嘴突凸臍蠕孢菌Y9511油劑劑型研究

董朝霞，劉靈銳，俞雯雯，陳 勇*

（1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣州 510642；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣州 510642；3. 廣東煙草韶關(guān)市有限公司乳源縣分公司，韶關(guān)512700）

微生物除草劑是把植物病原微生物或其代謝產(chǎn)物當(dāng)作活體成分，可以滲透雜草內(nèi)部，從而消滅雜草的一種微生物制劑[1]。它可以專一選擇目標(biāo)雜草，且對環(huán)境的壓力小，對作物的安全性高，符合綠色生態(tài)的要求，越來越受到研究學(xué)者們的關(guān)注，并且已取得一定成效[2-4]。自然界中的具有除草活性的真菌、細菌和病毒均可作為微生物除草劑的來源，但目前開發(fā)最多的是真菌。有研究表明，目前至少40個屬、80多種植物病原真菌或?qū)⒊蔀槲⑸锍輨┑挠行С煞諿5,6]，但尚無微生物除草劑用于防除千金子。

嘴突凸臍蠕孢菌分離自感病千金子植株，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)雜草實驗室已對嘴突凸臍蠕孢菌Y9511菌株的生物學(xué)特性做了探究，明確了其生長所需的最適溫度、初始pH、光照條件以及室內(nèi)培養(yǎng)所需的營養(yǎng)元素；室內(nèi)條件下，噴施1×106孢子/mL Y9511孢子懸浮液后跟蹤觀察，第21 d時，對千金子的株防效和鮮重防效均達到100%；通過對水稻及其他8種雜草和作物的安全性研究，其寄主范圍相對專一，可以成為活體微生物除草劑中的有效成分[7,8]。但真菌菌株在自然環(huán)境中極其不穩(wěn)定，容易受外界環(huán)境影響而失去活性。研究表明，將菌株作為活體成分并與不同助劑混合，發(fā)現(xiàn)菌株壽命得到延長、有效活性被提高[9,10]。

油劑是指將細菌或真菌的分生孢子溶在油基里，不加水便能直接噴灑的一種劑型，孢子在油介質(zhì)中的存活率相對較高，根據(jù)劑型性質(zhì)、用途和靶標(biāo)等需求，是微生物農(nóng)藥的適用劑型。這種劑型不使用有機溶劑，可避免配方中出現(xiàn)游離水，是能夠較長時間保持微生物活性的劑型之一[11,12]。Xu等[13]的研究表明，植物油能夠增強藥液在狹瓣天竺葵上的鋪展面積。且油類助劑可以適當(dāng)增加微生物制劑的黏度，增加制劑在植物葉片的滯留量，增強制劑抗雨水沖刷能力[14,15]。同時，利用油滴附著在葉片上，潤濕性和附著性均優(yōu)于其他劑型，霧滴和藥液量相對較少，對作物具有一定安全性，常用于超低量噴霧，且對環(huán)境污染小[11]。李農(nóng)昌等[16]制備的球孢白僵菌Beauveria bassiana油劑中的孢子貯存期可達6～12個月，在進行超低量噴霧防治時，當(dāng)即殺蟲效果達70%以上，1個月內(nèi)害蟲白僵率可達70%以上，體現(xiàn)出短期控制與長期控制結(jié)合于一體的優(yōu)點。洪士茂和姚鐘杰[17]制備的殺滅草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda的綠僵菌油劑在4 d左右能達到50%以上死亡率。

1 材料與方法

1.1 供試材料

嘴突凸臍蠕孢菌Y9511分離自感病千金子植株，目前保存在廣東省微生物菌種保藏中心（GDMCC）。

PDA培養(yǎng)基配方：40.1 g馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）、5～8 g瓊脂，蒸餾水補至1000 mL。

平板菌種：挑取嘴突凸臍蠕孢菌Y9511的分生孢子于PDA培養(yǎng)基，恒溫28 ℃培養(yǎng)14 d。

孢子懸浮液：用無菌水按10 mL/皿稀釋平板菌種，經(jīng)四層紗布過濾所得。

載體：珍珠巖、硅藻土、滑石粉、高嶺土、白炭黑。

溶劑油：大豆油、玉米油、芝麻油、花生油、稻米油、葵花籽油。

表面活性劑：農(nóng)乳500#、農(nóng)乳700#、農(nóng)乳600#、農(nóng)乳601#、農(nóng)乳602#、農(nóng)乳1601#、BY-120#、吐溫-80、吐溫-20。

穩(wěn)定劑：羧甲基纖維素鈉（以下簡稱CMC-Na）、海藻酸鉀、海藻酸鈉。

1.2 嘴突凸臍蠕孢菌Y9511分生孢子的固態(tài)發(fā)酵

浸泡24 h后的優(yōu)質(zhì)大米加熱2 min，121 ℃高溫蒸汽滅菌。用無菌水按10 mL/皿稀釋平板菌種，得到的孢子懸浮液與大米混合，28 ℃恒溫培養(yǎng)14 d。發(fā)酵期間每日揉搓大米，使菌均勻分散，減少其他病菌污染。當(dāng)大米由白色轉(zhuǎn)為灰黑色時，用檢驗篩（180目）篩得孢子粉，并放入4 ℃的冰箱保存。

1.3 嘴突凸臍蠕孢菌Y9511分生孢子萌發(fā)率測定

取1 g 步驟1.2收集到的孢子粉，與10 mL的滅菌水充分混合，取0.1 mL至載玻片上，于玻璃培養(yǎng)皿中墊有濕潤濾紙，28 ℃恒溫培養(yǎng)4 h。挑取5個視野，統(tǒng)計明顯長出芽管的孢子，重復(fù)3次，按下列公式檢測孢子的活力。分生孢子萌發(fā)率（%）＝（萌發(fā)的分生孢子數(shù)/總分生孢子數(shù)）×100。

1.4 載體篩選

1.4.1 載體種類對嘴突凸臍蠕孢菌Y9511菌落直徑及產(chǎn)孢量的影響 配制濃度1%（W/V）的不同載體的PDA培養(yǎng)基，121 ℃高溫蒸汽滅菌后，倒入直徑為9 cm的玻璃培養(yǎng)皿，自然凝固后接種已生長7 d的平板菌種，恒溫培養(yǎng)（28 ℃）7 d，用十字交叉法測量菌落直徑。培養(yǎng)14 d后，用10 mL無菌水洗下分生孢子，測量產(chǎn)孢量。對照為沒有載體的PDA培養(yǎng)基。每個處理3次重復(fù)。

1.4.2 載體種類對嘴突凸臍蠕孢菌 Y9511分生孢子萌發(fā)的影響 以孢子粉（mg）∶載體（mg）為 2∶1的比例混合均勻，室溫下保存兩周后，用10 mL的滅菌水稀釋，取0.1 mL混合液滴在無菌載玻片上，在培養(yǎng)皿上墊好濕潤濾紙，恒溫28 ℃培養(yǎng)4 h。統(tǒng)計方法同1.3。每個處理3次重復(fù)。

1.4.3 孢子粉與珍珠巖的比例對嘴突凸臍蠕孢菌 Y9511分生孢子萌發(fā)的影響 孢子粉與珍珠巖比例分別為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3（以mg為單位）混合均勻，室溫下保存兩周。其他試驗方法同1.3。每個處理3次重復(fù)。

1.5 表面活性劑篩選

1.5.1 表面活性劑種類對嘴突凸臍蠕孢菌Y9511菌落直徑及產(chǎn)孢量的影響 配制濃度2%（W/V）的不同表面活性劑的PDA培養(yǎng)基，121 ℃高溫蒸汽滅菌后，倒入培養(yǎng)皿，其他試驗方法同1.4.1。對照為沒有表面活性劑的PDA培養(yǎng)基。每個處理3次重復(fù)。篩選出三種表現(xiàn)較好的表面活性劑。

1.5.2 表面活性劑分散力的測定 根據(jù)楊爽[18]的分散力測定方法，將步驟 1.5.1選出來的三種表面活性劑配制成一定濃度的溶液，與孢子粉混合后，迅速攪拌，在上、中、下三層取樣，在顯微鏡下挑取5個視野觀察孢子數(shù)。表面活性劑的分散優(yōu)良程度以分散指數(shù)（I）為指標(biāo)，按下列公式進行計算。當(dāng)I＜1時，孢子均勻分布；當(dāng)I＝1時，孢子隨機分布；當(dāng)I＞1時，孢子聚集分布。當(dāng)I＜1時，I越小，孢子分布越均勻。根據(jù)分散指數(shù)的大小，確定最佳表面活性劑。I＝σ2/（σ：標(biāo)準(zhǔn)差；：樣本平均數(shù)）

1.5.3 農(nóng)乳1601#的濃度對嘴突凸臍蠕孢菌Y9511孢子萌發(fā)的影響 分別取農(nóng)乳1601#0.01 mL、0.03 mL、0.05 mL和0.1 mL，與30 mg孢子粉混合均勻，室溫下保存兩周后，用10 mL滅菌水混合均勻后，取0.1 mL于培養(yǎng)皿上進行保濕，恒溫28 ℃培養(yǎng)4 h，其他試驗方法同1.3。每個處理3次重復(fù)。

1.5.4 農(nóng)乳1601#的濃度對分散性能的影響 分別取農(nóng)乳1601#0.1 mL、0.3 mL、0.5 mL和1 mL，與100 mL滅菌水分別配制成0.1%、0.3%、0.5%和1%的溶液，加入30 mg孢子粉混合均勻后，立刻在上、中、下三層取樣，在血球計數(shù)板上觀察。統(tǒng)計方法同1.5.2。

1.6 油類助劑的篩選

1.6.1 油類助劑種類對嘴突凸臍蠕孢菌Y9511直徑及產(chǎn)孢量的測定 配制濃度5%（W/V）的不同油類助劑的PDA培養(yǎng)基中，121 ℃高溫蒸汽滅菌后，倒入培養(yǎng)皿。其他試驗方法同1.4.1。對照為沒有油類助劑的PDA培養(yǎng)基。每個處理3次重復(fù)。

1.6.2 油類助劑種類對嘴突凸臍蠕孢菌Y9511分生孢子萌發(fā)的影響 以孢子粉（mg）:油類助劑（mL）為2:1的比例混合均勻，室溫下保存兩周。其他試驗方法同1.3。每個處理3次重復(fù)。

1.6.3 孢子粉與大豆油的比例對嘴突凸臍蠕孢菌 Y9511分生孢子萌發(fā)的影響 孢子粉與大豆油比例分別為4:1、2:1、1:1、1:2、1:4（孢子粉單位為mg；大豆油單位為mL）混合均勻，室溫下保存兩周。其他試驗方法同1.3。每個處理3次重復(fù)。

1.7 106孢子/mL孢子懸浮液的最大吸光波長確定

1.7.1 嘴突凸臍蠕孢菌Y9511孢子懸浮液配制 將嘴突凸臍蠕孢菌Y9511菌株接種到PDA培養(yǎng)基中，恒溫28 ℃培養(yǎng)14 d，用無菌水洗下孢子后，四層紗布濾除菌絲得到孢子懸液，在血球計數(shù)板觀察，配制孢子懸浮液的濃度為106孢子/mL。

1.7.2 嘴突凸臍蠕孢菌Y9511孢子懸浮液最大吸光波長確定 將步驟1.7.1的孢子懸浮液，在波長范圍為340～1000 nm的可見光分光光度計上測量其吸光值。初始波長值350 nm，每隔100 nm測量一次。當(dāng)吸光度呈現(xiàn)下降趨勢后，在350～450 nm的范圍內(nèi)，每隔10 nm再次測量其吸光度。將所有測量波長所對應(yīng)的吸光度作曲線分析，106孢子/mL孢子懸浮液的最大吸光度就是曲線的峰值，對應(yīng)波長則為最大吸收波長。

1.8 穩(wěn)定劑的篩選

1.8.1 穩(wěn)定劑種類對嘴突凸臍蠕孢菌 Y9511菌落直徑及產(chǎn)孢量的影響 配制濃度 0.5%（W/V）的不同穩(wěn)定劑的PDA培養(yǎng)基，放入121 ℃高溫蒸汽滅菌后，倒入直徑為9 cm培養(yǎng)皿。其他試驗方法同1.4.1。對照為沒有穩(wěn)定劑的PDA培養(yǎng)基。每個處理3次重復(fù)。

1.8.2 穩(wěn)定劑的穩(wěn)定性測定 配制一定濃度的不同穩(wěn)定劑溶液，與30 mg孢子粉充分混合，波長值為360 nm，在分光光度計下分別放置0 min、5 min、15 min、30 min、45 min和60 min，測出其吸光度后進行擬合分析，通過斜率大小比較其穩(wěn)定性。每個處理3次重復(fù)。

1.8.3 穩(wěn)定劑的懸浮率測定 按GB/T 14825-2006 《農(nóng)藥懸浮率測定方法》進行懸浮率測定，篩選出懸浮性最好的穩(wěn)定劑。配制濃度為0.01%、0.03%、0.05%、0.1%、0.3%、0.5%和1%（總體積為250 mL）的海藻酸鉀溶液，稱取0.5 g孢子粉，精確至0.0001 g，分別加入裝有海藻酸鉀溶液的燒杯中，迅速攪拌，在32 ℃水浴中放置30 min后，迅速用移液槍將內(nèi)容物的9/10（即225 mL）懸浮液移出，不要搖動或挑起量筒內(nèi)的沉降物，按規(guī)定方法測定試樣和留在量筒底部25 mL懸浮液中的有效成分質(zhì)量。試樣中有效成分懸浮率W（%）按以下公式計算：W（%）＝（m1—m2）/m1×（10/9）×100，其中，m1：配制懸浮液所取試樣中有效成分質(zhì)量，單位為克（g）；m2：留在量筒底部25 mL懸浮液中有效成分質(zhì)量，單位為克（g）；10/9：換算系數(shù)。

1.8.4 海藻酸鉀的濃度對嘴突凸臍蠕孢菌 Y9511分生孢子萌發(fā)的影響 海藻酸鉀溶液的濃度 0.01%、0.03%、0.05%、0.1%、0.3%、0.5%和1%，與30 mg孢子粉混合均勻，室溫兩周后取0.1 mL滴在無菌載玻片上，置于培養(yǎng)皿中濕潤培養(yǎng)4 h。其他試驗方法同1.3。每個處理3次重復(fù)。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用 SPSS（20.0）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)和 Excel 2016進行統(tǒng)計分析，試驗結(jié)果方差分析后進行Duncan’s多重比較檢驗差異（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 嘴突凸臍蠕孢菌Y9511孢子萌發(fā)率的測定

隨機選取5個視野，每個視野內(nèi)明顯長出芽管的孢子數(shù)/視野內(nèi)總孢子數(shù)分別為32/35、30/31、30/30、34/36和32/32。孢子萌發(fā)率為96.34%，說明收集的孢子活力較高，可作為本次試驗的材料。

2.2 載體的篩選

載體的種類會對嘴突凸臍蠕孢菌Y9511的菌落生長速度和產(chǎn)孢具有一定影響。由圖1的試驗結(jié)果可知，不同載體與對照相比，菌落直徑存在顯著性差異。PDA培養(yǎng)基添加了不同載體后，均減緩了菌落的生長速度，其中，添加硅藻土的培養(yǎng)基菌株生長最慢，菌落直徑只有7.73 cm。

圖1 載體種類對嘴突凸臍蠕孢菌Y9511菌落直徑及產(chǎn)孢量的影響Fig. 1 The effect of carrier types on the colony diameter and spore production of E. rostratum Y9511

從產(chǎn)孢量來看，不同載體均能促進菌株Y9511產(chǎn)孢。當(dāng)以珍珠巖、滑石粉為載體時，對菌株的產(chǎn)孢有明顯的促進作用，添加珍珠巖能使菌株Y9511的產(chǎn)孢量達到5.3×106孢子/mL，添加滑石粉能使產(chǎn)孢量達到4.5×106孢子/mL，與對照差異顯著（P＜0.05)。

將孢子粉（mg）與載體以2:1（mg）的比例配制后，滑石粉和珍珠巖的添加對孢子萌發(fā)有促進作用，萌發(fā)率能達到43.3%和50.0%。其余3種載體添加均對孢子萌發(fā)有抑制作用，添加高嶺土后萌發(fā)率為41.3%，添加硅藻土后為36.0%，添加白炭黑后為38.6%。珍珠巖的成本比滑石粉低，從制劑的開發(fā)角度看，商品化生產(chǎn)應(yīng)以盡量低成本的原料來獲取效益高的產(chǎn)品，綜上所述，珍珠巖作為載體效果更佳（圖2）。

圖2 載體種類對嘴突凸臍蠕孢菌Y9511孢子萌發(fā)的影響Fig. 2 The effect of carrier types on the spore germination of E. rostratum Y9511

以珍珠巖作為載體時，設(shè)定的所有比例的孢子萌發(fā)率均高于對照，不同比例之間的萌發(fā)率幾乎一致（圖3）。當(dāng)比例為1:1時，萌發(fā)率最高，為47.0%，故確定孢子粉（mg）與珍珠巖（mg）的添加比例為1:1。

圖3 孢子粉與珍珠巖的比例對嘴突凸臍蠕孢菌Y9511孢子萌發(fā)的影響Fig. 3 The effect of the ratio of spore powder to perlite on the spore germination of E. rostratum Y9511

2.3 表面活性劑的篩選

表面活性劑的性質(zhì)間接影響了嘴突凸臍蠕孢菌Y9511的生長。所有的表面活性劑均對菌株Y9511的菌絲體生長有著抑制作用，農(nóng)乳1601#對其抑制作用不明顯（圖4）。在添加了農(nóng)乳700#、農(nóng)乳600#、農(nóng)乳601#、農(nóng)乳500#、BY-120#的PDA培養(yǎng)基中，其菌落直徑大小與對照相比，有顯著的抑制作用（P＜0.05)，農(nóng)乳 500#抑制最嚴(yán)重，菌株基本不生長。從產(chǎn)孢量來看，除農(nóng)乳 500#對產(chǎn)孢有極明顯的抑制作用外，其余8種表面活性劑均對菌株的產(chǎn)孢有促進作用，其中，農(nóng)乳700#的產(chǎn)孢量與對照相比有顯著差異（P＜0.05)，產(chǎn)孢作用最好。綜合兩個指標(biāo)，農(nóng)乳1601#、吐溫-80和農(nóng)乳601#表現(xiàn)較好，可進行下一步操作。

圖4 表面活性劑種類對嘴突凸臍蠕孢菌Y9511菌落直徑和產(chǎn)孢量的影響Fig. 4 The effect of surfactant types on the colony diameter and spore production of E. rostratum Y9511

對農(nóng)乳1601#、吐溫-80和農(nóng)乳601#進行分散力測定，三種表面活性劑的分散力存在顯著差異（P＜0.05)。同濃度的三種表面活性劑中，農(nóng)乳601#的I值為1.54，I值大于1，分散力較差；農(nóng)乳1601#和吐溫-80的分散力分別為0.35和0.89，I值均小于1，但農(nóng)乳1601#的分散力更小，分散性能優(yōu)于吐溫-80。故選擇農(nóng)乳1601#作為表面活性劑。

農(nóng)乳1601#在0.10%、0.50%、1.00%這三個濃度，孢子萌發(fā)率均低于對照（圖5）。在0.30%這個濃度萌發(fā)率最高，為54.3%，且顯著高于對照（P＜0.05)。結(jié)合分散力測定結(jié)果，0.10%、0.30%、0.50%、1.00%這四種濃度的分散力指數(shù)分別為 0.124、0.052、0.298、0.51，I值均小于 1，0.30%農(nóng)乳 1601#分散指數(shù) I為0.052，顯著低于其他濃度的分散指數(shù)I，分散性能良好。故選擇農(nóng)乳1601#的濃度為0.30%。

圖5 農(nóng)乳1601#的濃度對嘴突凸臍蠕孢菌Y9511孢子萌發(fā)的影響Fig. 5 The effect of the concentration of Nongru 1601# on the spore germination of E. rostratum Y9511

2.4 油類助劑的篩選

本試驗選用植物油作為油類助劑。添加不同油類助劑的培養(yǎng)基菌落直徑均低于對照，但在產(chǎn)孢量上有差異。其中，大豆油、花生油能促進嘴突凸臍蠕孢菌Y9511的產(chǎn)孢，大豆油產(chǎn)孢量略高于花生油（圖6）。葵花籽油、玉米油、稻米油則對嘴突凸臍蠕孢菌Y9511的產(chǎn)孢有抑制作用，葵花籽油的抑制效果最顯著（P＜0.05)，產(chǎn)孢量只有0.67×106孢子/mL。而從孢子萌發(fā)率的結(jié)果看，孢子粉和油類助劑比例為2:1時，6種油類助劑均對孢子萌發(fā)有促進作用，且大豆油和花生油的促進效果幾乎一致，無明顯差異（圖7）。但從市場成本考慮，大豆油的成本較低，綜合以上指標(biāo)，選擇大豆油作為油類助劑。

圖6 油類助劑對嘴突凸臍蠕孢菌落直徑和產(chǎn)孢量的影響Fig. 6 The influence of oil additives on colony diameter and spore production of E. rostratum Y9511

圖7 油類助劑種類對嘴突凸臍蠕孢菌Y9511孢子萌發(fā)的影響Fig. 7 The effect of oil additives on the spore germination of E. rostratum Y9511

大豆油與孢子粉的配比也會對孢子萌發(fā)有影響。圖8展示了5種不同的配比，其中孢子粉（mg）:溶劑油（mL）＝1:3與對照相比無顯著差異，其余配比均對孢子萌發(fā)起到促進作用，尤其是孢子粉（mg）:溶劑油（mL）＝2:1，萌發(fā)率達到75.67%。顯著高于對照，因此將兩者的配比確定為2:1時萌發(fā)效果最佳。

圖8 孢子粉與大豆油的比例對嘴突凸臍蠕孢菌Y9511孢子萌發(fā)的影響Fig. 8 The effect of the ratio of spore powder to soybean oil on the spore germination of E. rostratum Y9511

2.5 106孢子/mL嘴突凸臍蠕孢菌Y9511懸浮液最大吸收波長確定

106孢子/mL菌株Y9511懸浮液在340～1000 nm的波長范圍下，曲線先呈上升趨勢，在360 nm處達到峰值，后呈下降趨勢，由此可見，360 nm為其最大吸收波長（圖9）。

圖9 106孢子/mL嘴突凸臍蠕孢菌Y9511懸浮液在不同波長值下的吸光值Fig. 9 Absorbance values of E. rostratum Y9511 106 spores/mL suspension at different wavelengths

2.6 穩(wěn)定劑的篩選

不同的穩(wěn)定劑均對嘴突凸臍蠕孢菌Y9511的菌落直徑有一定抑制作用，而在產(chǎn)孢量上，添加了CMC-Na的培養(yǎng)基產(chǎn)孢量遠遠比對照要高，而添加了海藻酸鈉、海藻酸鉀的培養(yǎng)基中，產(chǎn)孢量均與對照相接近，無顯著性差異，可見CMC-Na對菌株Y9511產(chǎn)孢效果較好，而海藻酸鈉、海藻酸鉀對菌株Y9511產(chǎn)孢并無明顯影響（圖10）。

圖10 穩(wěn)定劑種類對嘴突凸臍蠕孢菌Y9511菌落直徑及產(chǎn)孢量的影響Fig. 10 The effect of stabilizer types on the colony diameter and spore production of E. rostratum Y9511

360 nm為最大吸收波長，在此波長下，在不同時間內(nèi)記錄三種穩(wěn)定劑的吸光度變化，擬合出四條曲線，比較穩(wěn)定性。圖11分別擬合了四條曲線：CK的K值為-0.0265、海藻酸鈉的K值為-0.0147、CMC-Na的K值為0.0597、海藻酸鉀的K值為0.0526。吸光值越大，表明溶質(zhì)粒子對光的吸收越多。正斜率越小，說明孢子粉在溶液中較穩(wěn)定；出現(xiàn)負(fù)斜率，說明孢子粉在逐漸下降，表現(xiàn)為對水的吸收，且負(fù)斜率越大，下降速度越快，穩(wěn)定性越差。CK和海藻酸鈉的曲線呈下降趨勢，但海藻酸鈉下降的幅度略小于CK，說明海藻酸鈉對孢子起到一定穩(wěn)定作用，但持續(xù)時間不長，后面的吸光值則表現(xiàn)為水分子對光的吸收。相反，海藻酸鉀和CMC-Na的曲線呈上升趨勢，海藻酸鉀的斜率小于CMC-Na，說明海藻酸鉀的穩(wěn)定效果比CMC-Na好，孢子能短時間穩(wěn)定在溶液體系中。三種穩(wěn)定劑溶液隨著放置時間增加，添加了海藻酸鈉的孢子溶液孢子很快就沉底了，添加了CMC-Na的孢子溶液孢子出現(xiàn)分層現(xiàn)象，而添加了海藻酸鉀的孢子溶液孢子仍能均勻、穩(wěn)定分散在溶液中。最終選用海藻酸鉀作為穩(wěn)定劑。

圖11 不同穩(wěn)定劑的穩(wěn)定性曲線Fig. 11 Stability curves of different stabilizers

不同濃度的海藻酸鉀溶液的懸浮率是不同的。隨著濃度上升，懸浮率也隨之上升，在0.05%的時候，懸浮率幾乎達到了80%（圖12）。海藻酸鉀的濃度影響孢子的萌發(fā)情況，孢子萌發(fā)率與濃度先呈正相關(guān)關(guān)系，然后呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，濃度為0.10%時，孢子萌發(fā)率最高，明顯比對照高，且與濃度0.30%沒有顯著性差異，0.50%以后的濃度，均抑制孢子萌發(fā)，孢子萌發(fā)率都顯著低于對照（圖13），但隨著海藻酸鉀的添加量增多，溶液變得越來越稠，可能會對孢子長時間放置產(chǎn)生一定的影響。結(jié)合兩個圖的數(shù)據(jù)和實際現(xiàn)象，最終將海藻酸鉀的濃度確定為0.10%。

圖12 不同濃度的海藻酸鉀的懸浮率變化Fig. 12 Suspension rate changes of different concentrations of potassium alginate

圖13 海藻酸鉀的濃度對嘴突凸臍蠕孢菌Y9511孢子萌發(fā)的影響Fig. 13 The effect of the concentration of potassium alginate on the spore germination of E. rostratum Y9511

3 討論

選擇良好的助劑，對于微生物農(nóng)藥制劑的開發(fā)至關(guān)重要。載體是微生物農(nóng)藥的主要輔助成分，制劑的一些性能指標(biāo)，如懸浮穩(wěn)定性和潤濕性等，在很大程度上取決于載體的相關(guān)性質(zhì)[19]。嘴突凸臍蠕孢菌的孢子粉如果長時間放置，就會粘結(jié)在一起，分散性和流動性相對較差，噴灑時因分布不均勻而造成同點侵染。本試驗中，珍珠巖促產(chǎn)孢的效果最為明顯，可能是因為珍珠巖作為一種惰性載體，能改善微生物的生長環(huán)境，延長孢子存活期限[20]。Fargues等[21]的試驗也得到了相似的結(jié)論。具體機制還需要進一步研究。

在農(nóng)藥使用過程中，表面活性劑有利于液滴在植物葉片形成最佳接觸角，使液滴不易從植物葉片滑落，滲透力度加大等，減少對農(nóng)藥的浪費[22-24]。但是，隨著表面活性劑濃度的增加，反而會抑制孢子萌發(fā)，我們不僅要選用合適的表面活性劑，還要注意其最適濃度。在本試驗中，農(nóng)乳500#幾乎完全抑制嘴突凸臍蠕孢菌Y9511生長，農(nóng)乳 500#分子結(jié)構(gòu)式為(C12H25C6H4SO3)2Ca，含有鈣元素，俞雯雯等[8]通過制備缺磷、硫、鉀、鐵、鎂培養(yǎng)基探究對嘴突凸臍蠕孢菌Y9511菌落直徑和產(chǎn)孢量的變化，但尚未制備缺鈣培養(yǎng)基，所以鈣元素是否抑制Y9511生長還需要做進一步探究。本試驗?zāi)壳爸谎芯苛艘环N表面活性劑的添加對嘴突凸臍蠕孢菌Y9511的影響，如有需要，可以考慮將所選的表面活性劑進行復(fù)配，增強乳化分散性。

嘴突凸臍蠕孢菌的體積較大，分生孢子為（50～120）×（12～22）μm[7]，如果長時間放在溶液中，會因為它自身的重力作用而沉淀下來，而且噴灑到環(huán)境中，可能會因為外界因素而出現(xiàn)性能下降等問題，所以，在制劑中需要添加一定量的穩(wěn)定劑，不僅能使孢子較長時間內(nèi)均勻懸浮在溶液中，還能在噴灑時，避免性能下降。本試驗中，0.1%的海藻酸鉀能在短時間內(nèi)使孢子均勻分散在油基中，但只測了1 h內(nèi)吸光值，室溫放置了2 h，為了商品化生產(chǎn)，要保證孢子粉能長時間懸浮穩(wěn)定，所以還需要延長放置時間。

本試驗只是篩選出了最佳的助劑，但還沒有得到最優(yōu)配方組合，且未對配制而成的制劑進行室內(nèi)防效測定。若要進行商品化生產(chǎn)，孢子粉的固體發(fā)酵必須要擴大培養(yǎng)，可以進一步優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵的方法[25]。