綿羊RPS20 基因的生物信息學(xué)分析

陳倩玲，何亞鵬，張引弟，趙 航，王雪怡，張小雪

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

核糖體是催化蛋白質(zhì)合成的細(xì)胞器，由1 個(gè)小的40S 亞基和1 個(gè)大的60S 亞基組成。這些亞基由4 種RNA 和大約80 種結(jié)構(gòu)不同的蛋白質(zhì)組成，核糖體蛋白（ribosomal protein，RP）即所有核糖體蛋白質(zhì)組成部分的統(tǒng)稱。RPS20基因是一類參與蛋白質(zhì)生物合成及對(duì)細(xì)胞增殖、分裂、分化、凋亡具有調(diào)控作用的基因［1］，RPS20基因編碼的核糖體蛋白是40S 亞基的組成部分，該蛋白屬于核糖體蛋白的S10P 家族，它位于細(xì)胞質(zhì)中。RPS20基因作為核糖體蛋白編碼基因的典型，有多個(gè)加工過的假基因分散在基因組中［2］。有研究表明，RPS20基因RNA 干擾序列成功構(gòu)建包裝干擾慢病毒轉(zhuǎn)染后能有效抑制小鼠結(jié)腸腺癌細(xì)胞（CT26）的生長［3-4］。RPS20基因在豬繁殖與呼吸綜合征病毒復(fù)制中有一定作用［5］。此外，在篩選與豬腦心肌炎病毒（EMCV）VP1 蛋白相互作用的宿主蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)，VP1 和RPS20 蛋白之間存在特異性相互作用［6］。對(duì)大鼠RPS20基因的體外功能研究結(jié)果初步表明，核糖體蛋白基因在脾虛證發(fā)生發(fā)展過程中可能具有重要作用［7］，對(duì)慢性淺表性胃炎脾氣虛證等患者進(jìn)行基因表達(dá)譜的分析結(jié)果表明，脾氣虛證具有蛋白質(zhì)合成相關(guān)基因下調(diào)的趨勢(shì)，其中以核糖體蛋白基因下調(diào)比較顯著，選擇重復(fù)性表達(dá)下調(diào)的RPS20 對(duì)其進(jìn)行生物功能鑒定，RPS20 基因RNA 干擾后使得大鼠小腸上皮細(xì)胞（IEC-6）的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，細(xì)胞的增殖、分化能力，DNA 修復(fù)功能受到抑制，證明RPS20 基因?qū)Υ笫笮∧c上皮細(xì)胞的消化吸收和粘膜損傷修復(fù)功能起重要作用［7-11］，與脾氣虛證患者消化吸收功能下降、黏膜損傷修復(fù)能力下降等表現(xiàn)相符合。有關(guān)RPS20 基因及其編碼產(chǎn)物的研究主要是在人類和小鼠上，而在綿羊上的研究比較少。我們通過檢索NCBI 數(shù)據(jù)庫中綿羊的RPS20 基因序列，利用生物信息學(xué)的方法研究了綿羊RPS20 基因及其編碼產(chǎn)物的序列、基本理化性質(zhì)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能等，以期為進(jìn)一步探究該基因的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 序列來源

序列均來源于NCBI 網(wǎng)站GenBank 數(shù)據(jù)庫，包括綿羊（XM_004011685.4，XP_004011734.1）、人（NM_001023.4，NP_001014.1）、兔子（NM_00125 3734.1，NP_001240663.1）、雞（XM_040664730.2，XP_040520664.1）、牛（NM_001034438.1，NP_0010 29610.1）、豬（NM_001129954.1，NP_001123426.1）、馬（XM_005613124.3，XP_005613181.1）、鵪鶉（XM_015855656.1，XP_015711142.1）、黑猩猩（XM_016959501.1，XP_016814990.1）、獅子（XM_042924174.1，XP_042780108.1）、野生雙峰駝（XM_032470290.1，XP_032326181.1）11 個(gè)物種的mRNA 序列和氨基酸序列，括號(hào)內(nèi)為GenBank 的登錄號(hào)。

1.2 方法

綿羊RPS20 基因開放閱讀框（Open reading frame，ORF）分析采用NCBI 的ORF Finder 程序，基本理化性質(zhì)分析采用Bioedit 分析軟件。綿羊RPS20 蛋白亞細(xì)胞定位采用PSORTⅡ軟件，蛋白潛在信號(hào)肽剪切位點(diǎn)預(yù)測(cè)采用SignalP 3.0 軟件，蛋白跨膜螺旋區(qū)域預(yù)測(cè)采用TMHMM 程序，蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析采用Smart 軟件，蛋白親疏水性分析采用Prot Scale 軟件。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)采用Jpred 軟件，蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)采用Swiss-model軟件。多序列比對(duì)及同源性分析采用DNAMAN 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 綿羊RPS20 基因開放閱讀框分析

開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）是mRNA 上的一段堿基序列，起始于起始密碼子，結(jié)束于終止密碼子，1 個(gè)ORF 對(duì)應(yīng)1 個(gè)蛋白質(zhì)［12］，通過ORF 分析可以證明新的DNA 序列是否能夠?yàn)樘囟ǖ牡鞍踪|(zhì)編碼基因。根據(jù)圖1 可知，該序列最大的開放閱讀框長度為360 bp（起始密碼子位于121 bp 處，終止密碼子位于480 bp 處），編碼了119 個(gè)氨基酸殘基。

圖1 綿羊RPS20 基因序列的ORF 分析

2.2 綿羊RPS20 蛋白理化性質(zhì)分析

蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)包括相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)pI、氨基酸組成、基因編碼產(chǎn)物的不穩(wěn)定指數(shù)和半衰期等［13］。利用Prot Param 在線工具和Bioedit 軟件對(duì)綿羊RPS20 基因編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，表明其編碼產(chǎn)物的分子式為C587H995N173O171S5，共含有1 931 個(gè)原子。該編碼產(chǎn)物有119 個(gè)氨基酸殘基數(shù)，分子質(zhì)量為13.372 71 KDa，理論等電點(diǎn)pI 為9.95，可知綿羊RPS20 蛋白呈堿性。由圖2 可以看出綿羊RPS20 基因編碼的蛋白氨基酸組成。綿羊RPS20 基因編碼的蛋白中所含氨基酸種類豐富，其中含量最多的是Lys（賴氨酸），所占比例為10.92%；Ile（異亮氨酸）、Thr（蘇氨酸）含量較高，均為10.08%。綿羊RPS20基因編碼產(chǎn)物中不含Tyr（酪氨酸），負(fù)電荷殘基總數(shù)（Asp+Glu）為14，正電荷殘基總數(shù)（Arg+Lys）為23。所編碼產(chǎn)物在哺乳動(dòng)物體外的半衰期為30 h、不穩(wěn)定指數(shù)為32.28。根據(jù)不穩(wěn)定指數(shù)指標(biāo)（＞40為不穩(wěn)定；＜40 為穩(wěn)定），由于32.28＜40.00 可以確定該蛋白屬于穩(wěn)定蛋白。

圖2 綿羊RPS20 基因編碼的蛋白氨基酸組成

2.3 綿羊RPS20 蛋白亞細(xì)胞定位

從綿羊RPS20 基因蛋白亞細(xì)胞定位結(jié)果可知，綿羊RPS20 蛋白分布在細(xì)胞質(zhì)的可能性最大，為65.2%；分布在線粒體的可能性次之，為17.4%；分布在細(xì)胞核的可能性居第3 位，為13.0%；分布在過氧化物酶體的可能性最小，僅為4.3%。由此可以推斷，綿羊RPS20 基因編碼的產(chǎn)物主要是在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮生物學(xué)作用。

2.4 不同物種RPS20 蛋白的同源性分析

采用DNAMAN 軟件將綿羊RPS20 蛋白序列與其他一些已發(fā)表的動(dòng)物如人、綿羊、兔子、雞、牛、鵪鶉、黑猩猩、獅子、馬、豬和野生雙峰駝11種動(dòng)物的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)的結(jié)果（圖3、圖4）表明，RPS20 氨基酸序列同源性均為100%。由于RPS20基因的氨基酸序列較短，綿羊與人、牛、黑猩猩、野生雙峰駝等哺乳動(dòng)物的相似性較高。

圖3 11 個(gè)物種的RPS20 基因編碼產(chǎn)物序列的同源性分析

圖4 11 個(gè)物種的RPS20 基因編碼產(chǎn)物序列的同源樹

2.5 綿羊RPS20 蛋白潛在信號(hào)肽剪切位點(diǎn)預(yù)測(cè)

信號(hào)肽序列本質(zhì)上是蛋白質(zhì)序列中起始于N端的1 段特定氨基酸序列，在引導(dǎo)和轉(zhuǎn)運(yùn)跨膜蛋白和分泌蛋白方面發(fā)揮著重要作用。核糖體是蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所，信號(hào)肽在此合成過程中發(fā)揮重要作用［14-18］。從對(duì)綿羊RPS20 蛋白潛在信號(hào)肽剪切位點(diǎn)的預(yù)測(cè)可知，此基因編碼的產(chǎn)物是否在引導(dǎo)和轉(zhuǎn)運(yùn)跨膜蛋白和分泌蛋白方面發(fā)揮一定作用。從圖5 可以看出，綿羊RPS20 基因編碼產(chǎn)物的C值為0.084、Y 值為0.064、S 值為0.128。由此可知，RPS20 基因的編碼產(chǎn)物無跨膜區(qū)，也不存在信號(hào)肽序列，即該蛋白不是分泌性蛋白，也不是跨膜蛋白，主要位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。

圖5 綿羊RPS20 基因蛋白潛在信號(hào)肽剪切位點(diǎn)分析

2.6 綿羊RPS20 蛋白跨膜螺旋結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

采用TMHMM 在線軟件對(duì)于綿羊RPS20 蛋白跨膜螺旋結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，結(jié)果表明綿羊RPS20 基因編碼的蛋白質(zhì)是非跨膜蛋白，即無跨膜結(jié)構(gòu)（圖6）。

圖6 綿羊RPS20 基因蛋白跨膜螺旋結(jié)構(gòu)分析

2.7 綿羊RPS20 蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)中具有獨(dú)立三級(jí)結(jié)構(gòu)的部分，具有特定功能，因此也是蛋白質(zhì)功能單元。保守結(jié)構(gòu)域具有重要的功能，不能被改變，是基因的核心。由綿羊RPS20 蛋白潛在信號(hào)肽剪切位點(diǎn)預(yù)測(cè)可知，綿羊RPS20 基因編碼的蛋白是非跨膜蛋白。進(jìn)而通過Smart 軟件分析，如圖7 所示，綿羊RPS20 蛋白家族包括原核生物中的小核糖體亞基S10 和真核生物中的小核糖體亞基S20，由于序列較短，沒有跨膜結(jié)構(gòu)，也沒有復(fù)雜的跨膜區(qū)域。

圖7 綿羊RPS20 蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

2.8 綿羊RPS20 蛋白親疏水性分析

利用Prot Scale 軟件對(duì)綿羊RPS20 蛋白親疏水性分析，結(jié)果（圖8）顯示，該基因編碼蛋白疏水性的最大值為1.200，位于第113 位；最小值為-2.067，位于第75 位。該基因編碼的綿羊RPS20 蛋白屬于親水蛋白。

圖8 綿羊RPS20 基因編碼蛋白質(zhì)的疏水性/親水性預(yù)測(cè)分析

2.9 綿羊RPS20 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，特別是二、三級(jí)結(jié)構(gòu)決定其生物學(xué)功能，其二級(jí)結(jié)構(gòu)（secondary structure）指的是在它的多肽鏈中具有規(guī)則重復(fù)的構(gòu)象［19］，二級(jí)結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)第1 個(gè)水平的折疊，即部分蛋白質(zhì)鏈折疊形成一些通用結(jié)構(gòu)，這些通用結(jié)構(gòu)在所有蛋白質(zhì)中都能找到［13］。通過Jpred 軟件分析可知（圖9），綿羊RPS20 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)、α 螺旋和β 折疊三部分構(gòu)成，三者所占比例分別為44.54%、22.69%和32.77%。

圖9 綿羊RPS20 基因編碼蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.10 綿羊RPS20 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析

三級(jí)結(jié)構(gòu)（tertiary structure）是指蛋白質(zhì)的多肽鏈在二級(jí)結(jié)構(gòu)甚至結(jié)構(gòu)域基礎(chǔ)上的進(jìn)一步盤繞、折疊，依靠次級(jí)鍵的維系固定形成的特定空間結(jié)構(gòu)［15，20］。通過Swiss-model 在線工具得到的空間構(gòu)象（圖10）可以看出，綿羊RPS20基因編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)卷曲、α 螺旋和β 折疊盤曲折疊纏繞形成，與二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果相符。

圖10 綿羊RPS20 基因編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果

3 小結(jié)

綿羊RPS20基因的最長ORF 長度是360 bp，編碼的氨基酸殘基數(shù)為119。必需氨基酸種類豐富，賴氨酸所占比例最多16.67%；相對(duì)分子質(zhì)量為13.372 71 KDa，理論等電點(diǎn)（pI）為9.95。RPS20基因編碼的產(chǎn)物是穩(wěn)定性強(qiáng)、富含親水氨基酸的非分泌蛋白，也是非跨膜蛋白，無跨膜區(qū)且不存在信號(hào)肽序列。亞細(xì)胞定位的結(jié)果顯示，綿羊RPS20 蛋白在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮生物學(xué)作用的可能性最大，為65.2%；其次是在線粒體中，為17.4%。綿羊RPS20 蛋白在多種物種中氨基酸序列高度相似。綿羊RPS20基因編碼產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)由無規(guī)卷曲、α 螺旋和β 折疊三部分組成，三級(jí)結(jié)構(gòu)亦由此三部分盤曲折疊纏繞形成。