北京地區(qū)番茄青枯病健康和發(fā)病植株根際細(xì)菌群落比較分析

馬 榮，馬毅楠，王 星，谷醫(yī)林，魏海雷，張曉霞

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)微生物資源收集與保藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100081）

番茄青枯病是由茄科雷爾氏菌（Rasltonia solanacearum，簡稱青枯菌）引起的一種毀滅性土傳病害[1]，青枯菌寄主范圍廣泛，可侵染包括茄科植物在內(nèi)的400多種植物[2,3]。青枯病在我國番茄種植區(qū)大面積發(fā)生且危害嚴(yán)重，目前尚未發(fā)現(xiàn)高效的防治方法。生物防治因其對(duì)環(huán)境友好且高效的特點(diǎn)而備受關(guān)注。根際促生菌（Plant Growth-Promoting Rhizobacteria，PGPR）是主要的生防微生物資源，其特點(diǎn)為增加土壤微生物群落多樣性或增強(qiáng)植物對(duì)病原菌的抗性[4,5]。植物根際是植物根部與土壤之間動(dòng)態(tài)而復(fù)雜的界面，根際微生物是一種特定的微生物群落，對(duì)于植株的生長、健康和抵御病原菌的侵染有著重要作用[6,7]。青枯菌的入侵能夠破壞根際微生物群落組成[8]，導(dǎo)致根際土壤中的革蘭氏陽性菌（厚壁菌門和放線菌門）的失調(diào)進(jìn)而促進(jìn)了青枯病的發(fā)生[9]。因此，研究番茄健康與發(fā)病植株根際土壤微生物群落組成差異有助于深入了解青枯菌與其他群落成員之間的關(guān)系。此外，還可以利用構(gòu)建相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)的方法來探討根際微生物群落間的相互作用，在網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，相互作用的微生物成員之間的連接配置和分布可以對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的功能和穩(wěn)定性提供強(qiáng)有力的預(yù)測，也可以識(shí)別出菌群中占據(jù)重要位置的特定微生物[10,11]。

番茄是北京市設(shè)施蔬菜的重要果菜，對(duì)推動(dòng)農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化等方面起著極其重要的作用，由于青枯菌喜好高溫高濕的土壤環(huán)境，青枯病的發(fā)生大多集中在我國華中、華南和華東地區(qū)，而華北地區(qū)相對(duì)較少[12]，但隨著氣候和種植方式的變化，青枯病的發(fā)生已經(jīng)有北移的趨勢。此外，由于北京保護(hù)地常年連作，造成了嚴(yán)重的土壤生物障礙。本研究通過解析北京地區(qū)番茄青枯病發(fā)生的根際群落變化特征并結(jié)合分離培養(yǎng)篩選有利于番茄抗病促生的有益菌群，為青枯病的生物防控提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試病原菌：為實(shí)驗(yàn)室保藏的青枯菌Ralstonia solanacearumGMI1000。

番茄根際土壤樣品：采自北京市昌平區(qū)、順義區(qū)、通州區(qū)、大興區(qū)，具體采樣點(diǎn)見表1，各個(gè)采樣地點(diǎn)分別采集散土、健康和發(fā)病植株根際土壤，挖出整個(gè)根系，輕抖根系，收集緊密附著根上的土壤，即為根際土壤[13]。

表1 北京市番茄根際土壤采樣統(tǒng)計(jì)表Table 1 Area of sampling collection statistical of tomato rhizosphere soil in Beijing region

1.2 土壤理化性質(zhì)的測定

土壤理化性質(zhì)測定參照《土壤農(nóng)化分析》，土壤pH利用復(fù)合玻璃電極儀測定，土水比為1:2.5；利用電導(dǎo)率儀測定土壤電導(dǎo)率，土水比為1:5；有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀容量法-外加熱法；土壤全氮采用半微量開氏法；堿解氮采用堿解擴(kuò)散法；土壤全磷和有效磷采用鉬銻抗比色法；土壤全鉀和速效鉀采用火焰光度法；利用流動(dòng)分析儀測定土壤懸液的銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量[14]。

1.3 番茄根際土壤基因組的提取與檢測

利用FastDNA Spin Kit For Soil（MP）試劑盒提取DNA，首先稱取0.5 g土壤樣品，在滅菌后的研缽中利用液氮研磨至粉狀，裝入Lysing Matrix Etube 中，之后步驟按照MP試劑盒說明書進(jìn)行操作，利用核酸定量儀（NanoDrop 2000）測定DNA核酸濃度與純度，DNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 16S rRNA基因PCR擴(kuò)增及測序樣品的準(zhǔn)備

16S rRNA基因擴(kuò)增使用帶有不同barcode序列的通用引物V3-V4區(qū)534F（5'-CCAGCAGCCGCGGTA AT-3'）和 783R（5'-ACCMGGGTATCTAATCCKG-3'）[15]。PCR 體系（50 μL）：2×TaqPCR Mix 25 μL，534 F與783 R引物各2 μL，DNA 30 ng，ddH2O補(bǔ)足至50 μL；PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。使用OMEGA純化試劑盒進(jìn)行膠回收。用Nanodrop檢測已純化產(chǎn)物，按照Marker 250 bp條帶的凈光密度值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行等質(zhì)量DNA（150 ng）混樣，采用雙端Nova-PE 250模式進(jìn)行測序，由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

1.5 擴(kuò)增子數(shù)據(jù)處理和分析

將16S rRNA基因的下機(jī)測序數(shù)據(jù)（正向、反向序列文件）與barcode序列（txt文件）上傳至Galaxy平臺(tái)[16]；有序去除barcode序列與正反向引物序列；利用Flash工具將正反向序列拼接；去除非細(xì)菌序列后，按照97%的相似度水平生成OTU（Operational Taxonomic Units）表，借助在線平臺(tái)MicrobiomeAnalyst（https://www.microbiomeanalyst.ca/）[17]和 ImageGP（http://www.ehbio.com/ImageG/）[18]進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。選用Canonical Correspondence Analysis（CCA）對(duì)土壤養(yǎng)分和土壤細(xì)菌群落的相關(guān)性進(jìn)行分析，明確驅(qū)動(dòng)細(xì)菌群落發(fā)生變化的主要影響因子；利用Chao1、Shannon和Simpson指數(shù)來表征番茄根際土壤微生物群落α多樣性；基于Bray-Curtis距離對(duì)微生物群落相似性進(jìn)行主成分分析（Principle coordinate analysis PCoA）；基于SparCC算法進(jìn)行群落相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析，利用Gephi（v 0.9.2）軟件可視化；利用軟件SAS 9.4完成單因素方差分析。

1.6 根際細(xì)菌分離培養(yǎng)與16S rRNA基因測序分析

取5 g鮮土置于盛有玻璃珠和45 mL無菌水的三角瓶中，室溫120 r/min、振蕩30 min，取1 mL土壤懸液用無菌水進(jìn)行梯度稀釋，選取稀釋度10-4～10-6的土壤懸液各0.1 mL分別涂布在R2A培養(yǎng)基[19]，30 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，取單個(gè)菌落并進(jìn)一步純化。最后以20%甘油懸液保存在-80 ℃冰箱。采用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物27F和1492R[20]擴(kuò)增供試菌的16S rRNA基因片段。每個(gè)反應(yīng)體系25 μL：DNA 3 μL，引物各1 μL，2×TaqPCR Mix 12.5 μL，ddH2O 補(bǔ)至 25 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃變性 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2.5 min；35個(gè)循環(huán)后于4 ℃保存。PCR產(chǎn)物由生工生物公司（北京）進(jìn)行測序。將獲得的16S rRNA基因序列與EzBioCloud（https://www.ezbiocloud.net/identify）和GenBank （www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/）中菌株序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)鑒定。

1.7 根際細(xì)菌拮抗功能篩選

將病原菌在NA固體培養(yǎng)基[21]上活化，再轉(zhuǎn)接NA液體培養(yǎng)基，同時(shí)培養(yǎng)試驗(yàn)菌株，30 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后，離心去掉上清液，加入適量無菌水調(diào)至濃度為OD600≈1。取200 μL病原菌菌液涂布于NA平板上，晾干后，緩慢滴加10 μL試驗(yàn)菌株，每株菌株3個(gè)重復(fù)，30 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，觀察并測量抑菌圈。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同采樣地區(qū)的土壤理化性質(zhì)分析

對(duì)順義區(qū)、大興區(qū)、通州區(qū)和昌平區(qū)4個(gè)區(qū)的6個(gè)采樣地區(qū)的散土理化指標(biāo)進(jìn)行方差分析（表2），發(fā)現(xiàn)6個(gè)采樣地區(qū)的土壤養(yǎng)分均存在顯著性差異，其中興壽鎮(zhèn)（XS）地區(qū)樣品pH最高，為8.63，全氮、全磷、有機(jī)質(zhì)和堿解氮含量最低；大東各莊村（DDG）各個(gè)理化指標(biāo)較高，但其土壤鹽分含量顯著高于其他采樣地區(qū)，即土壤鹽漬化程度較重。

表2 不同采樣地土壤樣品的理化性質(zhì)比較Table 2 Comparison on the physical and chemical properties of soil samples at different sampling sites

2.2 土壤養(yǎng)分對(duì)不同采樣地細(xì)菌群落的影響

土壤養(yǎng)分與細(xì)菌群落相關(guān)分析結(jié)果表明（圖1），pH和速效磷是影響土壤細(xì)菌群落變異最顯著的環(huán)境因子，其次是速效鉀、EC、硝態(tài)氮、全氮和有機(jī)質(zhì)，而全鉀、全磷、堿解氮和銨態(tài)氮對(duì)細(xì)菌群落差異化的貢獻(xiàn)率較小。

圖1 土壤養(yǎng)分因子與散土細(xì)菌群落典型相關(guān)分析Fig. 1 Canonical correspondence analysis of relationship between soil nutrient factors with bulk soil bacterial community.Permutation test p value = 0.001

2.3 番茄根際土壤細(xì)菌群落的組成分析

北京6個(gè)地區(qū)36份番茄根際土壤樣品共產(chǎn)生777540條16S rRNA基因序列。利用RDP數(shù)據(jù)庫注釋后，6個(gè)地區(qū)的樣本共檢測到16個(gè)細(xì)菌門（圖2A，相對(duì)豐度大于1%的門類），各個(gè)地區(qū)番茄根際微生物群落以放線菌門（Actinobacteria 占比27%～46%）、變形菌門（Proteobacteria 占比21%～50%）和厚壁菌門（Firmicutes 占比7%～32%）為主。在屬水平（圖2B），大東各莊村（DDG）、姜屯（JT）和前桑園村（QSY）的番茄植株根際的優(yōu)勢菌群為芽胞桿菌屬，占比42%～56%；興壽鎮(zhèn)（XS）和王上村（WSC）的優(yōu)勢菌群為節(jié)細(xì)菌屬，占比16%～34%。所有采樣點(diǎn)中，僅東北臺(tái)村（DBTD和DBTH）和前桑園村（QSYD和QSYH）的健康和發(fā)病植株根際組成存在差異。整體來看，不同地區(qū)的番茄根際植株群落組成在屬水平的優(yōu)勢菌群不同，而同一地區(qū)的健康和發(fā)病植株根際組成差異較小。

圖2 各個(gè)地區(qū)健康和發(fā)病番茄根際土壤細(xì)菌群落組成比較（A：門水平，B：屬水平，樣品編號(hào)后的字母D和H分別是發(fā)病植株和健康植株）Fig. 2 Comparison of rhizosphere bacterial community composition of healthy and diseased tomato at different sampling sites (A: phylum level, B: genus level, the letters D and H after sample codes indicate the diseased and healthy plants respectively)

2.4 番茄根際土壤細(xì)菌群落多樣性分析

多樣性分析結(jié)果表明：健康植株根際群落Chao1、Shannon和Simpson指數(shù)均高于發(fā)病植株番茄根際土壤（圖3）。主成分分析結(jié)果表明，6個(gè)地區(qū)的番茄根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)顯著的區(qū)域性分布（P＜0.001,R2=0.46952，圖4A），同時(shí)樣品聚類分析也說明地域因素對(duì)于番茄根際細(xì)菌群體的影響大于病原微生物引起的群落結(jié)構(gòu)變化（圖4B）。

圖3 各個(gè)地區(qū)健康和發(fā)病番茄根際土壤微生物群落α多樣性分析Fig. 3 α diversity analysis of healthy and diseased tomato rhizosphere soil community at different sampling sites

圖4 各個(gè)地區(qū)番茄根際土壤微生物群落β多樣性分析和樣品聚類分析（A：主成分分析，B：樣品聚類分析）Fig. 4 β diversity and cluster analysis of tomato rhizosphere soil microbial community at different sampling sites

2.5 健康和發(fā)病植株根際細(xì)菌群落網(wǎng)絡(luò)相關(guān)性分析

在健康植株根際土壤的群落相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖中（圖5A），點(diǎn)元素和邊元素分別是93和113，正相互作用數(shù)量為71，負(fù)相互作用數(shù)量為42；在發(fā)病植株根際土壤的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖中（圖5B），點(diǎn)元素和邊元素分別是136和292，正相互作用數(shù)量為152，負(fù)相互作用數(shù)量為140。與健康番茄根際群落網(wǎng)絡(luò)相比，發(fā)病番茄根際群落網(wǎng)絡(luò)中的點(diǎn)元素和邊元素的數(shù)量均明顯升高，說明發(fā)病植株根際土壤的群落結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜且存在更多的相互作用，即微生物群落的平衡關(guān)系發(fā)生了變化。Bacillus在健康和發(fā)病植株根際細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)中都占據(jù)核心位置，且在發(fā)病植株根際細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)中與其他類群存在更多的互作關(guān)系（degree=14），而Stenotrophomonas，Lysinibacillus和Pseudoxanthomonas等類群僅在發(fā)病植株根際細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)核心位置。

圖5 健康和發(fā)病番茄根際群落相互作用的網(wǎng)絡(luò)（A：健康植株根際土壤，B：發(fā)病植株根際土壤，不同的顏色代表不同的模塊，黑色鏈接表示節(jié)點(diǎn)間的正交互作用，紅色鏈接表示負(fù)交互作用）Fig. 5 Network of rhizosphere community interactions between healthy and diseased tomato (A: rhizosphere soil of healthy plants, B:rhizosphere soil of diseased plants, different colors represent different modules, black links represent positive interactions between nodes,and red links represent negative interactions)

2.6 Ralstonia相關(guān)類群分析

基于健康和發(fā)病土壤微生物群落相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)與Ralstonia直接相關(guān)的微生物有15個(gè)屬（圖6），其中與Ralstonia呈正相關(guān)的屬有9個(gè)，分別是伯克霍爾德氏Burkholderia、索氏菌屬Thauera、根瘤菌屬Rhizobium、海洋芽胞桿菌屬Oceanobacillus、腸桿菌屬Enterobacter、侏儒囊菌屬Nannocystis、泛菌屬Pantoea、散生桿菌屬Patulibacter和柯恩氏菌屬Cohnella；與Ralstonia呈負(fù)相關(guān)的屬有6個(gè)，分別是芽胞桿菌屬Bacillus、寡養(yǎng)單胞菌屬Stenotrophomonas、氣微菌屬Aeromicrobium、噬冷菌屬Algoriphagus、珊瑚球菌屬Corallococcus和假黃單胞菌屬Pseudoxanthomonas。

圖6 Ralstonia與番茄根際群落中其它細(xì)菌的網(wǎng)絡(luò)相關(guān)分析Fig. 6 Network analysis of Ralstonia with other bacteria in tomato rhizosphere community

2.7 健康番茄根際土壤細(xì)菌的拮抗功能篩選

從健康番茄根際土壤中共分離得到 152株細(xì)菌，經(jīng)過拮抗功能篩選得到 14株（表3）對(duì)青枯菌R.solanacearumGMI1000具有拮抗作用的菌株（圖7），分別屬于無色桿菌屬Achromobacter、芽胞桿菌屬Bacillus、劍菌屬Ensifer、腸桿菌屬Enterobacter，賴氨酸芽胞桿菌屬Lysinibacillus、假單胞菌屬Pseudomonas、紅球菌屬Rhodococcus寡養(yǎng)單胞菌屬Stenotrophomonas和鏈霉菌屬Streptomyces。

圖7 14株根際細(xì)菌對(duì)青枯菌的拮抗活性測定Fig. 7 Antagonistic activity of 14 rhizosphere bacteria against Ralstonia solanacearum GMI1000

表3 青枯菌拮抗細(xì)菌鑒定結(jié)果Table 3 Isolation, culture and identification of bacteria from healthy tomato rhizosphere soil

3 討論

盡管青枯病不是北方設(shè)施番茄的主要病害，但由于全球變暖、連作障礙等因素的影響下，番茄青枯病具有北移的趨勢。本研究對(duì)順義、大興、通州、昌平4個(gè)區(qū)域6個(gè)采樣點(diǎn)的健康與發(fā)病番茄植株進(jìn)行研究，通過主成分分析和樣品聚類分析發(fā)現(xiàn)地域因素對(duì)于番茄根際細(xì)菌群體的影響更大，即不同區(qū)域相比較，土壤養(yǎng)分因子對(duì)微生物組成影響更顯著，但同一地區(qū)，青枯菌是根際細(xì)菌群落組裝的主要影響因子。已有報(bào)道表明，pH、有效性養(yǎng)分磷和氮及有機(jī)質(zhì)是調(diào)節(jié)根際群落組裝的主要因素且影響病害的發(fā)生[22-26]，Li等[27]首次證明土壤磷很可能通過微生物間的相互作用來促進(jìn)青枯菌對(duì)土壤和植物系統(tǒng)的入侵。本研究對(duì)環(huán)境因子相關(guān)性分析表明，pH和速效磷是影響土壤細(xì)菌群落變異最顯著的環(huán)境因子。有關(guān)病原菌侵染對(duì)微生物群落的影響，前人已有較多研究，Wei等[8]發(fā)現(xiàn)青枯菌的侵染會(huì)導(dǎo)致非致病細(xì)菌的多樣性下降，與該研究結(jié)果相似，本研究發(fā)現(xiàn)健康植株根際的Chao1、Shannon，Simpson多樣性指數(shù)均高于發(fā)病土壤，可能是由于病原菌的大量繁殖破壞了原有微生物群落的平衡。這些結(jié)果說明在抵抗青枯菌入侵的過程中不能忽略土壤養(yǎng)分對(duì)植株根際群落組裝的重要性，也預(yù)示著不同區(qū)域的生物防治需要采取不同的生物制劑。

通過構(gòu)建群落相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)拮抗病原菌的細(xì)菌已經(jīng)成為研究微生物互作關(guān)系的有效方法，這些相關(guān)的類群可能是病原菌的靶點(diǎn)或者是助手[10]，本研究通過構(gòu)建群落相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)15個(gè)與Ralstonia直接相關(guān)的菌屬。Hu等[10]在研究根內(nèi)生潛在致病性雷爾氏菌和其他微生物成員的相互作用網(wǎng)絡(luò)時(shí)發(fā)現(xiàn)伯克氏菌屬Burkholderia、根瘤菌屬Rhizobium、腸桿菌屬Enterobacter、散生桿菌屬Patulibacter、芽胞桿菌屬Bacillus和寡養(yǎng)單胞菌屬Stenotrophomonas等與Ralstonia直接相關(guān)，除此之外，本研究還發(fā)現(xiàn)另外9個(gè)與Ralstonia直接相關(guān)的菌屬，分別是索氏菌屬Thauera、海洋芽胞桿菌屬Oceanobacillus、侏儒囊菌屬Nannocystis、泛菌屬Pantoea、柯恩氏菌屬Cohnella、氣微菌屬Aeromicrobium、噬冷菌屬Algoriphagus、珊瑚球菌屬Corallococcus和假黃單胞菌屬Pseudoxanthomonas。以此為參考，篩選得到14株對(duì)青枯菌具有拮抗能力的菌株，分布在9個(gè)屬，其中芽胞桿菌屬、腸桿菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、假單胞桿菌屬和鏈霉菌屬的細(xì)菌已被用于青枯病的防治[28]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn) 3個(gè)可以抑制青枯菌生長但應(yīng)用較少的類群：無色桿菌屬Achromobacter、劍菌屬Ensifer和賴氨酸芽胞桿菌屬Lysinibacillus，這一發(fā)現(xiàn)增加了開發(fā)微生物制劑資源的多樣性，后續(xù)研究將重點(diǎn)通過構(gòu)建復(fù)合菌群用于青枯病的防治。