扁蓿豆水浸提液對其種子萌發(fā)自毒作用研究

張小娟，楊 航，張琪琳，張鵬程，宋建超，魚小軍

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；4.中—美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070）

連作障礙指在同一塊土壤中連續(xù)栽培同種或同科作物時(shí)，即使在正常栽培管理狀況下，也會出現(xiàn)生長勢變?nèi)?、產(chǎn)量降低和品質(zhì)下降的現(xiàn)象［1］，自毒作用是導(dǎo)致連作障礙的一個(gè)重要因素［2］。自毒作用是植物通過淋溶、殘?bào)w分解和根系分泌物向環(huán)境中釋放化學(xué)物質(zhì)，對自身生長發(fā)育產(chǎn)生直接或間接抑制作用的現(xiàn)象［3］，普遍存在于植物生長過程中。有研究表明，在高于0.15 g/mL 質(zhì)量濃度的沙芥（Pugionium cornutum）葉、枝條水浸提液處理下，沙芥種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、苗高、根長、幼苗鮮質(zhì)量及干質(zhì)量均顯著降低［4］。盧紅等［5］的研究表明，隨著廣藿香（Pogostemon cablin）根、莖、葉水浸提液質(zhì)量濃度升高，廣藿香組培馴化苗的株高、根長和鮮質(zhì)量均呈逐漸降低趨勢。近年來，關(guān)于牧草種植過程中自毒作用的研究逐漸引起領(lǐng)域內(nèi)學(xué)者的重視。有研究表明，在苜蓿（Medicago sativa）人工草地建植過程中，自毒作用引起的連作障礙導(dǎo)致幼苗死亡和產(chǎn)量下降［6］；榮思川等［7］研究發(fā)現(xiàn)，5 個(gè)苜蓿品種植株浸提液對紫花苜蓿品種甘農(nóng)3 號種子萌發(fā)和幼苗生長具有明顯自毒效應(yīng)，其效應(yīng)因苜蓿品種、器官和浸提液質(zhì)量濃度不同而存在顯著差異；王啟等［8］研究發(fā)現(xiàn)，花椒葉浸提液對紫云英萌發(fā)和根長的抑制作用隨質(zhì)量濃度增大而增強(qiáng)。

扁蓿豆（Medicago ruthenica）又名花苜蓿、野苜蓿等，多年生豆科牧草，抗旱、抗寒，蛋白質(zhì)含量高，適口性好，家畜過量采食不會發(fā)生膨脹病，是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)飼料［8-10］。有關(guān)豆科牧草苜蓿的自毒效應(yīng)較多，而扁蓿豆在生長過程中是否存在自毒效應(yīng)的研究未見報(bào)道。我們以扁蓿豆種子為受體，研究了扁蓿豆不同部位、不同質(zhì)量濃度水浸提液對其種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，旨在明確扁蓿豆是否存在自毒效應(yīng)，為扁蓿豆的科學(xué)種植提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為扁蓿豆，植株采集于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院牧草種質(zhì)資源圃。采集時(shí)先清理扁蓿豆植株周圍枯枝落葉，挖取完整植株，清洗根系表面土壤及清除地上枝條間雜物。自然風(fēng)干后分為地上部分和根系部分，粉碎后用自封袋封裝，于4 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 浸提液制備 分別稱取10 g 地上部分和10 g 根系干粉，分別置于150 mL 燒杯中，加入約80 mL 蒸餾水，用玻璃棒攪拌均勻，用蒸餾水少量多次沖洗干凈燒杯內(nèi)壁。編號后封口，置于冰箱冷藏浸泡48 h 后過濾定容至100 mL，即為質(zhì)量濃度0.10 g/mL 的扁蓿豆地上部分與根系水浸提液。利用逐步稀釋法分別將扁蓿豆地上部分和根系的0.10 g/mL 母液稀釋至質(zhì)量濃度為0.001、0.025、0.050、0.100 g/mL 的水浸提液［11-13］。

1.2.2 種子發(fā)芽實(shí)驗(yàn) 選取籽粒飽滿的扁蓿豆種子，將種皮用砂紙打磨以打破其休眠。采用培養(yǎng)皿紙上發(fā)芽法，在直徑9 cm 的一次性培養(yǎng)皿中鋪2 層濾紙，每個(gè)培養(yǎng)皿均勻擺放30 粒種子，用0.001、0.025、0.050、0.100g/mL 的地上部分和根系水浸提液分別將種子完全浸沒，每個(gè)處理3 次重復(fù)，以蒸餾水為對照（CK）。加蓋后置于24 ℃、12 h 光照、12 h 黑暗的光照培養(yǎng)箱中，每天定時(shí)加入適量浸提液保證濾紙濕潤。

1.3 指標(biāo)測定

以胚芽突破種皮1～2 mm 為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，每日記錄種子發(fā)芽數(shù)。日發(fā)芽種子數(shù)達(dá)到最高峰時(shí)計(jì)算發(fā)芽勢。連續(xù)3 d 種子萌發(fā)總數(shù)不變時(shí)計(jì)算發(fā)芽率。試驗(yàn)7 d 后連續(xù)3 d 無種子萌發(fā)，故第10 d 為末次計(jì)數(shù)時(shí)間。發(fā)芽第10 d 時(shí)每皿隨機(jī)取10 株幼苗，在坐標(biāo)紙上測胚芽和胚根長，并稱量單株鮮質(zhì)量。

式中，SH為單日種子發(fā)芽達(dá)到最高峰時(shí)種子發(fā)芽粒數(shù)，SE為試驗(yàn)發(fā)芽種子數(shù)，ST為試驗(yàn)總種子數(shù)［14］。

式中，Gt為發(fā)芽日數(shù)，Gt為與Dt相對應(yīng)的每天發(fā)芽種子數(shù)。

參照Williamson 等［15］的方法，計(jì)算化感作用效益指數(shù)（RI）：

式中，T 為測試項(xiàng)目的處理值，C 為對照值。當(dāng)RI＞0 時(shí)，表示存在促進(jìn)效應(yīng)；當(dāng)RI＜0 時(shí)，表示存在抑制效應(yīng)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和作圖，用SPSS 19.0 進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）和數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 扁蓿豆地上部分和根部水浸提液對其種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

2.1.1 種子發(fā)芽勢 由圖1 可知，隨著地上部分水浸提液質(zhì)量濃度的增加，扁蓿豆種子發(fā)芽勢呈降低趨勢。在0.050 g/mL 質(zhì)量濃度處理下，發(fā)芽勢較對照蒸餾水（CK）降低9.41%；發(fā)芽勢在0.100 g/mL 質(zhì)量濃度下最低，較CK 降低50.38%（P ＜0.05）。在根部水浸提液處理下，扁蓿豆種子發(fā)芽勢在0.001、0.050 g/mL 質(zhì)量濃度處理下，分別較CK 增加3.48%、3.17%，在0.100 g/mL 質(zhì)量濃度處理下，較CK 顯著降低11.26%（P＜0.05）。

圖1 扁蓿豆地上部分和根部水浸提液對其種子發(fā)芽勢的影響

2.1.2 種子發(fā)芽率 由圖2 可知，扁蓿豆地上部分水浸提液在0.001、0.025、0.050 g/mL 質(zhì)量濃度處理下與CK 無顯著差異，0.100 g/mL 質(zhì)量濃度下發(fā)芽率最低，較CK 降低了39%（P＜0.05）。隨著根部水浸提液質(zhì)量濃度的提高，扁蓿豆種子發(fā)芽率呈先增后降的趨勢，0.100 g/mL 質(zhì)量濃度處理下較CK 顯著降低了11%（P＜0.05）。

圖2 扁蓿豆地上部分和根部水浸提液對其種子發(fā)芽率的影響

2.1.3 種子發(fā)芽指數(shù) 扁蓿豆地上部分和根系水浸提液不同程度影響其種子發(fā)芽指數(shù)（圖3）。地上部分水浸提液處理下，隨著質(zhì)量濃度的增加，扁蓿豆種子發(fā)芽指數(shù)呈先增加后降低的趨勢，在0.050、0.100 g/mL 質(zhì)量濃度處理下，扁蓿豆發(fā)芽指數(shù)分別較CK 顯著降低了46.00%、82.00%（P ＜0.05）；根部水浸提液0.100g/mL 質(zhì)量濃度處理下，扁蓿豆種子發(fā)芽指數(shù)較CK 顯著降低了21.00%（P＜0.05）。

圖3 扁蓿豆地上部分和根部水浸提液對種子發(fā)芽指數(shù)的影響

2.1.4 胚芽長 由圖4 可知，扁蓿豆植株地上部分水浸提液對扁蓿豆幼苗胚芽長呈低質(zhì)量濃度促進(jìn)、高質(zhì)量濃度抑制現(xiàn)象。0.001 g/mL 質(zhì)量濃度處理對扁蓿豆幼苗胚芽生長有顯著的促進(jìn)作用，較CK 增加了28.00%（P ＜0.05）；在0.050 和0.100 g/mL 質(zhì)量濃度處理下，胚芽長分別較CK 降低10.59%、56.00%（P ＜0.05）。扁蓿豆根部水浸提液對扁蓿豆幼苗胚芽的生長同樣表現(xiàn)出“低促高抑”效應(yīng)。在0.001 g/mL 質(zhì)量濃度處理下，胚芽長較CK 顯著增加了12.20%（P＜0.05）；在0.050、0.100 g/mL 質(zhì)量濃度處理下，均表現(xiàn)為抑制效應(yīng)，較CK分別顯著降低12.20%、25.90%（P＜0.05）。

圖4 扁蓿豆地上部分和根部水浸提液對其胚芽長的影響

2.1.5 胚根長 由圖5 可知，隨著扁蓿豆地上部分水提液質(zhì)量濃度的增加，扁蓿豆胚根長呈先增加后降低的趨勢。0.001 g/mL 質(zhì)量濃度處理的促長效果最顯著，較CK 增加了26.00%（P ＜0.05）；0.100 g/mL 質(zhì)量濃度處理的抑制效果最顯著，較CK 降低了37.00%（P ＜0.05）。扁蓿豆根部水浸提液對其胚根的伸長也呈現(xiàn)“低促高抑”效應(yīng)現(xiàn)象，0.001 g/mL 質(zhì)量濃度處理的促進(jìn)效果顯著，較CK增加33.00%（P ＜0.05）；0.100 g/mL 質(zhì)量濃度處理下抑制效果顯著，較CK 降低50.00%（P＜0.05）。

圖5 扁蓿豆地上部分和根部水浸提液對其胚根長的影響

2.1.6 單株鮮質(zhì)量 扁蓿豆地上部分和根系水浸提液亦會影響其幼苗單株鮮質(zhì)量（圖6）。扁蓿豆幼苗單株鮮質(zhì)量隨著扁蓿豆地上部分水浸提液質(zhì)量濃度的增大呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，0.001、0.025、0.050 g/mL 質(zhì)量濃度處理下幼苗單株鮮質(zhì)量較CK 分別增加了43.28%、31.74%、31.26%（P＜0.05）；根部水浸提液處理下，0.100 g/mL 質(zhì)量濃度處理的扁蓿豆幼苗單株鮮質(zhì)量最小，較CK 顯著降低49.49%（P＜0.05）。

圖6 扁蓿豆地上部分和根部水浸提液對其單株鮮質(zhì)量的影響

2.2 扁蓿豆地上部分和根部水浸提液對化感指數(shù)的影響

2.2.1 種子發(fā)芽勢 由圖7 可知，扁蓿豆植株地上部分水浸提液對扁蓿豆種子發(fā)芽勢均表現(xiàn)為抑制效應(yīng)（RI＜0），且抑制效應(yīng)隨著質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，0.100 g/mL 質(zhì)量濃度處理下抑制作用最大，化感效應(yīng)指數(shù)為-0.55。扁蓿豆根部水浸提液對扁蓿豆種子發(fā)芽勢抑制作用較地上部分水浸提液抑制作用小，且在根部水浸提液質(zhì)量濃度為0.001、0.050 g/mL 質(zhì)量濃度處理下表現(xiàn)為促進(jìn)發(fā)芽效應(yīng)（RI ＞0），質(zhì)量濃度為0.100 g/mL 時(shí)則表現(xiàn)為抑制效應(yīng)。

圖7 扁蓿豆地上部分和根部水浸提液對其種子發(fā)芽勢化感指數(shù)的影響

2.2.2 種子發(fā)芽率 由圖8 可知，質(zhì)量濃度0.001、0.050 g/mL 和0.100 g/mL 的扁蓿豆地上部分水浸提液處理對種子發(fā)芽率呈現(xiàn)抑制效應(yīng)，質(zhì)量濃度為0.100 g/mL 時(shí)抑制效果最明顯，RI=-0.41。根部水浸提液在質(zhì)量濃度為0.001 g/mL 時(shí)對扁蓿豆種子發(fā)芽率表現(xiàn)為促進(jìn)作用，質(zhì)量濃度為0.100 g/mL時(shí)表現(xiàn)為抑制效應(yīng)。

圖8 扁蓿豆地上部分和根部水浸提液對其種子發(fā)芽率化感指數(shù)的影響

2.2.3 種子發(fā)芽指數(shù) 由圖9 可知，0.001 g/mL 質(zhì)量濃度扁蓿豆地上部分水浸提液處理對種子發(fā)芽指數(shù)呈正效應(yīng)，在0.025、0.050、0.100 g/mL 質(zhì)量濃度的地上部分水浸提液處理均對種子發(fā)芽指數(shù)呈現(xiàn)負(fù)效應(yīng)。根部水提液在0.001、0.025、0.050 g/mL 質(zhì)量濃度下對種子發(fā)芽指數(shù)均呈現(xiàn)正效應(yīng)，在0.100 g/mL 質(zhì)量濃度處理下表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)。

圖9 扁蓿豆地上部分和根部水浸提液對其種子發(fā)芽指數(shù)化感指數(shù)的影響

2.2.4 胚芽長 由圖10 可知，扁蓿豆地上部分水浸提液對胚芽長化感指數(shù)也存在低質(zhì)量濃度促進(jìn)高質(zhì)量濃度抑制現(xiàn)象。在質(zhì)量濃度為0.001 g/mL處理下化感指數(shù)為0.21，表現(xiàn)為正效應(yīng)；質(zhì)量濃度為0.050、0.100 g/mL 處理下化感指數(shù)為負(fù)，表現(xiàn)為抑制效應(yīng)。扁蓿豆根部水浸提液在0.001 g/mL的質(zhì)量濃度處理下對胚芽長有促進(jìn)效應(yīng)，在0.025、0.050、0.100 g/mL 質(zhì)量濃度下均對胚芽長的伸長產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)。

圖10 扁蓿豆地上部分和根部水浸提液對胚芽長化感指數(shù)的影響

2.2.5 胚根長 由圖11 可知，在扁蓿豆地上部分水提液0.001、0.025、0.050 g/mL 質(zhì)量濃度處理下，扁蓿豆胚根長表現(xiàn)出正效應(yīng)，且隨著質(zhì)量濃度增大正效應(yīng)逐漸減??；地上部分水浸提液質(zhì)量濃度為0.100 g/mL 時(shí)表現(xiàn)為抑制作用，RI=-0.37。根部水浸提液在質(zhì)量濃度為0.001、0.025 g/mL 時(shí)對胚根的伸長有促進(jìn)作用；質(zhì)量濃度為0.001 g/mL時(shí)促進(jìn)作用最大，RI=0.25；質(zhì)量濃度為0.100 g/mL 時(shí)RI 為0.50。

圖11 扁蓿豆地上部分和根部水浸提液對其胚根長化感指數(shù)的影響

2.2.6 單株鮮質(zhì)量 由圖12 可知，扁蓿豆地上部分水浸提液在0.001、0.025、0.050 g/mL 質(zhì)量濃度處理下對幼苗單株鮮質(zhì)量呈現(xiàn)正效應(yīng)；在0.100 g/mL質(zhì)量濃度處理下呈負(fù)效應(yīng)，RI 值為-0.19。扁蓿豆根部水浸提液處理下，在0.100 g/mL 質(zhì)量濃度處理下化感負(fù)效用明顯，RI 值為-0.50。

圖12 扁蓿豆地上部分和根部水浸提液對其單株鮮質(zhì)量化感指數(shù)的影響

3 結(jié)論與討論

扁蓿豆植株地上部分與根部水浸提液在高濃度下對其種子發(fā)芽率，發(fā)芽勢，發(fā)芽指數(shù)，胚根長，胚芽長和單株鮮質(zhì)量具有一定的抑制作用，總體表現(xiàn)為0.100 g/mL 質(zhì)量濃度下抑制作用最強(qiáng)。扁蓿豆地上部分水浸提液處理在0.100 g/mL 質(zhì)量濃度下，種子發(fā)芽率較對照蒸餾水顯著降低了39.00%，種子發(fā)芽指數(shù)較對照蒸餾水降低了82.00%；根部水浸提液在0.100 g/mL 質(zhì)量濃度下胚根長較對照蒸餾水顯著降低了50.00%。在低濃度下對其種子發(fā)芽率，發(fā)芽勢，胚根長，胚芽長，和單株鮮重有一定的促進(jìn)作用，具體表現(xiàn)為0.001 g/mL 質(zhì)量濃度處理下，對扁蓿豆幼苗胚芽生長有顯著的促進(jìn)作用；較對照蒸餾水增加了28.00%；在0.001 g/mL 質(zhì)量濃度處理下對胚根長促進(jìn)效果顯著，較對照蒸餾水增加了33.00%?？傮w表現(xiàn)為低質(zhì)量濃度促進(jìn)高質(zhì)量濃度抑制效應(yīng)。

在植株生長過程中，常有地上部分枯枝落葉，植物果實(shí)和殘茬分解物等伴隨降水或人為灌溉等途徑進(jìn)入植物生長環(huán)境中，進(jìn)而不同程度的影響自身植物生長發(fā)育［16］。自毒作用是植物種內(nèi)競爭的一種特殊機(jī)制［17］，當(dāng)自毒物質(zhì)的含量達(dá)到一定程度或超過某一限值就會產(chǎn)生自毒效應(yīng)［18］。種子萌發(fā)期和胚芽胚根伸長期是對外界脅迫較為敏感的時(shí)期［19］，良好的種子萌發(fā)率是植物適應(yīng)環(huán)境的先決條件［20］。本研究表明，隨著扁蓿豆植株地上部分和根部水浸提液質(zhì)量濃度的增加，對扁蓿豆種子發(fā)芽勢，發(fā)芽率存在不同程度的“低促高抑”現(xiàn)象，這可能是自毒物質(zhì)影響了α 淀粉酶的活性，從而使得種子可溶性糖合成受到影響，影響了種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率［12］，本試驗(yàn)結(jié)果與王希等［21］在異齡苜蓿水浸液對其種子萌發(fā)的自毒效應(yīng)的研究相似。本試驗(yàn)中，地上部分水浸提液對種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢的化感指數(shù)在高質(zhì)量濃度下抑制效果高于根部水浸提液，在0.100 g/mL 質(zhì)量濃度地上部分水浸提液處理下發(fā)芽率顯著降低了11.00%，這與汪玲玲等［22］在鐵棒錘地上部分水浸提液對早熟禾發(fā)芽率的研究一致。在0.100 g/mL 質(zhì)量濃度處理下，地上部分水浸提液處理后扁蓿豆種子發(fā)芽勢化感指數(shù)為-0.55，而在根部水浸提液處理下發(fā)芽勢化感指數(shù)為-0.09，這表明扁蓿豆地上部分和根系中存在的自毒物質(zhì)具有差異性，這與鮑紅春等［4］在沙芥不同部位水浸液自毒作用研究的結(jié)論相似。

本研究過程中發(fā)現(xiàn)，地上部分水浸提液處理下扁蓿豆種子萌發(fā)在前7 天中呈現(xiàn)均勻增加趨勢，但根部水浸提液處理下扁蓿豆種子在前3 天發(fā)芽數(shù)迅速增加，后期出現(xiàn)增加緩慢甚至不增加的趨勢，而試驗(yàn)數(shù)據(jù)也表明，在0.050 g/mL 地上部分水浸提液處理下發(fā)芽率與對照蒸餾水無顯著差異，而發(fā)芽指數(shù)顯著低于對照蒸餾水。

在本試驗(yàn)中，胚芽長和胚根長在扁蓿豆地上部分和根系水浸液下處理下均隨著質(zhì)量濃度升高呈現(xiàn)先增高后下降趨勢。胚芽長化感指數(shù)表明，地上部分水浸提液在0.001、0.025 g/mL 質(zhì)量濃度處理下表現(xiàn)為正效應(yīng)，在0.050、0.100 g/mL 處理下對胚芽長表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)，而根部水浸提液處理下在0.025、0.050、0.100 g/mL 質(zhì)量濃度下表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)。這說明扁蓿豆胚芽長對根部水浸提液中自毒作用的響應(yīng)更為敏感，在較低質(zhì)量濃度時(shí)表現(xiàn)出了抑制效應(yīng)。在胚根長化感指數(shù)中也出現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象，一方面說明扁蓿豆不同部位中自毒物質(zhì)具有差異性，另一方面也說明扁蓿豆幼苗不同部位對水浸提液的響應(yīng)敏感程度不同。扁蓿豆不同部位水浸提液會影響其種子萌發(fā)和幼苗生長，證明扁蓿豆存在自毒作用。但植物自毒作用是一個(gè)復(fù)雜的過程，在此基礎(chǔ)上應(yīng)該進(jìn)一步研究扁蓿豆水浸提液對幼苗中一些抗氧化酶和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響。