益生菌發(fā)酵對(duì)中藥總黃酮與總多糖含量的影響

趙玉潔，鄒 悅，周金羽，甄明哲，潘潤(rùn)蕾，單琢睿，崔一喆

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江大慶 163319)

中草藥不僅有著良好的藥效，且相比于人工合成化學(xué)藥物有著更小的毒副作用，少殘留，環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。中藥發(fā)酵是將天然藥物(中藥材)經(jīng)處理后以?xún)?yōu)選的腸道益生菌菌群中一種或幾種、一株或幾株益生菌作為菌種，利用微生態(tài)學(xué)、仿生學(xué)的方法，通過(guò)生物嫁接的方式，對(duì)提取的中藥有效成分進(jìn)行生物學(xué)轉(zhuǎn)化，將中藥的大分子物質(zhì)，經(jīng)過(guò)微生物轉(zhuǎn)化成小分子成分，使藥材的性能、治療作用大為改變[1]。常用的益生菌主要有酵母菌、益生芽孢菌、丁酸梭菌、乳桿菌、雙歧桿菌等。其中枯草芽孢桿菌菌體自身可以合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等酶類(lèi)，發(fā)揮消化酶的作用，對(duì)植物性碳水化合物有較強(qiáng)的分解能力[2]。乳酸桿菌可以發(fā)酵碳水化合物并產(chǎn)生大量乳酸，在自然界分布廣泛，且該類(lèi)群細(xì)菌絕大多數(shù)對(duì)動(dòng)物和人無(wú)毒、無(wú)害，不僅可以加快蛋白質(zhì)、乳糖和鈣等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，產(chǎn)生多種維生素為機(jī)體消化吸收所利用，還可以抑制腸道內(nèi)腐敗菌、致病菌的繁殖，降低血氨和血中膽固醇的含量[3]，這兩種益生菌均有可能促進(jìn)中藥使用效率的功能。在之前的實(shí)驗(yàn)中[4]，使用了藿香、半枝蓮、陳皮、甘草這四味中藥對(duì)奶牛酮病進(jìn)行過(guò)治療，實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，采用了枯草芽孢桿菌及乳酸桿菌對(duì)這四味藥材發(fā)酵提取，并進(jìn)行有效成分含量測(cè)定，以各提取液中總黃酮含量及多糖含量為指標(biāo)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)對(duì)比，分析各提取方式的可行性。

1 材料與方法

1.1 藥材與試劑 實(shí)驗(yàn)所用的半邊蓮、陳皮、藿香、甘草均選購(gòu)于成都市荷花池中藥材批發(fā)市場(chǎng)；植物乳酸桿菌(海博生物技術(shù)有限公司，批號(hào)20210414)；枯草芽孢桿菌(海博生物技術(shù)有限公司，批號(hào)20210414)；蘆丁(上海源葉生物科技有限公司，T20 N11Z131674)。

1.2 主要儀器與設(shè)備 震蕩培養(yǎng)箱(浙江華源儀器有限公司)；SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺(tái)(上海滬凈醫(yī)療器械有限公司)；DK-8D型電熱恒溫水槽(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；DRP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；V-5000可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)。

1.3 菌種接種 本實(shí)驗(yàn)細(xì)菌選用LB肉湯液體培養(yǎng)基接種。取LB培養(yǎng)基2.5 g倒入錐形瓶中，加入100 mL純水溶解，再經(jīng)高壓滅菌鍋121 ℃，滅菌30 min。滅菌后將培養(yǎng)基倒入兩個(gè)試管中，并用試管塞塞好，分別編號(hào)1號(hào)和2號(hào)。待冷卻后接入菌種。

本實(shí)驗(yàn)選用枯草芽孢桿菌和乳酸桿菌，乳酸桿菌為液體菌種，枯草芽孢桿菌為磁珠吸附式菌種。在無(wú)菌操作臺(tái)，培養(yǎng)基及各實(shí)驗(yàn)操作儀器經(jīng)紫外滅菌30 min，操作者經(jīng)酒精消毒。點(diǎn)燃酒精燈，取1號(hào)試管，管口與試管塞經(jīng)酒精燈外焰滅菌消毒，再取鑷子同樣經(jīng)過(guò)酒精火焰，鑷子冷卻后夾取枯草芽孢桿菌冷凍管中占有菌液的磁珠，放入1號(hào)培養(yǎng)基中浸潤(rùn)，完成接種。再取2號(hào)培養(yǎng)基，同樣方式經(jīng)酒精燈火焰消毒，取一次性接種環(huán)蘸取乳酸桿菌菌液，浸入2號(hào)培養(yǎng)基中，完成接種。將接菌完畢的1號(hào)與2號(hào)培養(yǎng)基37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 獲得菌液。

1.4 中藥發(fā)酵 將藿香、半枝蓮、陳皮、甘草四味中藥分別使用中藥粉碎機(jī)(巴菱200型，編號(hào)32594356444)粉碎，過(guò)60目篩得到中藥粉劑。將每一種中藥分為枯草芽孢桿菌發(fā)酵組，乳酸桿菌發(fā)酵組，對(duì)照組(不加菌)三組，每組設(shè)有三個(gè)重復(fù)。

1.4.1 接菌發(fā)酵 稱(chēng)取三份藿香均為4 g，分別加入三個(gè)錐形瓶中，并標(biāo)號(hào)(藿+枯草，藿+乳酸，藿對(duì)照)。三組中均加入40 mL純水，對(duì)照組只加水和中藥。在葉思勇等人的研究中[5]，選擇出最佳的發(fā)酵條件?？莶萁M和乳酸組分別準(zhǔn)確加入1.6 mL的枯草芽孢桿菌菌液或乳酸桿菌菌液(4%濃度)，混合均勻呈糊狀，接著進(jìn)行37 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min搖床培養(yǎng)72 h(3 d)。半枝蓮，陳皮，甘草操作方式同上。中藥發(fā)酵液制備完畢后，放入搖床培養(yǎng)3 d。

1.4.2 樣品液制備 中藥粉發(fā)酵培養(yǎng)完畢后，將發(fā)酵液用紗布過(guò)濾，取濾渣，精密稱(chēng)取3 g，放入圓底燒瓶中，加入250 mL的70%乙醇溶液，80 ℃下冷凝回流1 h 40 min，冷卻后，紗布過(guò)濾，取濾液，70%乙醇溶液定容至250 mL，作為樣品液。分裝，4 ℃下冷藏。

1.5 總黃酮含量的測(cè)定

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱(chēng)取蘆丁對(duì)照品13.2 mg，加入60%乙醇溶解并定容至15 mL量瓶中，制得0.528 mg/ml蘆丁對(duì)照品溶液。

精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液0 mL、0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL于15 mL離心管中，每管分別加入3 mL、2.5 mL、2 mL、1.5 mL、1 mL的60%乙醇(即：分別定容至3 mL)。每管加1 mL 5%亞硝酸鈉溶液搖勻，靜置6 min；再各加1 mL 5%硝酸鋁溶液搖勻，靜置6 min；再加4%氫氧化鈉溶液10 mL搖勻，最后將各管用60%乙醇定容到15 mL。靜置15 min得到對(duì)照品提取液。

1.5.2 對(duì)照品的測(cè)定 根據(jù)查閱文獻(xiàn)可知[6]，510 nm波長(zhǎng)總黃酮吸光值最大，故將上述各提取液用分光光度計(jì)測(cè)量吸光度，并計(jì)算對(duì)應(yīng)的蘆丁質(zhì)量濃度，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 對(duì)照品總黃酮含量測(cè)定相關(guān)數(shù)據(jù)Tab 1 Determination related data of total flavonoids content of reference substance

以蘆丁質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，吸光度(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算樣品液中總黃酮濃度，再進(jìn)一步計(jì)算黃酮提取率。得到總黃酮濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=21.534x-0.063，R2=0.9923。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 總黃酮含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 1 Standard curve of total flavonoids content

1.5.3 樣品總黃酮含量測(cè)定 取1.4.2中制好的樣品液5 mL至10 mL離心管中，再加入5 mL的60%乙醇溶液(稀釋2倍)。另取4個(gè)10 mL離心管加入稀釋液1 mL，其中一份加入60%乙醇4.6 mL，作為參比溶液，另外三份為均為測(cè)量溶液。

1.5.3.1 樣品液總黃酮提取 三份測(cè)量溶液中各加入0.3 mL的5%亞硝酸鈉溶液搖勻，靜置6 min；再各加0.3 mL的10%硝酸鋁溶液搖勻，靜置6 min；再各加4 mL的10%氫氧化鈉溶液搖勻，靜置15 min。

1.5.3.2 樣品液總黃酮測(cè)定 510 nm處，由分光光度計(jì)測(cè)量三份測(cè)量溶液的吸光度，并取其平均值，帶入回歸方程得濃度數(shù)據(jù)，再根據(jù)公式計(jì)算其總黃酮含量。

1.5.3.3 樣品總黃酮濃度計(jì)算 已知方程：樣品總黃酮含量(mg/g)=X*n*V1/(V*W)

式中：X—測(cè)出的濃度(mg/mL)

n—稀釋倍數(shù)

V1—樣液總體積(mL)

V—測(cè)定時(shí)取樣體積(mL)

W—樣品質(zhì)量(g)

由上述標(biāo)準(zhǔn)方程求得提取液中總黃酮濃度，再由總黃酮含量(mg/g)計(jì)算公式求得提取液總黃酮含量。

1.6 總多糖的測(cè)定

1.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 稱(chēng)取4 mg干燥恒重的無(wú)水葡萄糖，溶解于40 mL蒸餾水中得到0.1 mg/ml葡萄糖溶液。

精密量取葡萄糖對(duì)照品溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，分別放置于5支10 mL離心管中，分別精密加入純水(1.8 mL、1.6 mL、1.4 mL、1.2 mL、1.0 mL)，定容至2 mL。各加入4%苯酚溶液1 mL搖勻，再加入7 mL濃硫酸搖勻，40 ℃恒溫水浴30 min，再至冷水浴5 min。取提液2 mL至離心管，再加入70%乙醇溶液2 mL稀釋兩倍搖勻，倒入5 mL比色皿中。

1.6.2 對(duì)照品的測(cè)定 根據(jù)查閱文獻(xiàn)可知[7]，490 nm處多糖吸光值最大，故在490 nm處測(cè)定對(duì)照品各提取液的吸光度并記錄。結(jié)果如表2。

表2 葡萄糖對(duì)照品總多糖含量的測(cè)定Tab 2 Determination of total polysaccharide content of glucose reference substance

以490 nm處多糖含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)方程。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算樣品液中總多糖濃度，再進(jìn)一步計(jì)算多糖提取率。得到總多糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=81.55x+0.3243，R2=0.9878。結(jié)果如圖2。

圖2 總多糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 2 Standard curve of total polysaccharide concentration

1.6.3 樣品總多糖含量測(cè)定 取1.4.2中制備好的樣品液3份各2 mL，分別加入4%苯酚1 mL搖勻，再加入濃硫酸7 mL搖勻，40 ℃恒溫水浴30 min，后冷水浴5 min。取提液2 mL，再加入2 mL的70%乙醇溶液稀釋2倍搖勻，加入5 mL比色皿。在490 nm處測(cè)定其吸光度，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線得其濃度數(shù)據(jù)，三次結(jié)果取平均值，根據(jù)公式換算成總多糖含量。

已知方程：W=(C*V1*n)/M*V2

式中：W—可溶性總多糖含量(mg/g)

C—標(biāo)準(zhǔn)方程求得的糖量

V1—提取液量

n—稀釋倍數(shù)

V2—吸取樣品液體積

M—樣品重量

由上述標(biāo)準(zhǔn)方程求得樣品多糖濃度，并帶入多糖含量計(jì)算公式求得樣品液可溶性總多糖含量。

2 結(jié) 果

在510 nm處測(cè)得樣品總黃酮吸光度范圍：0.037～0.91，而上述黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍：-0.12～1.11，故實(shí)驗(yàn)測(cè)得各提取液吸光度均在該范圍內(nèi)，則可由總黃酮含量公式計(jì)算出樣品總黃酮含量，最終測(cè)量結(jié)果如表3。

在490 nm處測(cè)得樣品總多糖吸光度范圍：0.12～1.217，其中藿香水提液、半枝蓮乳酸桿菌提取液、半枝蓮水提液、陳皮三種提取液、甘草乳酸桿菌提取液測(cè)得的吸光度符合標(biāo)準(zhǔn)曲線要求，其余提液因數(shù)值過(guò)小無(wú)法記錄，推測(cè)由于實(shí)驗(yàn)稀釋倍數(shù)過(guò)高導(dǎo)致吸光度過(guò)小無(wú)法計(jì)算。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，測(cè)得SD值，精密度良好。最終測(cè)量結(jié)果如表3。

表3 樣品有效成分測(cè)量情況Tab 3 Measurement of active ingredients of samples

發(fā)酵液低于水提液提取量：半枝蓮、陳皮、甘草三味藥材經(jīng)枯草芽孢桿菌及乳酸桿菌發(fā)酵后提取和藿香枯草芽孢桿菌發(fā)酵提取出的總黃酮含量低于它們的水提液提取量，其中陳皮的兩組菌發(fā)酵液減幅最大，藿香枯草芽孢桿菌發(fā)酵液減幅微弱，半枝蓮、甘草的兩組菌發(fā)酵液都有明顯減幅；陳皮乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌發(fā)酵提取液的總多糖含量也低于其水提液含量，其中陳皮枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的總多糖含量減幅最大。

發(fā)酵液高于水提液提取量：藿香乳酸桿菌發(fā)酵液的總黃酮含量微高于其水提液中總黃酮量；半枝蓮、甘草的乳酸桿菌發(fā)酵液中總多糖含量明顯高于其水提液中總多糖量。

枯草芽孢桿菌和乳酸桿菌發(fā)酵情況對(duì)比：枯草芽孢桿菌對(duì)藿香、半枝蓮、陳皮、甘草四味藥材的有效成分提取均有抑制作用，即：枯草芽孢桿菌更容易抑制上述藥材有效成分的釋放；乳酸桿菌僅對(duì)半枝蓮、陳皮、甘草三味藥材的總黃酮提取及陳皮總多糖提取產(chǎn)生明顯的抑制作用，而對(duì)半枝蓮、甘草的多糖提取都產(chǎn)生明顯促進(jìn)作用，故乳酸桿菌可能更利于部分藥材的多糖釋放。

有效成分提取量的對(duì)比：以上四味中藥提取液中陳皮水提液中總黃酮含量最高(95.06 mg/g),陳皮水提液中總多糖含量最高(309.33 mg/g)

3 分析與討論

經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)量后，部分藥材總多糖提取液得到的吸光度值極小，超出了多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍，故未進(jìn)行計(jì)算，因而得出這部分藥材中總多糖含量不高或提取方法未達(dá)到最優(yōu)從而導(dǎo)致藥材不能釋放更多有效成分。

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)了發(fā)酵后有效成分產(chǎn)量低于未發(fā)酵產(chǎn)量，多糖含量過(guò)低等異?，F(xiàn)象，就本實(shí)驗(yàn)而言，作出以下幾點(diǎn)分析：

3.1 藥物本身的原因 對(duì)藥材本身而言不是所有中藥都適合微生物發(fā)酵，曾有學(xué)者對(duì)五十多種藥材進(jìn)行枯草芽孢桿菌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)[8]，大部分藥材的藥效無(wú)顯著變化，苦參等藥材的藥效大大降低，不能否認(rèn)藥效的降低與發(fā)酵中有效成分的減少無(wú)關(guān)，這也證實(shí)了本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵后幾味中藥的總黃酮和總多糖含量顯著降低的現(xiàn)象。

中藥本身的有效成分種類(lèi)豐富，例如陳皮，富含黃酮類(lèi)成分?jǐn)?shù)十種，陳皮苷含量可占總含量的50%以上[9]，本實(shí)驗(yàn)中陳皮的黃酮，多糖含量均呈現(xiàn)最高，陳皮苷也許由于微生物酶系水解釋放出大量糖類(lèi)物質(zhì)，造成多糖含量高的現(xiàn)象[10]；藿香中揮發(fā)油、萜類(lèi)、酮類(lèi)等作為主要有效成分[11]，而多糖不作為主要成分[12]，所以檢測(cè)中液很有可能出現(xiàn)含量極低的現(xiàn)象。因此，檢測(cè)不出成分或者含量多也有部分原因是因?yàn)樵撍幬锉旧砗康膯?wèn)題。

3.2 菌種的種類(lèi)及濃度的原因 微生物發(fā)酵中藥需要注意的條件有很多，包括菌種的篩選，發(fā)酵工藝優(yōu)化等等。微生物酶系種類(lèi)繁多，因此發(fā)酵過(guò)程中對(duì)中藥材的細(xì)胞影響程度不同，不同的酶系可引發(fā)的化學(xué)反應(yīng)不同[13]，有的可以有效破壞植物藥細(xì)胞壁，利于胞質(zhì)內(nèi)有效成分釋放；也有的可以催化形成新的物質(zhì)，使某些成分發(fā)生生物轉(zhuǎn)化或者破壞其結(jié)構(gòu)，若有效成分因微生物酶系發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，也可能產(chǎn)生發(fā)酵后含量降低的情況。但對(duì)具體的微生物發(fā)酵機(jī)理尚未完全明確，有待進(jìn)一步研究。

3.3 提取方法和試劑的原因 發(fā)酵條件的篩選對(duì)發(fā)酵工藝的成功與否也起到了至關(guān)重要的作用，本次實(shí)驗(yàn)采取乙醇冷凝回流法提取，測(cè)量提取液中黃酮及多糖含量，復(fù)盤(pán)實(shí)驗(yàn)操作有幾點(diǎn)可以?xún)?yōu)化：

首先是料液比和菌的篩選，由于藥物濃度和種類(lèi)與菌群生長(zhǎng)情況并非呈線性相關(guān)，而是存在峰值的，不同濃度中藥對(duì)菌的生長(zhǎng)和抑制情況不同，因此發(fā)酵達(dá)到的效果也會(huì)不同。王振華，潘康成[14]探究了不同濃度中藥對(duì)枯草芽孢桿菌體外生長(zhǎng)情況的影響，結(jié)果表明其中含藥濃度為1%、0.5%、0.25%和 0.125%的黃芪和0.5%、0.25%、0.125%的紅花對(duì)枯草芽孢桿菌表現(xiàn)出明顯的促生長(zhǎng)作用，但1%、0.5%、0.25%的木通和1%的川芎對(duì)枯草芽孢桿菌有抑制作用，此外，李平蘭[15]，魏林[16]，丁軻[17]等學(xué)者也做出相關(guān)實(shí)驗(yàn)得出相關(guān)結(jié)論。

再者選擇合適的提取試劑，例如本實(shí)驗(yàn)用乙醇回流提取，提取后過(guò)濾，取濾液測(cè)定多糖含量[5]，而多糖溶于水不溶于乙醇，通常采用乙醇沉淀法提取多糖，本實(shí)驗(yàn)乙醇回流過(guò)程中很有可能將中藥細(xì)胞內(nèi)含有的多糖沉淀混入濾渣中造成多糖含量極少而難以測(cè)量的現(xiàn)象，即乙醇回流法不適用于提取多糖。劉雅雯[18]等學(xué)者用不同濃度乙醇，分級(jí)沉淀黃芪多糖，得到70%乙醇沉淀的粗多糖含量最高，幾乎是其他梯度的總和，這也不難解釋為何本實(shí)驗(yàn)多味中藥出現(xiàn)多糖含量過(guò)低的現(xiàn)象。

4 結(jié) 論

枯草芽孢桿菌、乳酸桿菌發(fā)酵后會(huì)顯著降低半枝蓮、陳皮、甘草的總黃酮提取量，對(duì)藿香的影響不明顯；經(jīng)乳酸桿菌發(fā)酵后，顯著提高半枝蓮，甘草的總多糖提取量；枯草芽孢桿菌幾乎不能促進(jìn)以上中藥的多糖釋放。

就總黃酮含量而言，藿香、半枝蓮、陳皮、甘草均不適合發(fā)酵，乳酸桿菌使藿香總黃酮提取量稍有增加，但效果不明顯，枯草芽孢桿菌會(huì)造成上述中藥總黃酮含量下降；就總多糖含量而言，甘草適合用乳酸桿菌發(fā)酵，藿香、半枝蓮、陳皮不適合發(fā)酵，會(huì)造成總多糖含量下降。

綜上所述，甘草適合進(jìn)行乳酸桿菌的發(fā)酵，可以提高總多糖的含量；藿香、半枝蓮、陳皮不適合發(fā)酵，會(huì)造成有效成分含量下降或無(wú)影響。