云南某地區(qū)少數(shù)民族農(nóng)戶自制酥油中常見致病菌的檢測

陳兆芳，曹曉蘭，余文靜，杜 涓，武有聰*

（1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2.大理護(hù)理職業(yè)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，云南大理 671000）

我國飼養(yǎng)乳畜、制作食用乳和乳制品的歷史非常悠久。酥油作為中國藏區(qū)傳統(tǒng)乳制品之一，頗受游牧民族的青睞〔1〕。酥油是從牛奶、羊奶中提煉出來類似黃油的以脂肪為主要成分的乳制品，維生素和微量元素含量高，常用于營養(yǎng)補(bǔ)充、皮膚護(hù)理、腸胃調(diào)理等〔2-3〕。酥油制作方法簡單，但制作程序多，制作過程中易被微生物污染。提取的酥油平均含水量約為10%，高水分與高不飽和脂肪酸使酥油在儲存和運輸過程中易腐敗變質(zhì)，保存期不宜超過半年〔4-5〕。酥油豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和較高的水分含量為微生物的滋生與繁殖創(chuàng)造了非常適宜的環(huán)境條件。有研究〔6-7〕表明酥油中含62種細(xì)菌和18種真菌，常見的病原菌有金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門菌和志賀菌等。酥油中微生物的種類和數(shù)量直接影響酥油的品質(zhì)和食用安全〔8〕。目前有關(guān)云南少數(shù)民族地區(qū)酥油中微生物種類及常見病原菌的研究較少。云南西北部少數(shù)民族主要以藏族、納西族、白族和彝族為主，各少數(shù)民族為適應(yīng)滇西北高海拔的自然環(huán)境，創(chuàng)造了各具特色的生產(chǎn)、生活方式和風(fēng)俗習(xí)慣。酥油作為云南高海拔地區(qū)少數(shù)民族的特有食品，在高寒山區(qū)少數(shù)民族生活中尤為重要。本項目基于酥油易污染變質(zhì)，難于長期保存的實際情況，從菌落計數(shù)和分離培養(yǎng)兩方面探索云南少數(shù)民族農(nóng)戶自制酥油中的細(xì)菌總數(shù)和常見病原菌種類，為少數(shù)民族地區(qū)酥油的安全食用提供參考。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基的制備 平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（PCA）23.5g，加去離子水1 000 mL，121℃滅菌20 min，分裝于無菌平皿（20 mL/皿），冷卻備用。孟加拉紅瓊脂36.6 g，加熱溶解于1 000 mL去離子水中，121℃滅菌20 min，分裝備用。沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）：稱取蛋白胨10.0 g，瓊脂粉20.0 g，葡萄糖40.0g，加去離子水定容至1 000 mL，115℃滅菌20 min，置于60℃水浴箱恒溫，加抗生素（青霉素100 μg/mL，氯霉素10 μg/mL）后混勻，分裝備用。結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）41.5 g，加熱溶解于1 000 mL蒸餾水中，煮沸后置于45℃水浴箱備用（用時配制）。Baird-Parker瓊脂50.1 g，溶解于1 000 mL去離子水，121℃滅菌20 min，分裝備用。麥康凱培養(yǎng)基50.0 g，加熱溶解于1 000 mL去離子水中，121℃滅菌20 min，分裝備用。上述培養(yǎng)基均購自北京路橋技術(shù)有限公司。

1.2 酥油樣品采集 于2017年10—12月先后2次采集云南省麗江市某鄉(xiāng)高海拔地區(qū)農(nóng)戶傳統(tǒng)手工自制酥油樣品35份。固體食品樣品采用“三層五點”的采樣原則〔9〕，用無菌刀具在每份酥油樣品的5個部位取樣。樣品放入無菌袋中置于冰盒保存，及時送檢。

1.3 菌落總數(shù)測定 稱取樣品（25 g/份）放入無菌均質(zhì)袋中，加入225 mL 0.9%氯化鈉水溶液（1∶10），37℃振蕩溶解，制成酥油原液，經(jīng)10倍系列稀釋（1∶100、1∶1 000、1∶10 000、1∶100 000）后取1 mL樣品涂布于PCA，每個濃度梯度涂布3個平皿，37℃培養(yǎng)24 h計數(shù)。28℃培養(yǎng)5 d，用孟加拉紅瓊脂平板對霉菌/酵母菌總數(shù)計數(shù)。菌落總數(shù)30~300 CFU為有效范圍。

1.4 霉菌/酵母菌鑒定 酥油原液采用分區(qū)劃線法接種于含抗生素的SDA，28℃培養(yǎng)3~5 d觀察結(jié)果。通過菌落特征及形態(tài)染色鑒定。肉眼見絲狀型菌落，鏡下有菌絲者鑒定為霉菌；呈酵母型或類酵母型菌落，僅有孢子相者鑒定為酵母菌。

1.5 常見致病菌的分離鑒定 酥油原液接種于VRBA平板鑒定大腸埃希菌〔10〕，接種于Baird-Parker平板鑒定金黃色葡萄球菌〔11〕，接種于麥康凱培養(yǎng)基鑒定腸道致病菌。樣品接種后37℃培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果，疑似致病菌結(jié)合菌落形態(tài)、染色特性、生化反應(yīng)及血清學(xué)試驗綜合鑒定。

1.6 統(tǒng)計分析 實驗數(shù)據(jù)采用GraPhpad Prism 8.0統(tǒng)計分析，酥油中的菌落總數(shù)以（±s）表示，并取自然對數(shù)值進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 菌落總數(shù)檢測結(jié)果35份酥油樣品涂布于PCA，檢出細(xì)菌的樣品數(shù)35份，檢出率100.0%；酥油樣品中細(xì)菌菌落總數(shù)的lgCFU為（4.08~5.31）/g，細(xì)菌lgCFU平均值為（4.97±4.81）/g，酥油樣品細(xì)菌菌落總數(shù)超標(biāo)（CFU>3×104/g）26份，超標(biāo)率74.3%。35份酥油樣品涂布于孟加拉紅平板進(jìn)行CFU計數(shù)，檢出霉菌/酵母菌31份，檢出率88.6%；霉菌/酵母菌菌落總數(shù)lgCFU為（2.00~4.98）/g，lgCFU均值為（4.31±4.42）/g，檢出真菌的31份標(biāo)本霉菌/酵母菌總數(shù)均超過標(biāo)準(zhǔn)。見表1。

表1 云南某地區(qū)農(nóng)戶自制酥油樣品微生物檢測結(jié)果（x±s）

2.2真菌檢測結(jié)果35份酥油樣品采用分區(qū)劃線法接種于含抗生素的SDA，檢出真菌陽性標(biāo)本28份，檢出率80.0%，其中，同時含有霉菌及酵母菌的樣本9份，僅含酵母菌的樣本19份。

2.3 食源性致病菌的檢測與鑒定結(jié)果35份酥油樣品接種于麥康凱培養(yǎng)基中，檢出陽性樣品（乳糖不發(fā)酵無色菌落，G-菌）4份，疑似腸道致病菌檢出率為11.4%（4/35）。4株疑似腸道致病菌通過生化反應(yīng)進(jìn)一步鑒定，3株菌（SY-5、SY-8和SY-9）在KIA培養(yǎng)基上的結(jié)果為：乳糖（-）、葡萄糖（+）、氣體（-）、H2S（-），在MIU培養(yǎng)基上的結(jié)果為：動力（-）、吲哚（-）、尿素（-），鑒定為志賀菌（Shigella）；1株菌（SY-7）在上述2種培養(yǎng)基上的結(jié)果分別為：乳糖（-）、葡萄糖（+）、氣體（+）、H2S（-），動力（+）、吲哚（-）、尿素（+），鑒定為普通變形桿菌（Proteus vulgaris）。35份酥油樣品中均未檢出大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌。見表1。

3 討論

酥油是從牛奶、羊奶中提煉出的脂肪，富含多種維生素，滋潤胃腸，和脾溫中，常用做酥油茶、酥油糌粑、糕點配料等，具有較高的營養(yǎng)價值〔12〕。此外，酥油還具有食療及保健功效，常用于游牧民族兒童潤膚、皮膚外傷、便秘、新生兒硬腫癥、壓瘡等護(hù)理治理，素有“奶中黃金”之稱，尤其以牦牛乳加工的藏式酥油最受歡迎〔13-16〕。酥油與高海拔地區(qū)少數(shù)民族的生活息息相關(guān)，其制作方法簡單，多以家庭式及小作坊式制作為主，標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的酥油只占市場份額的30%左右，這種生產(chǎn)方式?jīng)Q定了其在制作過程中極易被病原微生物污染〔17-18〕。

目前，我國尚無針對酥油的食品微生物學(xué)檢測方法及各項微生物指標(biāo)的相關(guān)規(guī)定。本實驗采用國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.15—2016進(jìn)行霉菌/酵母菌計數(shù)〔19〕，并參照王秋玲〔20〕報道的西藏地方衛(wèi)生微生物標(biāo)準(zhǔn)要求，酥油中細(xì)菌總數(shù)應(yīng)不高于3.0×104CFU/g（lgCFU≤4.48/g），霉菌/酵母菌總數(shù)不高于50 CFU/g（lgCFU≤1.70/g），致病菌如金黃色葡萄球菌、志賀菌、沙門菌等不得檢出。本實驗采集的云南某地區(qū)少數(shù)民族家庭自制酥油35份，細(xì)菌和霉菌/酵母菌檢出率分別為100.0%和88.6%，35份酥油樣品中細(xì)菌菌落總數(shù)lgCFU均值為（4.97±4.81）/g，細(xì)菌菌落總數(shù)超標(biāo)率為74.3%，霉菌/酵母菌菌落總數(shù)lgCFU均值為（4.31±4.42）/g，霉菌/酵母菌菌落總數(shù)超標(biāo)率為88.6%。此外，分離培養(yǎng)初步鑒定出3株志賀菌和1株普通變形桿菌。采用本實驗室保存的2種痢疾志賀菌診斷血清（血清型別不詳）進(jìn)行玻片凝集反應(yīng)，進(jìn)一步確定分離病原菌的血清型，結(jié)果未見明顯凝集，提示這3株志賀菌并非這2種血清型。35份酥油樣品中未分離到金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌。上述結(jié)果提示，本地區(qū)家庭自制酥油的衛(wèi)生微生物安全令人擔(dān)憂，回顧采樣地點推測，可能與農(nóng)戶家庭條件差，環(huán)境潮濕，無冰箱儲存酥油，個人衛(wèi)生習(xí)慣差等因素有關(guān)。達(dá)娃卓瑪〔21〕對西藏各地220份酥油進(jìn)行微生物檢測，發(fā)現(xiàn)酥油樣品中細(xì)菌菌落總數(shù)lgCFU均值為（3.71±1.13）/g，霉菌/酵母菌菌落總數(shù)lgCFU均值為（3.97±1.33）/g，220份樣品中均分離到金黃色葡萄球菌（檢出率100.0%），本實驗中酥油的細(xì)菌菌落總數(shù)及霉菌/酵母菌菌落總數(shù)比達(dá)娃卓瑪?shù)慕Y(jié)果偏高，但未檢出金黃色葡萄球菌，檢出3株志賀菌，并且酥油樣品菌落計數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)差較大，這可能與酥油的自動化、標(biāo)準(zhǔn)化制作比例低有關(guān)，小作坊、一家一戶式的制作方式和習(xí)慣，制作環(huán)境和個人因素對酥油產(chǎn)品質(zhì)量的影響較大。

有研究〔22〕表明，微生物的種類和數(shù)量直接影響酥油產(chǎn)品的風(fēng)味、品質(zhì)和安全性。酥油樣品中優(yōu)勢細(xì)菌種群主要為乳球菌、假單胞菌、鏈球菌和乳桿菌，優(yōu)勢真菌主要為酵母菌（約50%為假絲酵母），霉菌易引起酸敗及產(chǎn)生毒素，影響酥油的食品安全。本實驗通過孟加拉紅平板CFU計數(shù)檢出真菌陽性酥油樣品31份（檢出率88.6%）；通過分區(qū)劃線接種于SDA檢出真菌陽性樣品28份（檢出率80.0%），檢出結(jié)果的差別可能是由于CFU計數(shù)和分區(qū)劃線2種檢測方法的樣本接種量不同引起。SDA檢出的28份樣品中有9份被霉菌污染，應(yīng)警惕食用酥油引起的真菌感染或中毒。本實驗未對酥油中酵母菌的種類及數(shù)量進(jìn)行鑒定，采集的樣品數(shù)量亦有限，尚不能準(zhǔn)確反映該地區(qū)酥油中益生菌的衛(wèi)生指標(biāo)。

綜上所述，該地區(qū)酥油食品存在安全隱患，相關(guān)衛(wèi)生部門應(yīng)加強(qiáng)牦牛及其乳制品的衛(wèi)生監(jiān)管，制定酥油的食品衛(wèi)生微生物學(xué)國家標(biāo)準(zhǔn)，提倡擠奶前清潔牦牛乳房，牛奶進(jìn)行巴氏消毒，注意個人衛(wèi)生，保持環(huán)境清潔，消毒器皿，低溫或冷凍儲存，取締衛(wèi)生不達(dá)標(biāo)的小作坊，加快推進(jìn)酥油制作的程序化、標(biāo)準(zhǔn)化、機(jī)械化，以促進(jìn)少數(shù)民族地區(qū)乳制品的健康發(fā)展。