動明顯減少，毛發(fā)枯槁少光澤，體質(zhì)量增加不顯著，提示津虧型STC模型制備成功。該建模方法限制水的攝入，使得脾胃無生化之源，津液匱乏，不能濡養(yǎng)機(jī)體，可導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)口干、皮膚干燥、毛發(fā)枯槁、大便干燥量少等癥狀，基本符合中醫(yī)學(xué)的津虧證型。限水法所制備的津虧型STC雖然具有操作簡單、造模周期短的優(yōu)勢，但模型穩(wěn)定性較差。

2.6 復(fù)方地芬諾酯+酒精擦拭尾部法 慢性失血，血不養(yǎng)神則精神疲憊、少動嗜睡，體質(zhì)量緩慢增長，血不養(yǎng)發(fā)則皮毛枯槁，血為氣之母，失血日久氣血俱虛則鼻唇淡白，耳尾蒼白而發(fā)涼。呂艷鋒等[30]以1.875 mg/kg的復(fù)方地芬諾酯連續(xù)灌胃小鼠30 d，同時于灌胃首日下午，用 75%乙醇棉球擦拭小鼠尾部，待血管擴(kuò)張充血后，剪去小鼠尾尖端0.25～0.30 cm，將尾傷口浸入37 ℃溫水中，直至小鼠失血0.15～0.20 mL；每5 d放血1次，共放血6次，以首次黑便排出時間延長，精神萎靡，蜷縮，耳、鼻、唇、尾蒼白為血虛證STC模型成功的標(biāo)準(zhǔn)。該血虛證動物模型雖可在短時間內(nèi)制備完成，但不能觀察動物舌脈象，其是否完全符合中醫(yī)血虛證還需深入研究，且造模過程中難以控制失血量，易出現(xiàn)傷口感染等情況。

3 復(fù)合因素造模方法

飲食失節(jié)、脾失健運(yùn)可影響小腸傳導(dǎo)功能，津虧水少不能潤澤腸道則出現(xiàn)食滯、便秘等癥狀；脾氣不濡，精微不散，則毛發(fā)枯槁無澤，精神倦怠。夏旭婷等[31]以20.0 g/(kg·d)的番瀉葉灌胃小鼠7 d，造成脾虛狀態(tài)，其間小鼠正常飲食、飲水；第8天停用番瀉葉，采用飲食失節(jié)方法維持脾虛狀態(tài)，采取隔日給予低纖維飼料，生大米6 g，每日飲水1次(30 min)，持續(xù)8 d，制備脾虛證STC小鼠模型。造模后，小鼠出現(xiàn)精神疲憊，易怒，毛發(fā)疏松少光澤，部分拱背、脫肛，活動少，進(jìn)食減少，排便次數(shù)減少，糞質(zhì)干且少等表現(xiàn)，表明造模成功。番瀉葉配合飲食失節(jié)制備脾虛型STC小鼠模型，切合中醫(yī)久泄致虛、飲食不節(jié)傷脾胃致脾虛的理論，具有操作簡單、可重復(fù)性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，但番瀉葉劑型的選擇、造?？傮w時間等需進(jìn)一步明確。

4 STC模型造模成功的判斷方法

4.1 一般狀態(tài)的觀察 主要通過觀察實(shí)驗(yàn)動物體質(zhì)量、糞便性狀、日排便量、糞便含水量等一般情況的改變，評估模型是否符合傳輸時間延長、大便干燥、排便困難等STC模型的特點(diǎn)。

4.2 結(jié)腸傳輸功能的測定 造模結(jié)束后，通過灌胃活性炭記錄首粒黑便排出時間或計(jì)算碳末在結(jié)腸內(nèi)推進(jìn)長度，進(jìn)而計(jì)算結(jié)腸推進(jìn)率，如結(jié)腸傳輸功能減弱，與STC臨床特點(diǎn)相符，則可判斷為STC模型造模成功。

4.3 Cajal間質(zhì)細(xì)胞的檢測 Cajal間質(zhì)細(xì)胞廣泛分布于腸道黏膜下層、肌層，在腸神經(jīng)系統(tǒng)與胃腸道間起橋梁作用，傳遞腸神經(jīng)元的興奮性和抑制性神經(jīng)信號，調(diào)控胃腸道運(yùn)動。病理學(xué)研究顯示，STC患者乙狀結(jié)腸壁內(nèi)Cajal間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著減少，這可能是STC發(fā)生的重要機(jī)制[32]。造模結(jié)束后，對結(jié)腸標(biāo)本進(jìn)行染色,顯微鏡下觀察Cajal間質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量變化及形態(tài)學(xué)變化,可以驗(yàn)證模型是否成功構(gòu)建。

5 小 結(jié)

STC病因病機(jī)未明，目前缺乏特異性的治療方法，患者癥狀反復(fù)。近年來，學(xué)者們通過多種方法復(fù)制便秘動物模型,但是符合STC特點(diǎn)的造模方法不多。大多數(shù)中醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)研究通過單一藥物(洛哌丁胺、復(fù)方地芬諾酯、嗎啡、大黃等)或物理刺激(冰水)制備STC動物模型，缺少STC中醫(yī)證型的復(fù)制因素；制備STC動物模型時，在藥物劑型、藥物劑量、給藥途徑、給藥持續(xù)時間等方面缺少統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)；各種造模方法在模型穩(wěn)定性、操作便捷性上存在一定差異，如何構(gòu)建穩(wěn)定性好、操作簡單的動物模型有待進(jìn)一步研究。