多壁碳納米管分散固相萃取凈化超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定果蔬中50種農(nóng)藥殘留量

黃華，謝文東，谷雨，孟照琦，孫元潔，杜洪淼，孫婭娜，康帥,李萌云

(北京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院，北京，101300)

我國是一個農(nóng)業(yè)大國，果蔬作為重要的經(jīng)濟作物，農(nóng)藥殘留的問題日益顯著。隨著農(nóng)藥殘留的檢測技術飛速發(fā)展，尤其是隨著液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測技術的成熟應用，農(nóng)藥殘留檢測技術不斷提升，過往的檢測存在速度慢、檢測單一、靈敏度低等缺點，高通量、高選擇性、高靈敏度成為新的發(fā)展方向，這就對樣品前處理提出了更高標準，以滿足檢測技術的要求。

目前常用于農(nóng)藥殘留前處理技術主要包括：液液萃取法[1-4]、固相萃取法[5-6]、薄層色譜法、QuEChERS[7-10]等樣品前處理凈化方法，其中QuEChERS方法速度快、通量大、效率高且成本低，能夠很好地與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測技術進行融合，滿足高通量、高選擇性、高靈敏度的檢測技術要求。QuEChERS方法自提出以來經(jīng)歷了多年的優(yōu)化和改良，已被國內(nèi)外學者廣泛使用。QuEChERS方法主要利用MgSO4等鹽類對樣品進行除水，乙二胺-N-丙基硅烷(primary secondary amine, PSA)、C18[11-16]、石墨化碳黑(graphitized carbon black, GCB)、Al2O3等填料進行混合搭配，清除樣品中的雜質(zhì)。QuEChERS方法在使用過程對于極性化和非極性的化合物都有很好的回收率，適用范圍廣泛，方法操作過程中也可以使用內(nèi)標法校正使準確度和精密度得到提升，樣品前處理分析過程簡便、快速、溶劑消耗少且價格低廉。QuEChERS方法在提升樣品提取率的同時損失了凈化效果，樣品的凈化效果不如固相萃取法，對于復雜基質(zhì)的凈化不徹底導致樣品基質(zhì)干擾問題嚴重。隨著近年來新型的凈化材料的出現(xiàn)，如多壁碳納米管(multi-walled carbon nanotube，MWCNT)和磁珠材料，提升了復雜樣品基質(zhì)的凈化效果，其在農(nóng)藥殘留檢測領域的應用逐漸引起廣泛關注。碳納米材料表面經(jīng)過官能化的修飾，在表面鍵合特殊官能團，大大增加對色素、脂肪酸等干擾物質(zhì)的選擇性。通過表面去活技術，控制了材料對藥物的過分吸附力，保證了敏感性農(nóng)藥的回收率。該材料比表面積大，具有典型的層狀中空結構特征，增大了其比表面積，增加了材料的負載能力。

本文通過MWCNTs吸附劑與QuEChERS方法的有效融合，建立了MWCNTs分散固相萃取凈化技術，結合高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定果蔬中50種農(nóng)藥殘量的檢測方法，以期為食品安全風險監(jiān)測工作提供有效的技術支持。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

UPLC-MS/MS-8050超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)，日本島津；離心機，Sigma公司; Milli-Q 高純水發(fā)生器，美國 Millipore公司。

50種農(nóng)藥標準品(純度均大于98%)，德國Dr.E公司;乙腈、甲醇、丙酮、乙酸銨，均為HPLC級，提取包(MgSO4+NaCl)、5種MWCNTs(純度>95%),天津博納艾杰爾公司。MWCNTs外徑、長度及比表面積見表1。

表1 5種MWCNTs的外徑、長度和批號Table 1 Difference specification of MWCNTs

1.2 標準溶液配制

稱取 10 mg (精確至0.1 mg) 標準品于10 mL的棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容到刻度；對于部分不溶農(nóng)藥，可以選擇乙腈、丙酮等試劑輔助溶解?；旌蠘藴嗜芤旱呐渲疲阂迫∵m量的單標儲備溶液，配制混合標準溶液，所有標準溶液于-20 ℃避光保存。

1.3 樣品處理

稱取10.0 g果蔬樣品于50 mL離心管中，加入10.0 mL 1%乙酸乙腈溶液，迅速加入提取包(含有4.0 g MgSO4和1.5 g NaCl)，扣上蓋子用力搖勻，超聲波振蕩提取10 min，5 000 r/min離心5 min，取2.0 mL上清液于 IC-NANO(MWCNTs)凈化管中進行凈化，收集流出液渦旋混勻，取1.0 mL流出液經(jīng)0.22 μm聚四氟乙烯濾膜過濾后，供UPLC-MS/MS測定。

1.4 色譜工作條件

色譜柱：Shim-pack XR-ODS Ⅲ (100 mm×2.0 mm×2.2 μm)；流動相：A為乙腈，B為0.5 mmol/L乙酸銨溶液，梯度洗脫條件：30%A→30%A(0.5 min)→95%A(6.0 min)→30%A(7.0 min)→30%A(8.0 min)；流速0.4 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量2 μL。

1.5 質(zhì)譜工作條件

電噴霧離子源(electrospray ionization，ESI)，接口電壓4 kV(ESI+)、2.8 kV(ESI-)；DL溫度250 ℃；加熱塊溫度400 ℃；接口溫度300 ℃；霧化氣流量3 L/min；加熱器流量10 L/min；干燥氣流量10 L/min；監(jiān)測模式多反應監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM)正、負離子掃描。50種農(nóng)藥殘留質(zhì)譜條件參數(shù)見表2。

表2 50種農(nóng)藥的化合物名稱、保留時間、質(zhì)荷比、 碰撞能量、掃描方式Table 2 MS parameters, retention times of the 50 pesticides

2 結果與分析

2.1 色譜與質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將各農(nóng)藥分別配制成50 μg/L的標準溶液。通過液相色譜直接注入質(zhì)譜儀，建立正、負兩種離子同時掃描模式，得到準確的母離子，首選[M+H]+ 或[M-H]-利用質(zhì)譜儀自動優(yōu)化功能，篩選二級碎片離子信息，獲得碎片離子及碰撞能量，并將母離子和 2個信號較強的子離子組成監(jiān)測離子對，以MRM模式進行檢測。

2.1.2 流動相條件的優(yōu)化

實驗比較了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-乙酸銨水溶液、作為流動相時對化合物分析結果的影響。乙腈-水作為流動相與甲醇-水相比，可提高部分農(nóng)藥的質(zhì)譜信號，但殺螟丹、抗蚜威、阿維菌素等部分農(nóng)藥的質(zhì)譜響應信號仍偏低。在乙腈-水中加入甲酸，可增加正離子的電離程度，但負離子的電離受到影響。在乙腈水溶液中加入乙酸銨，絕大部分農(nóng)藥的靈敏度均明顯提高，表明乙腈-乙酸銨水溶液更適合作流動相。同時考察了不同濃度(0.5，1.0，5.0，10.0 nmol/L)的乙酸銨對檢測結果的影響。隨著乙酸銨濃度的增加，大部分農(nóng)藥的響應值降低，形成了離子抑制。且高濃度的乙酸銨溶液會加速質(zhì)譜的污染，從而增加離子源的清洗頻次。因此，最終采用乙腈-0.5 mmol/L乙酸銨水溶液作為流動相響應值最佳。50種農(nóng)藥總離子流色譜圖見圖1。

圖1 50種農(nóng)藥總離子流色譜圖Fig.1 TIC of 50 pesticides

2.1.3 提取溶劑的選擇

農(nóng)藥殘留分析中, 常用的提取溶劑包括乙腈、甲醇、二氯甲烷、正己烷、丙酮或有機溶劑添加一定比例的酸或堿等。本實驗以回收率為指標，選取回收率相對較差的咪鮮胺、稻瘟靈和肟菌酯3種化合物，分別考察了乙腈、甲醇、二氯甲烷、正己烷、丙酮等有機溶劑，對白菜、蘋果、紅心火龍果、韭菜空白基質(zhì)中加入0.010 mg/kg的3種混標，進行提取實驗。如圖2所示，使用乙腈、甲醇、丙酮作為提取溶劑，目標物回收率普遍高于用二氯甲烷和正己烷；但丙酮作為提取溶劑時，提取液中雜質(zhì)較多，因此，初步選定甲醇、乙腈作為提取溶劑。

圖2 不同基質(zhì)、不同溶劑的提取回收率統(tǒng)計(n=6)Fig.2 Effect of different extraction solvent,different sample on recovery (n=6)

2.1.4 混合提取溶劑的選擇

不同農(nóng)藥溶解性和極性相差較大，選擇的提取溶劑要與樣品和農(nóng)藥的性質(zhì)相符合,目標農(nóng)藥在提取溶劑中要有足夠大的可溶性和穩(wěn)定性。使用單一溶劑提取不能完全兼顧所有待測農(nóng)藥的回收率，為兼顧多種農(nóng)藥同時檢測的需要，進一步提高樣品提取率，對白菜、蘋果、紅心火龍果、韭菜空白基質(zhì)中加入回收率相對較差的咪鮮胺、稻瘟靈和肟菌酯3種化合物混標0.010 mg/kg，進行提取實驗，分別考察了甲醇∶乙腈(1∶1、1∶2、2∶1)、1%乙酸甲醇、1%乙酸乙腈混合溶劑的提取效果(圖3)。

圖3 不同基質(zhì)、混合溶劑的提取回收率統(tǒng)計(n=6)Fig.3 Effect of different extraction, different sample solvent on recovery (n=6)

結果表明，使用1%乙酸乙腈作為提取溶劑，農(nóng)藥的回收率普遍偏高，并且雜質(zhì)干擾少，所以選定1%乙酸乙腈作為提取溶劑。

2.1.5 MWCNTs的種類和使用量

為考察MWCNTs的種類及用量，選用空白樣品，添加3種已知濃度有代表性農(nóng)藥目標物,依據(jù)前述方法進行樣品前處理,并在凈化階段依據(jù)正交實驗設計方案分別添加不同種類(5種MWCNTs)和用量(3,5,10,15和20 mg)MWCNTs凈化，LC-MS/MS檢測后計算獲得各目標物加標回收率，通過對比回收率來評判凈化效果，結果見圖4。通常情況下，多農(nóng)殘分析方法中各目標物的平均回收率應滿足的范圍是60%～120%。由圖4可以看出，在相同用量MWCNTs條件下，隨著MWCNTs外徑尺寸的增大，回收率遞增，說明整體凈化效果改善；在相同種類 MWCNTs條件下，隨著使用量的增加，盡管通過提取液顏色可以直觀判斷吸附效果增強，但回收率呈明顯降低趨勢，不能滿足檢測回收率要求。

圖4 不同MWCNTs種類和用量條件下目標物 回收率統(tǒng)計(n=6)Fig.4 Effect of different amounts of different MWCNTs on recovery(n=6)

由于5種MWCNTs的主要區(qū)別在于外徑尺寸，外徑減小則比表面積增大，吸附力增強，但對基質(zhì)吸附增強的同時也會對目標物產(chǎn)生吸附。同種MWCNTs使用量越大，吸附效果越強，也會在吸附除雜的同時造成目標物損失?？梢姡?MWCNTs作為吸附劑實現(xiàn)凈化功能時，并非比表面積越大越好，而是尺寸和用量要合適，控制吸附凈化作用以滿足實驗需要。由圖4可知，選用MWCNTs5用量為3和5 mg時目標物回收率均在60%～120%,但實驗中發(fā)現(xiàn),用量5 mg較3 mg的除雜效果更好。因此，確定凈化劑材料為 MWCNTs5，用量為5 mg。

2.1.6 MWCNTs與PSA結構差異對凈化效果的比較

MWCNTs吸附劑材料管體由石墨組成具有較好的疏水性能、多孔結構比表面積大、吸附性能強、耐高溫、強酸、強堿等化學特性。它可以除去植物源性樣品中色素、甾醇、有機酸和酚類雜質(zhì)，常用于農(nóng)殘檢測分析中樣品的前處理，結構見圖5。

圖5 MWCNTs結構圖Fig.5 Structure diagram of MWCNTs

而PSA是與氨基相似的吸附劑，其具有2個氨基，pKa值分別為10.1和10.9左右，比氨基柱具有更強的離子交換能力。同時PSA可與金屬離子產(chǎn)生鰲合作用，常用于提取金屬離子。它可以去除許多基質(zhì)類糖，脂肪酸和有機酸等雜質(zhì)，結構圖見圖6。對于基質(zhì)復雜且含有較多天然色素的樣品，進行前處理凈化時MWCNTs更具有優(yōu)勢。

圖6 PSA結構圖Fig.6 Structure diagram of PSA

為比較MWCNTs與PSA對果蔬樣品提取液的凈化效果，實驗選用空白果蔬樣品依前述方法提取后分別使用MWCNTs(5 mg)和PSA(25 mg)凈化，并進行LC-MS/MS檢測。比較二者的總離子流圖后發(fā)現(xiàn)，使用MWCNTs凈化可以獲得比PSA更好的凈化效果，結果見圖7～9。由于MWCNTs市售價格更為低廉，用量也僅為PSA的1/5，因而有效降低了成本。在本實驗中，還與以PSA為凈化劑的傳統(tǒng)QuEChERS方法的定量限進行了比較。結果發(fā)現(xiàn)，以MWCNTs作為吸附劑的方法定量限(limit of quantification,LOQ)可低至0.002 g/kg水平，在50種農(nóng)藥目標物中，LOQ多數(shù)在0.002～0.010 mg/kg之間；傳統(tǒng)QuEChERS方法的最低LOQ為0.010 mg/kg，50種農(nóng)藥目標物中，LOQ多數(shù)在0.010～0.050 mg/kg。顯然，MWCNTs比PSA有更加優(yōu)異的表現(xiàn)。這是由于MWCNTs具有納米級別的中空管狀結構、大的比表面積和疏水的表面能強烈吸附某些重金屬離子和有機化合物，具有較強的吸附和去除色素的能力，因此目標物的LOQ更低。

圖7 空白樣品的50種農(nóng)藥總離子流色譜圖Fig.7 Chromatograms of blank sample

圖8 50種農(nóng)藥總離子流色譜圖空白加標 0.010 mg/kg使用PSA凈化Fig.8 Chromatograms of sample purified by PSA spiked at 0.010 mg/kg 50 pesticides

圖9 50種農(nóng)藥總離子流色譜圖空白加標0.010 mg 使用MWCNTs凈化Fig.9 Chromatograms of sample purified by MWCNTs spiked at 0.010 mg/kg 50 pesticides

2.2 方法驗證

2.2.1 標準曲線和檢出限(limit of detection，LOD)

選擇與被測樣品性質(zhì)相同或相似的空白樣品按1.3方法進行前處理，得到空白基質(zhì)溶液。精確吸取一定量的混合標準溶液，逐級用空白基質(zhì)溶液稀釋成質(zhì)量濃度為0.000 5、0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1 mg/L的基質(zhì)匹配標準工作溶液，根據(jù)儀器性能和檢測需要選擇不少于5個濃度點供液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定。以農(nóng)藥定量用子離子的質(zhì)量色譜圖峰面積為縱坐標，相對應的基質(zhì)匹配標準工作溶液質(zhì)量濃度為橫坐標,繪制基質(zhì)匹配標準工作曲線。50種化合物的線性方程、相關系數(shù)、線性范圍和LOD見表3。

表3 50種化合物的線性方程、相關系數(shù)、線性范圍和檢出限Table 3 Linear equations, correlation coefficients, LODs for 50 pesticides

續(xù)表3

2.2.2 方法的回收率和精密度

在蔬菜、水果樣品基質(zhì)中加入不同用量的混合標準溶液，進行樣品前處理，得到信噪比為10∶1的每種化合物的樣品最低濃度，此添加量就是該種化合物的方法LOQ。分別取白菜、蘋果空白樣品，添加低、中、高3個不同添加量水平的50種化合物混合標準溶液，進行前處理，測定目標化合物。每個水平進行6次實驗，50種化合物的平均回收率為66.82%～105.91%，相對標準偏差為3.07%～9.96%。以白菜、蘋果樣品為代表，50種化合物的添加量、回收率、相對標準偏差見表4。

表4 50種化合物的添加量、回收率、相對標準偏差(n=6)Table 4 Recoveries，relative standard deviations of 50 pesticides spiked in 4 kinds of samples(n=6)

續(xù)表4

續(xù)表4

3 結論

本實驗建立了一套可同時測定蔬菜水果中50種高風險農(nóng)藥殘留量的檢測分析方法，采用MWCNTs結合QuEChERS的農(nóng)藥殘留樣品前處理方法，解決了多種農(nóng)藥殘留QuEChERS樣品前處理部分化合物回收率低及凈化效果差的問題。利用UPLC-MS/MS技術進行快速定性、定量分析檢測，解決了常規(guī)儀器分析方法靈敏度低、分離效果差、選擇性單一、抗干擾能力弱等技術難題。本方法能夠滿足各種不同的檢測需求，該方法快速、簡便、靈敏、準確、適用的樣品基質(zhì)廣泛，尤其適合應對食品安全突發(fā)事件應急處置工作，可快速地確定農(nóng)藥殘留的檢測項目、發(fā)現(xiàn)風險點，進行有針對性的檢測，為實現(xiàn)對市場的有效監(jiān)管提供技術支撐。