谷氨酸棒桿菌細(xì)胞工廠構(gòu)建與應(yīng)用的研究進(jìn)展

上官玲玲，盧慧芳，夏會(huì)麗，陳雄，2，代俊，2，3，4*

1(湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢，430068)2(發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(湖北工業(yè)大學(xué))， 湖北 武漢，430068)3(工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心(湖北工業(yè)大學(xué))，湖北 武漢，430068) 4(工業(yè)微生物湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(湖北工業(yè)大學(xué))，湖北 武漢，430068)

谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)為革蘭氏陽(yáng)性菌，具有兼性厭氧、無芽孢、生長(zhǎng)速度快、無致病性等特點(diǎn)。在20世紀(jì)50年代后近半個(gè)世紀(jì)被廣泛用于各種L-氨基酸的大規(guī)模生產(chǎn)，如L-谷氨酸、L-賴氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸等[1]。該菌株的實(shí)用性范圍不斷擴(kuò)大，除了生產(chǎn)L-氨基酸外，還被用于生產(chǎn)有機(jī)酸、生物燃料、萜類化合物及芳香族化合物等[2]。目前該菌株已成為工業(yè)生產(chǎn)的模式微生物之一，被廣泛用于微生物細(xì)胞工廠的構(gòu)建。

為了提高谷氨酸棒桿菌的性能和生產(chǎn)效率，常采用新技術(shù)對(duì)菌株進(jìn)行誘變、篩選和改造。如通過常壓室溫等離子體等新型誘變技術(shù)使菌株對(duì)環(huán)境的耐受性提高，同時(shí)菌株對(duì)底物的利用率及一些代謝物質(zhì)增加；利用新型的高通量篩選技術(shù)加速菌株的開發(fā)及提高篩選效率；采用基因編輯技術(shù)實(shí)現(xiàn)有機(jī)酸、生物燃料、萜類化合物等一系列增值化合物的生產(chǎn)。因此，新技術(shù)的應(yīng)用能促使谷氨酸棒桿菌成為最有希望的微生物細(xì)胞工廠之一[3]。

傳統(tǒng)的谷氨酸棒桿菌發(fā)酵一般采用成本較高的淀粉類糧食為原料，在進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)不利于節(jié)約成本[4]。目前研究者采用合成和系統(tǒng)代謝工程的方法，以微生物為底盤細(xì)胞，利用可再生原料合成一些大宗或精細(xì)化學(xué)品，并通過馴化和基因改造等手段可進(jìn)一步提高可再生原料預(yù)處理水解液中抑制物的耐受性，最終擴(kuò)大菌株對(duì)纖維素等可再生資源底物的利用[5]。

本文針對(duì)谷氨酸棒桿菌新型誘變技術(shù)、高通量篩選技術(shù)、基因編輯技術(shù)及其高附加值產(chǎn)品的生產(chǎn)情況進(jìn)行綜述，并總結(jié)了高效的谷氨酸細(xì)胞工廠能利用可再生原料生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品的實(shí)例，為研究構(gòu)建多功能谷氨酸棒桿菌細(xì)胞工廠，利用新原料生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品提高參考(圖1)。

圖1 谷氨酸棒桿菌多功能細(xì)胞工廠的構(gòu)建[6]Fig.1 Construction of C.glutamicum multifunctional cell factory[6]

1 構(gòu)建細(xì)胞工廠的新技術(shù)

1.1 新型誘變技術(shù)

誘變技術(shù)普遍應(yīng)用于菌株選育，主要分為物理誘變、化學(xué)誘變和生物誘變等3大類[7]。傳統(tǒng)的誘變技術(shù)如紫外誘變或使用化學(xué)誘變劑誘變等，存在安全風(fēng)險(xiǎn)和效率低等問題，制約著細(xì)胞工廠的發(fā)展。近年來，涌現(xiàn)出多種新型高效誘變技術(shù)例如常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma，ARTP)、重離子輻射和復(fù)合誘變等(表1)。這些新型誘變工具與傳統(tǒng)的誘變技術(shù)相比不僅安全可靠，還加速了微生物細(xì)胞改良效率。

表1 新型誘變技術(shù)在谷氨酸棒桿菌選育中的研究成果Table 1 Research results of novel mutagenesis techniques in the breeding of C.glutamicum

ARTP誘變技術(shù)是一種新型物理誘變技術(shù)。它在常溫下發(fā)射高活性粒子濃度的等離子體射流作用于菌株，使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)改變并誘發(fā)細(xì)胞啟動(dòng)SOS修復(fù)機(jī)制，修復(fù)過程所產(chǎn)生的錯(cuò)配位點(diǎn)能使 DNA 序列顯著變化，最終使菌株突變[8]。該技術(shù)操作方便、安全高效、條件溫和、環(huán)境友好[9]，并能顯著提高目標(biāo)產(chǎn)物。ARTP誘變后谷氨酸棒桿菌能高產(chǎn)氨基酸或有機(jī)酸等，如孔帥等[10]以C.glutamicum23798為出發(fā)菌株經(jīng)ARTP誘變后獲得高產(chǎn)L-異亮氨酸的突變體，L-異亮氨酸在搖瓶中的產(chǎn)量為18.5 g/L，比原始菌株提高62.03%，且遺傳性狀穩(wěn)定。該技術(shù)成為提高谷氨酸棒桿菌對(duì)酸、堿、溫度、有毒副產(chǎn)物等耐受性的新手段。

重離子輻照是一種高效人工電離技術(shù)，該技術(shù)作用于生物體細(xì)胞時(shí)會(huì)發(fā)生物理能量轉(zhuǎn)移、化學(xué)結(jié)構(gòu)改變和生物學(xué)效應(yīng)[11]。與傳統(tǒng)的紫外線射線、γ射線或X射線的誘變技術(shù)相比，重離子輻照表現(xiàn)出損傷較低、突變廣及突變效率高等優(yōu)勢(shì)，而且重離子輻照的深度及部位均能精確控制，使突變更具方向性[12]。隨著核物理學(xué)的不斷進(jìn)步，重離子輻照技術(shù)在高等植物育種方面取得了較大的進(jìn)展，也逐漸被用于谷氨酸棒桿菌性能改良，如楊陽(yáng)[13]以谷氨酸棒桿菌為出發(fā)菌株，利用12C6+離子束對(duì)其進(jìn)行輻照誘變，經(jīng)24孔板初篩和搖瓶復(fù)篩后獲得一株谷氨酸高產(chǎn)菌株，產(chǎn)酸為90.25 g/L，較出發(fā)菌株提高9.1%。

復(fù)合誘變是一種通過物理、化學(xué)多因子組合的細(xì)胞誘變方法，一般是2種或以上物理或化學(xué)誘變因子結(jié)合。該技術(shù)具有基因突變類型豐富、突變范圍廣、變異穩(wěn)定等特點(diǎn)，并能彌補(bǔ)不同誘變技術(shù)之間存在的缺陷。在微生物細(xì)胞工廠選育方面，單一的誘變手段所產(chǎn)生的基因突變相對(duì)單一，不能滿足基因突變類型的豐富性和菌株變異的穩(wěn)定性。復(fù)合誘變技術(shù)有利于打破單一誘變存在的局限性，已成為現(xiàn)代誘變技術(shù)的主流，在谷氨酸棒桿菌提高目標(biāo)產(chǎn)物方面也得到了廣泛應(yīng)用[14]。

1.2 高通量篩選技術(shù)

傳統(tǒng)的篩選技術(shù)需要進(jìn)行人工分離、純化及搖瓶培養(yǎng)等步驟，因繁瑣、費(fèi)力和低效制約著細(xì)胞工廠的發(fā)展進(jìn)程[14]。先進(jìn)的高通量篩選技術(shù)越來越多地應(yīng)用于細(xì)胞工廠的有效構(gòu)建，如基于顏色或熒光的激活細(xì)胞分選(fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS)、以液滴流體為平臺(tái)的液滴微流控分選(droplet-based microfluidic sorting，DMFS)及基于生物傳感器的篩選等(表2)，在很大程度上提高了突變庫(kù)中的篩選效率。

FACS是一種高通量篩選細(xì)胞內(nèi)帶有熒光物質(zhì)的方法，它能在高達(dá)109個(gè)的突變體文庫(kù)中快速篩選。例如，ZHANG等[19]在菌種經(jīng)ARTP誘變之后，利用FACS監(jiān)測(cè)谷氨酸棒桿菌中單細(xì)胞內(nèi)L-絲氨酸的濃度，從而在1.2×105的誘變體文庫(kù)中篩選出一株高產(chǎn)L-絲氨酸的菌株。因此，該技術(shù)適用于細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)物的篩選。

DMFS是一種高通量篩選胞內(nèi)外酶及代謝物的分選技術(shù)，其可以彌補(bǔ) FACS 技術(shù)存在的不足，同時(shí)與傳統(tǒng)的高通量篩選技術(shù)比較，更大程度上降低篩選成本和時(shí)間。基于DMFS技術(shù)新開發(fā)的微生物微液滴培養(yǎng)儀(microbial microdroplet culture system，MMC)，因具有自動(dòng)化、微型化和智能化等優(yōu)勢(shì)而被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、酵母等單細(xì)胞微生物的篩選。該技術(shù)與誘變技術(shù)結(jié)合能更高效地獲得目標(biāo)菌株。如鄧?yán)诘萚20]采用ARTP對(duì)出發(fā)菌株C.glutamicumATCC 14067進(jìn)行誘變處理后，通過自動(dòng)化的MMC系統(tǒng)結(jié)合平板選育具有組氨酸結(jié)構(gòu)類似物的抗性菌株，然后經(jīng)48孔板初篩及搖瓶復(fù)篩后得到一株L-組氨酸產(chǎn)量為(0.561±0.016)g/L的菌株，且穩(wěn)定性良好。

表2 高通量篩選技術(shù)在谷氨酸棒桿菌選育中的研究成果Table 2 Research results of high-throughput screening technology in the breeding of C.glutamicum

在突變文庫(kù)的篩選中，有些微生物在生產(chǎn)化學(xué)品時(shí)只有少部分能通過顏色或熒光的方法直接篩選，大多數(shù)化學(xué)物質(zhì)本身不具有顏色或熒光，甚至不易于染色。因此，科研人員開發(fā)出通過特定的識(shí)別元件來響應(yīng)胞內(nèi)特定代謝產(chǎn)物濃度的生物傳感器篩選技術(shù)，如以轉(zhuǎn)錄因子為識(shí)別元件構(gòu)建的生物傳感器響應(yīng)技術(shù)，轉(zhuǎn)錄因子能結(jié)合基因的啟動(dòng)子獨(dú)自或與其他蛋白組成復(fù)合體，使其促進(jìn)或阻斷RNA聚合酶參與轉(zhuǎn)錄過程來控制基因表達(dá)。細(xì)胞內(nèi)的部分小分子代謝物能通過激活或者失活轉(zhuǎn)錄因子，控制相關(guān)基因的表達(dá)，從而將代謝物濃度與細(xì)胞生長(zhǎng)等相關(guān)檢測(cè)信號(hào)聯(lián)系起來，達(dá)到高通量篩選的目的。目前，研究者利用轉(zhuǎn)錄因子開發(fā)響應(yīng)不同代謝物的高通量篩選生物傳感器，可以響應(yīng)氨基酸、脂質(zhì)、糖磷酸等代謝物。

1.3 基因編輯技術(shù)

20世紀(jì)90年代初，谷氨酸棒桿菌質(zhì)粒的分離和第一代DNA編輯技術(shù)的開發(fā)成為了谷氨酸棒桿菌基因改造的里程碑。21世紀(jì)初，德國(guó)和日本的學(xué)者公布了ATCC 13032 模式菌株的全基因組序列，奠定了谷氨酸棒桿菌基因改造的基礎(chǔ)[3]。截至2021年12月30日，美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)已收錄74株全基因組測(cè)序的谷氨酸棒桿菌，包括C.glutamicumS9114、C.glutamicumATCC 13032、C.glutamicumATCC 14067等。基因組時(shí)代的到來，轉(zhuǎn)變了科研人員依賴于誘變策略的育種模式，轉(zhuǎn)而采用理性策略改造和重構(gòu)微生物細(xì)胞工廠中的代謝和網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的方法[23]，加速了基因編輯技術(shù)在谷氨酸棒桿菌中的應(yīng)用和研究。

傳統(tǒng)的基因編輯技術(shù)效率低、耗時(shí)長(zhǎng)，主要依賴于同源重組手段對(duì)目的基因進(jìn)行缺失、突變和插入。JGER等[24]開發(fā)sacB的谷氨酸棒桿菌基因缺失方法。TAN等[25]對(duì)這種基因編輯進(jìn)行改進(jìn)，成功構(gòu)建了質(zhì)粒pDXW-3，構(gòu)建該質(zhì)粒需要2步同源重組，耗時(shí)較長(zhǎng)。HU等[26]基于Cre/loxP介導(dǎo)的特異性位點(diǎn)建立了谷氨酸棒桿菌基因缺失系統(tǒng)，該系統(tǒng)由pDTW109、pDTW201和pDTW202三個(gè)質(zhì)粒進(jìn)行基因組編輯，用于敲除谷氨酸棒桿菌的目的基因，但這種方法會(huì)在基因組位點(diǎn)留下殘留序列。由此可見傳統(tǒng)的基因編輯方法雖然能進(jìn)一步提高篩選效率，但會(huì)影響微生物細(xì)胞工廠的構(gòu)建。

CRISPR/Cas(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated proteins)的新系統(tǒng)可以解決耗時(shí)和效率低的問題。CRISPR序列于1978年被日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)，2007年法國(guó)科學(xué)家證實(shí)了CRISPR/Cas的Cas蛋白在病毒抵御過程中的作用[27]。CRISPR/Cas 系統(tǒng)包括Class I和Class II兩大類，其中最新發(fā)展的Type II-CRISPR/Cas9因在設(shè)計(jì)和操作上簡(jiǎn)單、高效、易操作、成本低被廣泛應(yīng)用于微生物細(xì)胞工廠，如畢赤酵母、鏈霉菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌等。但研究發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9 系統(tǒng)攜帶Cas9基因的質(zhì)粒在谷氨酸棒桿菌中難以轉(zhuǎn)化插入，說明該系統(tǒng)對(duì)谷氨酸棒桿菌有較大的毒性，需要通過嚴(yán)格調(diào)控Cas9蛋白降低毒性影響。CHO等[28]克服了該困難，通過對(duì)Cas9基因密碼子進(jìn)行優(yōu)化，成功降低了Cas9表達(dá)對(duì)細(xì)胞的毒性，并將其應(yīng)用于谷氨酸棒桿菌細(xì)胞工廠的基因改造(表3)。

表3 基因編輯篩選技術(shù)在谷氨酸棒桿菌中的應(yīng)用Table 3 Application of gene editing and selection technology in C.glutamicum

2 谷氨酸棒桿菌細(xì)胞工廠生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品的應(yīng)用

2.1 有機(jī)酸

谷氨酸棒桿菌早期主要用于生產(chǎn)各類氨基酸。隨著研究人員的不斷開發(fā)，其已從氨基酸生產(chǎn)的宿主發(fā)展成為一個(gè)多功能細(xì)胞工廠，能生產(chǎn)有機(jī)酸(琥珀酸、乳酸、α-酮戊二酸等)、生物燃料(3-甲基-1-丁醇、異丁醇等)、萜類化合物(類胡蘿卜素、香葉醇、朱欒倍半萜等)等多種產(chǎn)品(圖2)。下面主要對(duì)這幾類高附加值化合物的谷氨酸棒桿菌細(xì)胞工廠進(jìn)行闡述。

有機(jī)酸是一類含有羧基的酸性化合物。可作為工業(yè)中的洗滌劑、硅影劑或食品的護(hù)色劑和防腐劑等。谷氨酸棒桿菌被認(rèn)為是生產(chǎn)有機(jī)酸的菌株之一，通常在微氧或厭氧條件下合成琥珀酸、乳酸和α-酮戊二酸等化合物。

琥珀酸是重要的四碳平臺(tái)化合物，最早于1993 年發(fā)現(xiàn)琥珀酸能在供氧不足的谷氨酸棒桿菌中大量積累[33]。隨著科學(xué)的進(jìn)步，研究者在谷氨酸棒桿菌合成琥珀酸方面進(jìn)行了更深入的研究，OKINO等[34]通過過表達(dá)丙酮酸羧化酶的pyc基因，使L-乳酸脫氫酶的ldhA基因斷裂，并在厭氧條件下采用流加NaHCO3和葡萄糖的方式積累146 g/L琥珀酸。夏慧華等[35]在厭氧下過表達(dá)sucE琥珀酸輸出蛋白使琥珀酸得率和生產(chǎn)率分別提高7%和19%。研究者除了采用基因手段外，還結(jié)合關(guān)鍵代謝流提高琥珀酸產(chǎn)量，如CHUNG等[32]通過過表達(dá)NCgl0275下調(diào)解除終產(chǎn)物抑制使分批補(bǔ)料發(fā)酵的琥珀酸產(chǎn)量提高37.7%，達(dá)55.4 g/L，并進(jìn)一步提高從磷酸烯醇式丙酮酸到草酰乙酸的代謝流量，最終使琥珀酸產(chǎn)量達(dá)到152.2 g/L。

圖2 谷氨酸棒桿菌細(xì)胞工廠高附加值產(chǎn)品的生物合成途徑Fig.2 Biosynthetic pathways of high value-added products from C.glutamicum cell factories

除高產(chǎn)琥珀酸之外，谷氨酸棒桿菌也能同時(shí)大量積累乳酸和α-酮戊二酸等。如TSUGE等[36]利用代謝工程大量合成L-乳酸和D-乳酸，通過過表達(dá)糖酵解酶和葡萄糖激酶等6種酶的基因，使L-乳酸和D-乳酸濃度增加了146%和56%，再通過整合ED途徑中關(guān)鍵基因，進(jìn)一步使L-乳酸和D-乳酸濃度分別提高了11%和44%，最后L-乳酸和D-乳酸的產(chǎn)量分別高達(dá)212 g/L和264 g/L。TENHAEF等[37]通過對(duì)谷氨酸棒桿菌Weimberg途徑的改造，使菌株WMB2evo在微氧條件下利用D-木糖生產(chǎn)α-酮戊二酸和琥珀酸，并通過補(bǔ)料分批工藝使α-酮戊二酸和琥珀酸產(chǎn)量分別為11.45 g/L和11.36 g/L。

2.2 生物燃料

生物燃料泛指由生物體組成或轉(zhuǎn)化的固體、氣體或液體燃料，被應(yīng)用于食品、化工、醫(yī)藥等多個(gè)領(lǐng)域。在以微生物法生產(chǎn)生物燃料方面，以谷氨酸棒桿菌為底盤微生物已廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)3-甲基-1-丁醇、異丁醇等生物燃料。

3-甲基-1-丁醇是一種清潔、綠色和可再生的高級(jí)鏈醇能源。目前，作為汽油的理想補(bǔ)充或可持續(xù)替代品具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，如它能以任何比例與汽油混合甚至完全取代汽油，與生物乙醇相比具有更高的能量密度和更低的吸濕性，且無腐蝕性，利于長(zhǎng)期儲(chǔ)存。以谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)3-甲基-1-丁醇時(shí)，很多學(xué)者主要通過增強(qiáng)基因表達(dá)、擴(kuò)增新基因功能或消除反饋抑制等增加通量的方法來構(gòu)建高效生產(chǎn)3-甲基-1-丁醇的細(xì)胞工廠。ZHANG等[38]通過沉默谷氨酸棒桿菌中的aceE基因和敲除ldh基因，同時(shí)利用硫酸二乙酯對(duì)菌株進(jìn)行誘變獲得谷氨酸棒桿菌突變體，使突變體的3-甲基-1-丁醇產(chǎn)量達(dá)659 mg/L。為了進(jìn)一步將碳通量更多地引入3-甲基-1-丁醇合成途徑，還通過刪除ilvE基因構(gòu)建沒有ilvE活性的工程菌，使菌株產(chǎn)量從659 mg/L提升至697 mg/L。VOGT等[39]通過突變ilvE基因的起始密碼子來降低其在谷氨酸棒桿菌中高產(chǎn)L-亮氨酸的活性，并抑制ldhA基因，實(shí)現(xiàn)aro10和yqhD的過表達(dá)，使改造后的菌株生產(chǎn)3-甲基-1-丁醇時(shí)，產(chǎn)量高達(dá)2.76 g/L。

異丁醇是一種新型生物燃料，具有廣闊的發(fā)展前景。研究發(fā)現(xiàn)，高細(xì)胞毒性是微生物法生產(chǎn)異丁醇面臨的巨大挑戰(zhàn)，而谷氨酸棒桿菌能耐受異丁醇，在好氧和厭氧條件下能成功地將前體物2-酮異戊酸轉(zhuǎn)化為異丁醇，實(shí)現(xiàn)高效生產(chǎn)。目前已有學(xué)者通過代謝工程對(duì)谷氨酸棒桿菌進(jìn)行改造，使其能利用葡萄糖高產(chǎn)異丁醇，為構(gòu)建高效生產(chǎn)異丁醇細(xì)胞工廠提供了新思路[40]。SMITH等[41]在構(gòu)建谷氨酸棒桿菌合成異丁醇的細(xì)胞工廠中，通過敲除異丁醇合成途徑中的一系列基因，使丙酮酸進(jìn)入異丁醇的通量進(jìn)一步加大，最終使異丁醇的產(chǎn)量提高至 4.9 g/L。但以葡萄糖為碳源生產(chǎn)異丁醇時(shí)，因其成本高，不適用于工業(yè)化的大規(guī)模生產(chǎn)，朱年青等[30]對(duì)C.glutamicumATCC 13032進(jìn)行改造，利用餐廚廢棄物為原料制備生產(chǎn)異丁醇的細(xì)胞工廠，通過基因敲除和強(qiáng)化合成途徑使異丁醇產(chǎn)量高達(dá)165 mmol/L。

2.3 萜類化合物

萜類化合物是一類以異戊二烯碳骨架作為基本單元的化合物及其衍生物，其功能多樣、種類繁多，在醫(yī)療、食品、保健品等領(lǐng)域具有很高的應(yīng)用價(jià)值。谷氨酸棒桿菌因其自身具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)可作為生產(chǎn)復(fù)雜萜類化合物的底盤微生物，可通過改造和優(yōu)化其代謝途徑來合成類胡蘿卜素和香葉醇等萜類化合物[2]。

類胡蘿卜素是一種四萜類化合物，廣泛存在于自然界中，如蝦青素、番茄紅素和β-胡蘿卜素等均屬于類胡蘿卜素。以谷氨酸棒桿菌為底盤微生物生產(chǎn)類胡蘿卜素時(shí)，一般通過基因表達(dá)調(diào)控手段來實(shí)現(xiàn)類胡蘿卜素的合成，HEIDER等[42]通過對(duì)類胡蘿卜素生物合成途徑進(jìn)行基因工程研究，證明谷氨酸棒桿菌可以生產(chǎn)一系列不同的C40和C50類胡蘿卜素。蝦青素是一種C40萜類色素，可采用化學(xué)或生物手段合成，其中生物合成蝦青素更為安全。研究發(fā)現(xiàn)，在谷氨酸棒桿菌中代謝合成蝦青素前體物質(zhì)的存在及其合成途徑中關(guān)鍵基因的確定，為構(gòu)建高產(chǎn)蝦青素的細(xì)胞工廠提供了可能。番茄紅素是一種常用于醫(yī)藥和食品等行業(yè)的萜類化合物，可對(duì)谷氨酸棒桿菌內(nèi)含的萜類色素合成途徑進(jìn)行改造來合成大量番茄紅素，如DOMINGUEZ等[33]通過刪除谷氨酸棒桿菌ATCC 13032中的crtEb基因，使番茄紅素積累到(0.03±0.01) mg/g，同時(shí)過表達(dá)crtE、crtB、crtI基因?qū)⒎鸭t素產(chǎn)量提高80倍，達(dá)(2.4±0.3)mg/g。

香葉醇是一種無環(huán)單萜類化合物，在香水和醫(yī)藥方面有很大的商業(yè)價(jià)值。在谷氨酸棒桿菌合成萜類化合物的代謝途徑中，香葉基焦磷酸(geranylpyrophosphate，GPP)是單萜類化合物的前體，通過引入香葉醇合成酶轉(zhuǎn)化成內(nèi)源前體物GPP即可合成香葉醇。為進(jìn)一步在谷氨酸棒桿菌中高產(chǎn)香葉醇，還需要通過引入合成香葉醇的相關(guān)基因來實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)。如徐碩[43]以野生型C.glutamicumATCC 13032為出發(fā)菌株導(dǎo)入香葉醇合成基因，同時(shí)過表達(dá)了谷氨酸不棒桿菌中糖酵解途徑的dxs和idi內(nèi)源基因，使香葉醇產(chǎn)量從(5.38±0.38) mg/L提升至(12.18±0.44) mg/L。

3 谷氨酸棒桿菌細(xì)胞工廠利用可再生資源生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品的實(shí)例

谷氨酸棒桿菌主要以富含糖和淀粉的小麥、馬鈴薯、玉米、木薯等糧食作物作為發(fā)酵原料。然而，這種傳統(tǒng)的生產(chǎn)方法存在糧食競(jìng)爭(zhēng)問題?？稍偕先缃斩挕⒌練?、枯草、甘蔗渣、木屑等非食品的農(nóng)業(yè)廢棄物，因其具有可重復(fù)生產(chǎn)，價(jià)格低廉，來源廣泛等特點(diǎn)，被開發(fā)作為原料生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品，擴(kuò)大了細(xì)胞工廠的底物譜(圖3)。

圖3 谷氨酸棒桿菌細(xì)胞工廠利用可再生原料 生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品的實(shí)例Fig.3 Example of C.glutamicum cell factory producing high value-added products from renewable raw materials

玉米秸稈、玉米芯和小麥秸稈等是常見的可再生農(nóng)業(yè)廢棄物，自身含有豐富的葡萄糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，通過生物煉制過程可將其酶解或水解液作為發(fā)酵性糖用于生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品。華珂君[5]以C.glutamicumS9114為出發(fā)菌株，通過引入來自藍(lán)藻的?；?ACP還原酶-醛去甲?；友趺府a(chǎn)烴途徑成功構(gòu)建1株具備產(chǎn)烴能力的菌株，同時(shí)將脂肪酸脫羧酶分泌表達(dá)途徑與?；?ACP還原酶-醛去甲?；友趺府a(chǎn)烴途徑整合形成雙烴途徑的工程菌，并對(duì)其發(fā)酵條件優(yōu)化后使烴產(chǎn)量提高81.3%，達(dá)29.1 mg/L。該菌株利用玉米秸稈水解液進(jìn)行初步產(chǎn)烴時(shí)，產(chǎn)量達(dá)10.8 mg/L，實(shí)現(xiàn)了以木質(zhì)纖維為原料發(fā)酵生產(chǎn)烴類化合物的目的。肖雁秋[4]通過對(duì)不同谷氨酸發(fā)酵菌株進(jìn)行發(fā)酵性能的篩選，得到一株發(fā)酵性能較好的菌株C.glutamicumSⅡMB460，其自身能利用15%未脫毒的玉米秸稈水解液在青霉素誘導(dǎo)的條件下生產(chǎn)31 g/L的谷氨酸，產(chǎn)量和得率均可達(dá)到甚至超過合成培養(yǎng)基的水平。溫經(jīng)柏[44]以C.glutamicumS9114為出發(fā)菌株，通過對(duì)菌株進(jìn)行多層次的代謝工程改造后解決了影響谷氨酸棒桿菌利用玉米秸稈水解液生產(chǎn)谷氨酸和γ-氨基丁酸的關(guān)鍵問題，最終得到的重組菌株在以玉米秸稈水解液為碳源的條件下，谷氨酸和γ-氨基丁酸的產(chǎn)量分別達(dá)65.2和39 g/L。李浩[45]以C.glutamicumKBJ07為出發(fā)菌株，通過在菌株中異源表達(dá)cod、p4h基因和敲除putA基因，構(gòu)建合成反式-4-羥基-L-脯氨酸(Hyp)的突變菌，突變菌株最高生產(chǎn)水平為310 mg/L，將其在玉米芯酶解液配制的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵時(shí)，表現(xiàn)出良好的利用玉米芯酶解液產(chǎn)酸的能力，Hyp產(chǎn)量高達(dá)327 mg/L。而潘浩等[46]研究了經(jīng)代謝工程改造后的突變株以麥秸稈水解液為原料在厭氧條件下利用其阿拉伯糖或木糖合成34.1 mmol/L的琥珀酸，得率高于以葡萄糖為底物合成的琥珀酸。

4 結(jié)論

近幾十年來，谷氨酸棒桿菌仍是氨基酸生物制造的核心菌種。如今新型的誘變技術(shù)、高通量篩選技術(shù)和基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展，加速了谷氨酸棒桿菌作為微生物細(xì)胞工廠的構(gòu)建和優(yōu)化。谷氨酸棒桿菌在生產(chǎn)其他大宗化學(xué)品、天然產(chǎn)物、蛋白質(zhì)、生物燃料等產(chǎn)品方面表現(xiàn)出高潛力和多功能性。此外，在代謝工程技術(shù)的發(fā)展推動(dòng)下，谷氨酸棒桿菌的底物譜擴(kuò)展到其他廉價(jià)和非食品競(jìng)爭(zhēng)的可再生原料(如纖維素、乳漿、青貯及秸桿和麥麩的水解液等)，且菌株在這些原料中能同時(shí)利用多種碳源來生產(chǎn)各種高附加值產(chǎn)品，使谷氨酸棒桿菌成為一種有前途的高效工業(yè)平臺(tái)菌株。

目前，菌株利用新原料生產(chǎn)產(chǎn)品的效率還有待進(jìn)一步提高。因此，仍需借助系統(tǒng)的生物學(xué)手段全面分析谷氨酸棒桿菌的功能基因，并利用代謝工程繼續(xù)挖掘其代謝潛力，使細(xì)胞工廠實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)量、高速率和高純度的目標(biāo)。此外，預(yù)處理的原料不可避免地存在各種抑制物，抑制物濃度較高時(shí)影響菌株的生長(zhǎng)，需進(jìn)一步提高菌株在各種碳源的共同利用、增強(qiáng)高濃度產(chǎn)物或底物的耐受以及抑制物耐受等方面的能力，使其更適用于工業(yè)化生產(chǎn)。