我國葡萄灰霉病菌對四霉素和啶酰菌胺的敏感性測定

田 秀，周連柱，黃曉慶，孔繁芳，王忠躍，甄志先,3*，張 昊*

（1. 河北農(nóng)業(yè)大學林學院，保定 071000；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所/植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193；3. 河北省林木種質(zhì)資源與森林保護重點實驗室，保定 071000）

葡萄是世界上廣泛種植的水果之一，由灰葡萄孢Botrytis cinerea侵染引起的灰霉病是葡萄生產(chǎn)上的主要病害，嚴重影響葡萄果實的品質(zhì)和產(chǎn)量[1]。近年來，隨著設(shè)施栽培的推廣和應用，葡萄灰霉病日趨嚴重，一般損失在20%左右，發(fā)病嚴重時病穗率可達40%以上，有些地區(qū)或品種甚至造成絕收[2]。目前，化學防治是灰霉病田間防治的主要手段。但隨著殺菌劑的大量和高頻次使用，葡萄灰霉病菌對殺菌劑的抗性日趨嚴重。據(jù)報道，目前該病原菌已對苯并咪唑類、二甲酰亞胺類、煙酰胺類以及咪唑類等多種殺菌劑產(chǎn)生了抗性[3-5]，亟需篩選高效安全的葡萄灰霉病防治藥劑。

啶酰菌胺屬于琥珀酸脫氫酶抑制劑類殺菌劑，于 2008年在我國登記注冊，已廣泛用于防治蔬菜、果樹等作物的灰霉病等[6]，這類藥劑主要通過抑制病原菌琥珀酸脫氫酶的活性，阻礙其能量代謝，從而抑制病原菌的生長[7]。但由于其作用位點單一，長期廣泛地使用容易產(chǎn)生田間抗性菌株，國際殺菌劑抗性委員會（Fungicide Resistance Action Committee，F(xiàn)RAC）已將其歸為中等至高抗性風險殺菌劑[8]。啶酰菌胺是此類殺菌劑中的重要產(chǎn)品，故其抗性風險備受關(guān)注。目前，已有部分地區(qū)的灰霉病菌對啶酰菌胺產(chǎn)生了抗性[9]。明確不同葡萄產(chǎn)區(qū)灰霉病菌對啶酰菌胺的敏感性，對于指導科學用藥具有重要意義。

隨著無公害、綠色和有機食品的發(fā)展，生物農(nóng)藥逐漸成為未來農(nóng)藥的發(fā)展方向之一。四霉素又稱梧寧霉素，是一種廣譜且高效低毒的農(nóng)用抗生素類殺菌劑。四霉素不僅可以有效防治子囊菌、擔子菌和半知菌引起的病害[10]，還可以誘導寄主體內(nèi)苯丙氨酸解氨酶、過氧化物酶和多酚氧化酶等防御酶系活性升高[11]，從而提高寄主植物對病原菌的抗性。該藥劑在我國于 2016年登記用于防治水稻立枯病、小麥白粉病和赤霉病、楊樹潰瘍病等[12]。目前，已發(fā)現(xiàn)四霉素對蔬菜菌核病菌[13]、番茄葉霉病菌[14]及辣椒疫霉病菌[15]等具有較好的抑菌活性及防治效果。但對灰霉病菌的防治效果報道較少，Song等[16]研究表明四霉素對草莓及黃瓜灰霉病均具有較好的預防和治療效果。由于不同寄主植物上的灰葡萄孢病菌存在遺傳分化[17]，四霉素對葡萄灰霉病菌的抑制活性尚不明確。

云南省賓川縣、湖北省武漢市和遼寧省北鎮(zhèn)市分別位于我國西南地區(qū)、長江中游地區(qū)和環(huán)渤海灣地區(qū)，是我國重要葡萄栽培區(qū)[18]。葡萄灰霉病是各地的主要防治對象之一。隨著灰霉病菌抗藥性問題日益突出，高效安全殺菌劑的篩選對葡萄灰霉病的田間防控具有重要指導意義。為此，本試驗分別采用菌絲生長速率法和孢子萌發(fā)法，檢測上述地區(qū)葡萄灰霉病菌對四霉素和啶酰菌胺的敏感性，并分析兩種藥劑之間的交互抗性關(guān)系。以期為四霉素和啶酰菌胺在防治葡萄灰霉病上的應用提供理論依據(jù)，減少灰霉病造成的經(jīng)濟損失。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試病原菌 本試驗所用葡萄灰霉病菌為2016-2017年采集自我國云南省賓川縣、湖北省武漢市和遼寧省北鎮(zhèn)市的葡萄主產(chǎn)區(qū)并保存在中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所葡萄病害創(chuàng)新任務(wù)實驗室的菌株，共60株（表1）。

表1 不同地區(qū)葡萄灰霉病菌對四霉素的敏感性Table 1 Sensitivity to tetramycin of B. cinerea in different areas

1.1.2 供試藥劑 四霉素：0.3%的四霉素水劑，由遼寧微科生物工程股份有限公司提供。啶酰菌胺：中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所農(nóng)藥中心提供的98.5%原藥，溶于100%的甲醇，配制成10 mg/mL的母液。

1.1.3 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato Dextrose Agar，PDA）：將馬鈴薯去皮、洗凈吸干水分稱取200 g，切成1 cm的土豆塊放入1 L 去離子水中煮至熟透，用紗布過濾掉馬鈴薯，加入20 g葡萄糖，20 g瓊脂，加熱并攪拌至全部溶解，加ddH2O定容至1 L，用錐形瓶分裝后于121 ℃滅菌20 min；2%水瓊脂培養(yǎng)基（Water Agar，WA）：20 g瓊脂，加ddH2O定容至1 L，用錐形瓶分裝后于121 ℃滅菌20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 葡萄灰霉病菌對四霉素的敏感性測定 采用菌絲生長速率法測定葡萄灰霉病菌對四霉素的敏感性。四霉素敏感性檢測濃度為0.025、0.1、0.2、0.4、0.8和1 μg/mL。將供試藥劑分別按上述比例與經(jīng)高溫滅菌的PDA培養(yǎng)基混合制成所需濃度的含藥PDA平板。將已活化的灰霉菌接種于普通PDA平板上，22 ℃下培養(yǎng)3 d，用直徑5 mm的打孔器沿菌落邊緣打取菌餅，表面朝下接種于含藥PDA平板上，以無藥PDA為對照，置于22 ℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每個處理重復3次。3 d后待對照組菌落直徑達到平板的3/4時，采用十字交叉法測量菌落直徑，并計算抑制率、有效抑制中濃度（EC50）及EC50變異系數(shù)（Variation factor，VF）。其中抑制率（%）＝（對照菌落直徑－處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100，EC50變異系數(shù)＝最大EC50值/最小 EC50值。

1.2.2 葡萄灰霉病菌對啶酰菌胺的敏感性測定 采用孢子萌發(fā)法測定葡萄灰霉病菌對啶酰菌胺的敏感性。將活化好的灰霉菌株接種到PDA平板上培養(yǎng)10 d，待其產(chǎn)孢后，使用無菌水將孢子洗脫，雙層紗布對孢子懸浮液進行過濾，并使用血球計數(shù)板在光學顯微鏡下將孢子懸浮液濃度調(diào)至1×106孢子/mL。將啶酰菌胺按比例與WA培養(yǎng)基充分混勻后緩慢倒入60 mm培養(yǎng)皿中制成含藥平板，啶酰菌胺濃度分別設(shè)置為0.25、0.5、1、5、10和20 μg/mL。在不同濃度的含藥平板上，吸取40 μL孢子懸浮液均勻涂布開，以無藥平板為對照，每個處理重復3次。在22 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 h后，用顯微鏡觀察并統(tǒng)計孢子的萌發(fā)情況，當孢子的芽管長度大于孢子短半徑時視為萌發(fā)，每個平板觀察100個孢子。按計算孢子萌發(fā)率，抑制率，EC50值及其變異系數(shù)。其中，萌發(fā)率（%）＝萌發(fā)孢子數(shù)/觀察孢子總數(shù)×100，抑制率（%）＝（對照孢子萌發(fā)率－處理孢子萌發(fā)率）/對照孢子萌發(fā)率×100，變異系數(shù)＝最大EC50值/最小EC50值。

根據(jù)建立的葡萄灰霉病菌對啶酰菌胺的敏感基線，分析上述葡萄灰霉病菌對啶酰菌胺的抗性頻率與抗性水平，其中抗性頻率（%）＝抗性菌株個數(shù)/菌株總數(shù)×100；抗性因子（Resistance Factor，RF）＝菌株EC50/敏感基線?？剐苑旨墭藴蔥19]如下：RF＜5為敏感（S）；5≤RF＜20為低抗 ；20≤RF＜100為中抗；RF≥100為高抗。

1.2.3 葡萄灰霉病菌對四霉素和啶酰菌胺的交互抗性關(guān)系 將上述60株葡萄灰霉病菌對四霉素和啶酰菌胺的EC50對數(shù)值進行相關(guān)性分析，根據(jù)相關(guān)系數(shù)r與P的值確定四霉素與啶酰菌胺之間是否存在交互抗性關(guān)系。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 使用SPSS 25.0軟件進行下列數(shù)據(jù)分析；分別計算四霉素及啶酰菌胺對灰霉病菌菌絲生長及孢子萌發(fā)的有效抑制中濃度（EC50）；采用Fisher最小顯著差檢驗比較不同地區(qū)間的平均EC50之間的差異，P＜0.05存在顯著差異；將啶酰菌胺和四霉素EC50值轉(zhuǎn)換成lgEC50后，采用皮爾遜相關(guān)性分析評估二者之間的交互抗性。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄灰霉病菌對四霉素的敏感性

采用菌絲生長速率法測定了60株葡萄灰霉病菌對四霉素的敏感性（表1），其中四霉素抑制菌絲生長的EC50值范圍為0.075～0.433 μg/mL，平均EC50值為（0.245±0.065）μg/mL。變異系數(shù)（VF）為5.773，病菌的EC50值整體呈一條單峰曲線（圖1），正態(tài)性檢驗結(jié)果表明供試的60株葡萄灰霉病菌對四霉素的EC50值符合正態(tài)分布。因此，該病菌群體的 EC50均值可作為葡萄灰霉病菌對四霉素的敏感基線。不同地區(qū)間葡萄灰霉病菌對四霉素的EC50值無顯著差異（P＞0.05，表1）。

圖1 四霉素對60株葡萄灰霉病菌對的EC50值分布Fig. 1 Distribution of EC50 values for tetramycin against 60 B.cinerea isolates

2.2 葡萄灰霉病菌對啶酰菌胺的敏感性情況

采用孢子萌發(fā)法測定了60株葡萄灰霉病菌對啶酰菌胺的敏感性（表2），其中啶酰菌胺抑制孢子萌發(fā)的EC50值范圍為0.249～11.876 μg/mL，變異系數(shù)（VF）為47.695，病菌的EC50值整體呈非連續(xù)性分布，表明葡萄灰霉病菌對啶酰菌胺的敏感性存在一定分化，部分菌株已產(chǎn)生抗藥性。通過對灰霉病菌EC50值分布頻率進行分析，發(fā)現(xiàn)灰霉病菌的EC50值主要分布在0.25～2.64 μg/mL，且在該區(qū)間其敏感性頻率分布符合正態(tài)分布（圖2），通過對這一區(qū)間內(nèi)的菌株提取得到41株，通過計算求得其平均EC50值為（1.115±0.579）μg/mL，以此平均值作為葡萄灰霉病菌對啶酰菌胺的敏感基線。并且，不同地區(qū)間葡萄灰霉病菌對啶酰菌胺的EC50值無顯著差異（P＞0.05）。

表2 不同地區(qū)葡萄灰霉病菌對啶酰菌胺的敏感性Table 2 Sensitivity to boscalid of B. cinerea in different areas

圖2 啶酰菌胺對41株葡萄灰霉病菌的EC50值分布Fig. 2 Distribution of EC50 values for Boscalid against41 B.cinerea isolates

根據(jù)建立的啶酰菌胺敏感基線，發(fā)現(xiàn)上述3個地區(qū)的60株葡萄灰霉病菌中共有7株抗性菌株，總體抗性頻率為11.7%，且全部為低抗菌株。其中云南賓川縣共有3株低抗菌株，抗性頻率為15%，其他兩個地區(qū)均發(fā)現(xiàn)了2株低抗菌株，抗性頻率為10%，表明整體抗性水平較低（表3）。

表3 不同地區(qū)葡萄灰霉病菌啶酰菌胺抗性菌株的分布和數(shù)量Table 3 Distribution and number of Boscalid-resistant B. cinerea from different areas

2.3 葡萄灰霉病菌對四霉素和啶酰菌胺的交互抗性分析

將上述灰霉病菌對四霉素的lgEC50值與啶酰菌胺的lgEC50值進行皮爾遜相關(guān)分析（圖3），結(jié)果顯示皮爾遜相關(guān)系數(shù)r為-0.040（P＞0.05），表明四霉素與啶酰菌胺的相關(guān)性未達到顯著水平，二者之間不存在交互抗性關(guān)系。

圖3 葡萄灰霉病菌對四霉素和啶酰菌胺的交互抗性Fig. 3 Cross resistance of B. cinerea to tetramycin and boscalid

3 討論

葡萄灰霉病是世界上葡萄重要病害之一，該病原菌在葡萄的生長期和貯藏期均能進行侵染，低溫高濕環(huán)境下容易大面積發(fā)生，造成的經(jīng)濟損失高達50%[2]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中灰霉病的防治主要以化學防治為主，由于灰葡萄孢菌具有遺傳變異大、繁殖速率快和適合度高等特點，在連續(xù)多年單一使用某一種殺菌劑后，極易使病原菌產(chǎn)生抗藥性及交互抗性[20]。研究發(fā)現(xiàn)，我國很多地區(qū)的葡萄灰霉病菌已對多菌靈、腐霉利、乙霉威和嘧霉胺等產(chǎn)生了抗藥性，甚至出現(xiàn)了“雙抗”甚至“多抗”灰霉菌菌株[3-5]。如 2021年賈爽爽等[5]發(fā)現(xiàn)黑龍江省和云南省葡萄灰霉病菌對多菌靈的抗性頻率接近 100%，抑菌脲以及對兩種殺菌劑的多藥抗性頻率平均也達到70%以上。因此，該病害高效、無公害藥劑的篩選工作也就顯得尤其重要。

本研究表明，葡萄灰霉病菌對啶酰菌胺的敏感性基線為1.115±0.579 μg/mL，并且云南省、湖北省和遼寧省等3個地區(qū)灰霉菌株對啶酰菌胺的敏感性無顯著差異，表明啶酰菌胺對葡萄灰霉病菌具有較高的抑菌活性，可作為后續(xù)田間抗藥性檢測的依據(jù)。本研究建立的葡萄灰霉病菌對啶酰菌胺的敏感基線低于魏佳爽等[21]測定的番茄灰霉病菌的敏感基線（2.56 μg/mL），這可能與不同作物上的灰霉病菌存在變異有關(guān)。盡管本研究測定的大多數(shù)菌株對啶酰菌胺仍表現(xiàn)敏感，但田間抗藥性菌株的出現(xiàn)表明采用該藥劑防治葡萄灰霉病具有一定的風險性。2019年，宋昱菲[22]檢測了山東省灰霉病菌對啶酰菌胺、吡唑萘菌胺、氟唑菌酰胺、苯并烯氟菌唑、氟吡菌酰羥胺和氟吡菌酰胺6種琥珀酸脫氫酶抑制劑的抗性情況，發(fā)現(xiàn)除了啶酰菌胺之外，灰霉病菌對其他5種琥珀酸脫氫酶抑制劑也存在不同程度的抗性，各藥劑之間存在顯著的交互抗性。因此，田間使用時應注意限制同一生長季的用藥次數(shù)，并與不同作用機制的殺菌劑交替或混合使用，以減小對田間種群的選擇性壓力，延緩病原菌對該類藥劑的抗性發(fā)展。

四霉素對灰霉病菌的毒力試驗結(jié)果顯示，四霉素抑制菌絲生長的EC50值范圍為0.075～0.433 μg/mL，平均EC50值為0.245±0.065 μg/mL，變異系數(shù)為5.773，表明四霉素對灰霉病菌的敏感性范圍窄[23]，這可能與該類藥劑在葡萄灰霉病防治中未正式使用有關(guān)。宋瑩瑩等[24]測定了黃瓜、草莓及葡萄等不同作物上灰霉病菌對四霉素的敏感性，也得到了相似的結(jié)果（敏感基線0.35±0.20 μg/mL），表明葡萄灰霉病菌對四霉素表現(xiàn)出較高的敏感性。并且我們發(fā)現(xiàn)其與啶酰菌胺之間不存在交互抗性。因此，四霉素作為一種低毒對環(huán)境安全的生物源農(nóng)藥，用于防治葡萄灰霉病具有很大的應用潛力，可作為候選藥劑單獨或與啶酰菌胺等其它類型的藥劑混配使用，以避免或延緩病菌抗藥性的產(chǎn)生，提高防治效果。后續(xù)將進一步通過田間藥效試驗驗證四霉素的防治效果，為該藥劑用于葡萄灰霉病田間防治提供科學依據(jù)。