二重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測(cè)法在口蹄疫病毒檢測(cè)中的應(yīng)用

王凱

（東營(yíng)市河口區(qū)動(dòng)物疫病防治監(jiān)控中心，山東東營(yíng) 257200）

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的偶蹄動(dòng)物的一種強(qiáng)傳染性疾病?？旖?、精準(zhǔn)、可靠的診斷對(duì)防治FMD 具有很大的現(xiàn)實(shí)意義，配合應(yīng)用有效的手段，實(shí)驗(yàn)室一定要在24h 內(nèi)得出相應(yīng)結(jié)論。既往報(bào)道稱(chēng)，動(dòng)物與肉類(lèi)產(chǎn)品攜帶病毒是導(dǎo)致FMD 屢次發(fā)生的主要原因。病毒分離、血清學(xué)試驗(yàn)等常規(guī)診斷方法不僅耗時(shí)耗力，且特異性不強(qiáng)，很難滿足疫病病毒快速、精準(zhǔn)診斷的實(shí)際需求。雖然RT-PCR、競(jìng)爭(zhēng)PCR 方法彌補(bǔ)了以上缺點(diǎn)，可以診斷FMD，但存在時(shí)間長(zhǎng)、成本高、易被污染及各次檢測(cè)樣本數(shù)目少等不足。近些年發(fā)展的二重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 結(jié)合了PCR 與熒光檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)[1]，為實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣內(nèi)FMDV 的精準(zhǔn)定性與定量檢測(cè)，適應(yīng)病毒核酸快速檢測(cè)的全新思路，本研究探究二重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 在FMDV 檢測(cè)中的應(yīng)用情況。

1 材料和方法

1.1 主要試驗(yàn)材料與試劑

FMDV 標(biāo)準(zhǔn)株（O、A 與Asia Ⅰ型），經(jīng)滅火處理的豬水泡病病毒（SVDV）、水泡性口炎病毒（VSV）、環(huán)病毒2 型（PCV2）等7 種疫病病毒，動(dòng)物疫病防控中心提供臨床試樣并規(guī)范保存SVDV、VSV 等陽(yáng)性試樣。

儀器有核酸提取儀、熒光定量PCR 儀，試劑盒有質(zhì)粒DNA 純化試劑盒、FMD、熒光定量RT-PCR 檢測(cè)試劑盒等。

1.2 方法

1.2.1 設(shè)計(jì)與合成引物

對(duì)比分析后選擇FMDVO、A、Asia Ⅰ3 種不同血清型的3C 基因與FMDV-A 型VP1 基因序列作為模板，設(shè)計(jì)出通用型（FMDV-T）與A 型（FMDV-A）兩種引物（分別是5' -CGAGTCCTGCCACGGAGAT-3'、5' -CTGTGATGGCYT CGAAAAGA-3'）及TaqManTMMGB 探針，即-5'（FAM）-ATGGTCCACGGCGTGCAA-(TAMRA) -3'。

1.2.2 制作模板

應(yīng)用核酸提取儀，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)要求逐一提取O/A/Asia ⅠFMDV、SVDV、VSV、PRRSV、PEDV 總RNA和PCV2、PRV、PPV 總DNA。把RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，cDNA 與總DNA 用在PCR 擴(kuò)增過(guò)程，或低溫（-20℃）環(huán)境下凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 制備FMDV-T/FMDV-A 標(biāo)準(zhǔn)品

具體是將相應(yīng)的陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物依次克隆至pGEM-TEasy 載體里，從中篩選出陽(yáng)性重組質(zhì)粒，T7 與SP6 引物檢測(cè)其序列。針對(duì)測(cè)序準(zhǔn)確的陽(yáng)性質(zhì)粒，光度計(jì)檢測(cè)OD260與OD280，測(cè)算兩者的比值，重復(fù)進(jìn)行5 次。參照既往發(fā)表文獻(xiàn)內(nèi)提及的方法測(cè)算出濃度，pGEM-T/FMDV-T 與pGEM-T/FMDV-A 質(zhì)粒DNA 濃度依次為9.13×1010、9.12×1010拷貝/μL，定量處理并稀釋到1.0×100～1.0×1010拷貝/μL，于低溫環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 完善二重FQ-PCR 反應(yīng)條件

分別把pGEM-T/FMDV-T 與pGEM-T/FMDV-A 稀釋到1.0×105拷貝/μL，并將其作為檢測(cè)模板。引物對(duì)P1/P2、P3/P4 及探針Probe-P5、Probe-P6 稀釋的最后濃度為0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 與1.0μmol/L。在PCR儀的協(xié)助下，用矩陣法篩選出濃度有差異的引物和探針組合，有針對(duì)性的優(yōu)化反應(yīng)溫度、時(shí)間等參數(shù)，其目的是獲得最小Ct值與偏高的熒光強(qiáng)度。

1.2.5 FQ-PCR 特異性試驗(yàn)

量取適量O/A/Asia ⅠFMDV 及SVDV 等7 種不同的疫病病毒，把pGEM-T/FMDV-T 和pGEM-T/FMDV-A 混合物作為陽(yáng)性對(duì)照，細(xì)胞培養(yǎng)作為陰性對(duì)照液，按照前期完善后的FQ-PCR 反應(yīng)條件執(zhí)行FQ-PCR 擴(kuò)增過(guò)程，通過(guò)這種方式檢測(cè)驗(yàn)證這種方法的特異型號(hào)。

1.2.6 穩(wěn)定性與重復(fù)性試驗(yàn)

基于前期優(yōu)化好的FQ-PCR 反應(yīng)條件，依次對(duì)4 個(gè)不同濃度的10 倍系稀釋后的pGEM-T/FMDV-T 與pGEM-T/FMDV-A 進(jìn)行擴(kuò)增處理，各系列均設(shè)計(jì)3 個(gè)重復(fù)，通過(guò)以上過(guò)程檢驗(yàn)這種方法的穩(wěn)定性與重復(fù)性。

1.2.7 二重FQ-PCR 的臨床試驗(yàn)

結(jié)合FMDV-T/FMDV-A 二重FQ-PCR 等建立情況，調(diào)配出檢測(cè)試劑，陰、陽(yáng)性對(duì)照分別選用細(xì)胞培養(yǎng)液、FMDVT/FMDV-A 陽(yáng)性質(zhì)?；旌衔?，針對(duì)124 份疑似FMDV 感染試樣進(jìn)行檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)檢出情況。

2 統(tǒng)計(jì)和分析結(jié)果

2.1 FQ-PCR 反應(yīng)條件的完善

通用型與A 型各個(gè)引物與探針應(yīng)用如下濃度取得的擴(kuò)增成效最優(yōu)：反轉(zhuǎn)錄引物于37℃條件下持續(xù)反轉(zhuǎn)錄1h；P1、P3、P5、P6 濃度統(tǒng)一是200nmol/L，P2、P4 濃度為400nmol/L。完善后的反應(yīng)程序：94℃65min，94℃30s，60℃45s，重復(fù)運(yùn)行40 個(gè)循環(huán)。陰性對(duì)照的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)沒(méi)有特定擴(kuò)增曲線，且Ct＞30 或無(wú)，陽(yáng)性對(duì)照內(nèi)Ct≤27，且會(huì)形成特定的擴(kuò)增曲線，據(jù)此可以斷定檢測(cè)結(jié)果成立。

2.2 特異性

優(yōu)化反應(yīng)條件后創(chuàng)建了二重?zé)晒釸T-PCR，分別檢測(cè)FMDVO、A、AsiaⅠ型，通用型FAM、A 型VIC 均通道陽(yáng)性[2]，檢測(cè)以7SVDV 為代表的其他7 種不同的疫病病毒株結(jié)果均呈陰性反應(yīng)。綜合分析可以初步認(rèn)定，本課題研究中設(shè)計(jì)出的引物探針僅對(duì)目標(biāo)病毒表現(xiàn)出特異性，和其他檢測(cè)對(duì)象沒(méi)有發(fā)生交叉反應(yīng)（圖1）。

圖1 二重FQ-PCR 方法的特異性試驗(yàn)

2.3 穩(wěn)定性與重復(fù)性

觀察比較1.0×105、1.0×104、1.0×103拷貝/μL 不同濃度下FMDV-T/FMDV-A 混合物重復(fù)的試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其均呈陽(yáng)性，而1.0×100拷貝/μL 下質(zhì)粒等量混合物的試驗(yàn)結(jié)果均顯陰性（表1），提示建立的二重FQ-PCR 方法的穩(wěn)定性與重復(fù)性均處于較高水平。

表1 FQ-PCR 方法的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.4 臨床試驗(yàn)

應(yīng)用本課題研究構(gòu)建的MDV-T/FMDV-A 二重FQ-PCR檢測(cè)方法檢測(cè)124 份疑似FMD 試樣，結(jié)果顯示FMDV-T 陽(yáng)性10 份，F(xiàn)MDV-T/FMDV-A 雙陽(yáng)性7 份，其他均呈陰性。RT-PCR 檢 測(cè) 統(tǒng)計(jì) 發(fā) 現(xiàn)，F(xiàn)MDV-T 呈陽(yáng) 性、FMDV-T/FMDV-A 雙陽(yáng)性分別有9 份、6 份。而熒光定量RT-PCR 試劑盒檢出FMDV-T 陽(yáng)性11 份，F(xiàn)MDV-T/FMDV-A 雙陽(yáng)性6份。經(jīng)比較認(rèn)定，本文構(gòu)建的二重FQ-PCR 方法的靈敏性高于RT-PCR 法，提示其能取得較好的臨床應(yīng)用效果。

3 討論

FMDV 是小RNA 病毒，基因組大概8.5kb，共計(jì)有7 各血清型[3]，既往國(guó)內(nèi)外均有試驗(yàn)表明，不同血清型FMDV 之間不會(huì)發(fā)生交互免疫反應(yīng)，故而實(shí)現(xiàn)快速、精準(zhǔn)檢測(cè)是研究及防治FMD 的關(guān)鍵內(nèi)容之一。常規(guī)RT-PCR 方法能對(duì)7 個(gè)血清型病毒進(jìn)行通用檢測(cè)，并對(duì)其類(lèi)型做出特異性針對(duì)，較好彌補(bǔ)了血清學(xué)診斷、實(shí)驗(yàn)室檢查方法應(yīng)用中暴露的不足。但RT-PCR方法的敏感性不足，很難完全取代日常診斷檢查方法。最新構(gòu)建的PCR-ELISA 方法盡管有助于提升MDV 定性與定型診斷的敏感度，但在檢測(cè)大量試樣時(shí)被污染的概率較高。

鑒于以上實(shí)際情況，本課題在同個(gè)反應(yīng)管中開(kāi)展了FMDV通用型與A 型擴(kuò)增檢測(cè)活動(dòng)，并采集了相應(yīng)的熒光信號(hào)，實(shí)時(shí)在線檢測(cè)了形成的擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)而構(gòu)建了二重鑒別實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 法。通過(guò)試驗(yàn)研究證實(shí)這是一種簡(jiǎn)單、快捷、運(yùn)行有效的檢測(cè)平臺(tái)。O 型與A 型FMD 是當(dāng)前我國(guó)FMDV 主要分型，早在數(shù)年前，國(guó)家相關(guān)部門(mén)就推出了AsiaⅠ型FMD 的強(qiáng)制免疫規(guī)定，故而，F(xiàn)MDV 病原鑒別診斷的對(duì)象以O(shè) 型與A型為主。

4 結(jié)論

本文建立的檢測(cè)方法能同時(shí)執(zhí)行FMDV 不同亞型的鑒別檢測(cè)任務(wù)。既往有研究指出，在臨床病毒混合感染早期，多數(shù)病毒以潛伏感染形式存在，即病毒含量很低。二重Q-PCR 法檢測(cè)FMDV-T 與FMDV-A 的最低檢出限達(dá)到1.0×100拷貝/μL，預(yù)示著其能實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)區(qū)分。統(tǒng)計(jì)本文試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pGEMT/FMDV-T 和pGEM-T/FMDV-A 重組質(zhì)粒均呈現(xiàn)出陽(yáng)性擴(kuò)增信號(hào)，共計(jì)檢測(cè)出FMDV-T 陽(yáng)性10 份，F(xiàn)MDV-T/FMDVA 雙陽(yáng)性7 份且和基因測(cè)序結(jié)果相一致，驗(yàn)證了方法的有效性，值得推廣。