督脈電針聯(lián)合重復經(jīng)顱磁刺激對脊髓損傷后大鼠脊髓BDNF及其受體TrkB和p75NTR表達的影響

葉 青,李志剛△,時素華,姚海江,胡 煜,孫潤權(quán),曹祖懋,劉思遠,劉奕志,王 帥

(1.北京中醫(yī)藥大學,北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院,北京 100029；3.中國康復研究中心 北京博愛醫(yī)院,北京 100068)

脊髓損傷(Spinal Cord Injury，SCI)是一種具有高致殘率和高死亡率的神經(jīng)創(chuàng)傷性疾病。由此可以引發(fā)如缺血、氧化應(yīng)激、炎性事件、凋亡途徑和運動障礙等一系列的并發(fā)問題,導致嚴重的運動、感覺功能障礙、反射異常以及自主神經(jīng)功能紊亂[1]。原因主要有交通事故、跌倒或暴力等。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的報道，全世界每年大約有25～50萬人受到脊髓損傷的影響[1]。一項中國創(chuàng)傷性脊髓損傷住院患者流行病學調(diào)查數(shù)據(jù)顯示[2]：2018年俄國三級醫(yī)院脊髓損傷住院患者約為72 907例，平均年齡為51.6歲，男性是女性的3倍，高處墜落是最常見的原因，其次是跌倒。治療脊髓損傷的平均費用在23 228～53 783元不等，單次住院費用最高可達30萬元，給患者及其家庭乃至社會帶來嚴重經(jīng)濟負擔[3]。脊髓損傷機制主要分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷[3]。其潛在的治療策略主要包括增強神經(jīng)保護、減少繼發(fā)性損傷以及通過激活神經(jīng)元再生能力、改善微環(huán)境等來促進再生修復[4]。其中脊髓損傷后，神經(jīng)營養(yǎng)因子(Neurotrophic factors，NTFs)的缺乏是導致再生失敗的主要原因之一。神經(jīng)營養(yǎng)因子通常是通過軸漿運輸以受體介導的方式進入神經(jīng)末梢，以此來促進胞體有關(guān)蛋白質(zhì)的合成以及神經(jīng)細胞的再生、發(fā)育和功能恢復[5]。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-derived Neurotrophic Factor，BDNF)是目前實驗性脊髓損傷中研究最多的神經(jīng)營養(yǎng)因子。電針能有效抑制脊髓損傷后的炎癥反應(yīng)和細胞凋亡相關(guān)因子、促進神經(jīng)元軸突再生和功能恢復和減少膠質(zhì)瘢痕形成等[6]。重復經(jīng)顱磁刺激(repetitive TMS, rTMS)是連續(xù)給予一定頻率脈沖作用于脊髓損傷患者的運動皮層，使之產(chǎn)生的感應(yīng)電流激活上運動神經(jīng)元，進一步誘發(fā)神經(jīng)沖動的過程。rTMS 在臨床研究發(fā)現(xiàn)：rTMS對于脊髓損傷患者的運動呼吸功能與消化功能都有所改善，還具有鎮(zhèn)痛作用、防止肌萎縮及痙攣等作用[7-10]。本研究從神經(jīng)再生的角度，選擇不同時間點觀察 SCI大鼠神經(jīng)功能、組織病理形態(tài)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-derived Neurotrophic Factor,BDNF)、原肌球蛋白受體激酶B((Tropomyosin receptor kinase B,TrkB)與p75神經(jīng)營養(yǎng)素受體(p75neurotrophinreceptor ,p75NTR)的表達情況，探討電針聯(lián)合經(jīng)顱磁刺激治療SCI的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

清潔級6周齡SD雄性大鼠120只，體質(zhì)量(220±20)g，由維通利華(北京)實驗動物科技有限公司提供[生產(chǎn)許可證證號：SCXK(京)2016-0006],北京中醫(yī)藥大學良鄉(xiāng)校區(qū)清潔級動物房飼養(yǎng)，溫度為(25±3)℃，濕度(45±10)%，自由飲水進食，12 h晝夜規(guī)律調(diào)整，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后開始進行實驗。根據(jù)隨機數(shù)字表法將SD大鼠隨機分為6組：空白組(12只)、假手術(shù)組(12只)、模型組(24只)、電針組(24只)、經(jīng)顱磁刺激組(24只)和聯(lián)合組(24只)。模型組、電針組經(jīng)顱磁刺激組及聯(lián)合組再按干預(yù)1 d、7 d分為兩個亞組，每個亞組12只。實驗過程中對動物處置符合中華人民共和國科學技術(shù)部2006年頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》標準。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 試劑 rabbit anti-BDNF(美國Abcam公司ab108319);rabbit anti-TrkB(美Abcam公司ab187041);rabbit anti-p75(美國Abcam公司ab52987);4%組織細胞固定液(北京酷來搏科技有限公司);蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);兔二步法檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);Western Blotting檢測試劑盒(中國江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)。

1.2.2 儀器 Allen’s打擊裝置(北京協(xié)和醫(yī)學院微循環(huán)研究所);CP-8000科德士寵物用電推剪(深圳市科德士電器有限公司);韓氏電針儀(北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司);華佗牌針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司);經(jīng)顱磁刺激儀(武漢依瑞德醫(yī)療設(shè)備新技術(shù)有限公司);電熱鼓風干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司);RM2235 組織切片機(德國 LEICA公司);BX53自動化智能型正置研究級顯微鏡(日本OLYMPUS公司);移液器(德國 eppendorf);電泳儀(美國 Bio-rad Power Supplies Basic);臺式恒溫振蕩器(中國上海精宏實驗設(shè)備有限公司 THZ-312)多功能酶標儀(美國MD Spectramac M3);PH計(美國OHAUS STARTER 2C);分析天平(中國精密分析天平JA3003)。

1.3 模型制備

大鼠術(shù)前禁食禁水8 h，紫外燈消毒動物手術(shù)室30 min，手術(shù)器械消毒，手術(shù)室溫度不低于20 ℃。模型組、電針組、經(jīng)顱磁刺激組及聯(lián)合組腹腔注射麻醉后，固定于自制的弓形手術(shù)臺上，剔除背部T9～11及周圍毛發(fā)。消毒后分離背部肌肉、深筋膜，依次暴露T9～11段棘突和椎板，暴露脊髓；采用改良式Allen’s打擊裝置[11]:將10 g打擊錘套入鋼管內(nèi)高度為5 cm，致傷量為50 g/cm，造成T10～11節(jié)段脊髓損傷，此致傷量可造成大鼠的不完全性截癱，屬中等程度損傷?？焖倏p合傷口。大鼠清醒后,模型組造模后不進行任何治療;假手術(shù)組只暴露脊髓，不損傷，隨后縫合傷口。術(shù)后單籠飼養(yǎng)、定時膀胱擠壓幫助排尿。模型評價成功標準為身體痙攣性顫動、尾巴痙攣性擺動、硬脊膜內(nèi)充血或血腫和麻醉醒后雙下肢表現(xiàn)為不完全癱瘓。

1.4 治療方法

1.4.1 空白組、模型組和假手術(shù)組 相同飼養(yǎng)條件下不做任何處理，模型組及假手術(shù)組造模后也不做任何處理，但均要在重復經(jīng)顱磁刺激組、聯(lián)合組治療時抓取1次，以保證處理條件相同。

1.4.2 電針組 參照《大鼠穴位圖譜的研制》[12]選取相當于人體解剖部位的“大椎”(第7頸椎棘突下，向下斜刺)、“命門”(第2腰椎棘突下，向上斜刺)。用華佗牌規(guī)格Φ 0.25 mm×15 mm毫針進行針刺，進針約0.5～0.7 cm。針柄連接韓氏LH-202H型電療儀，上接陰極，下接陽極，持續(xù)脈沖電流，頻率2 Hz，強度2 mA，治療時間20 min，輸出強度在剛開始時以背部肌肉出現(xiàn)輕微抽動為度，待其適應(yīng)后則以雙下肢癱瘓肌肉出現(xiàn)有節(jié)律的收縮為度。1 d組于造模清醒后治療1次，7 d組于造模后與1 d組同一時間每天重復治療1次，持續(xù)到達預(yù)定時間。

1.4.3 經(jīng)顱磁刺激組 采用YRD CCY-I型磁刺激儀，脈沖磁場峰值強度為3 T。造模1 d后，將大鼠置于固定器中，頭部固定，圓形線圈磁場中心置于大鼠左前囟上方，應(yīng)用90%靜息運動閾值(造模前，測量大鼠的運動閾值，結(jié)果示運動閾值為最大脈沖強度的21%),刺激頻率5 Hz。每序列2 s，間歇28 s，共15 min。1 d組于造模清醒后2 h治療1次，7 d組于造模后與1 d組同一時間每天重復治療1次，持續(xù)到達預(yù)定時間[13]。

1.4.4 聯(lián)合組 干預(yù)方法同電針組加經(jīng)顱磁刺激組治療。

1.5 取材及指標檢測

1.5.1 行為學檢測 運用運動功能BBB[14]計分法對大鼠脊髓損傷進行評估，將大鼠后肢運動分為22個等級，后肢全癱為0分，完全正常為21分。綜合評定大鼠脊髓損傷后的功能，包括感覺、運動、反射及肢體動作協(xié)調(diào)等方面。

1.5.2 組織取材 在行為學檢測結(jié)束后立即取材。取每組6只大鼠腹腔注射麻醉后開胸，暴露心臟，用灌注針從左心室心尖部插入直至主動脈，灌注生理鹽水約240 mL后灌注4%多聚甲醛溶液約280 mL，取出損傷脊髓節(jié)段，約長1 cm，放入4%多聚甲醛溶液中固定，隨后進行脫水，石蠟包埋，切片，厚4 μm，用于HE染色和免疫組化。取剩余每組大鼠6只，麻醉后剪下?lián)p傷脊髓節(jié)段，放于液氮中，后保存于-80 ℃冰箱待蛋白檢測。

1.5.3 HE染色法觀察大鼠脊髓形態(tài)變化 將制備好的石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化后浸入蘇木素染色液5 min，純水沖洗后浸入伊紅染色液1 min，再洗，鏡下觀察著色情況，必要時加入0.5%鹽酸乙醇1～2 s，中性樹膠封片。采用400×光學顯微鏡下觀察大鼠脊髓組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

1.5.4 免疫組織化學法檢測損傷脊髓BDNF、TrkB和p75NTR陽性表達 石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化后行抗原修復，滴加3%過氧化物酶阻斷液浸泡10 min，滴加 150 μL一抗(BDNF1∶500,TrkB1∶250,P75NTR1∶250)，4 ℃過夜；滴加反應(yīng)增強液150 μL 10 min，滴加150 μL酶標抗兔IgG聚合物10 min，避光條件下滴加DAB顯色液反應(yīng)5 min，自來水沖洗10 min。蘇木素復染，1%鹽酸酒精分化，自來水沖洗浸泡，脫水，透明，中性樹膠封片，400×光學顯微鏡下觀察。

1.5.5 Western blot法檢測損傷脊髓BDNF、TrkB和p75NTR蛋白表達 取損傷脊髓組織80 mg，加200 μL RIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑)后勻漿，提取蛋白。計算樣品蛋白濃度，金屬浴95 ℃變性10 min。制備SDS-PAGE凝膠，上樣、電泳和轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，4 ℃過夜孵育一抗(rabbit anti-GAPDH 1∶1 000，BDNF 1∶1 000，TrkB 1∶1 000,P75NTR1∶1 000)；洗膜，孵育二抗。均勻滴加ECL超敏化學發(fā)光液，于ECL成像系統(tǒng)曝光拍照，定量分析各蛋白條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 BBB評分法評估大鼠后肢運動神經(jīng)功能

空白組與假手術(shù)組大鼠后肢功能正常，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，排除手術(shù)對于模型的影響；與空白組比較，1 d、7 d模型組BBB評分均顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；1 d時：各組BBB評分差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；7 d時：與模型組和經(jīng)顱磁刺激組比較，電針組和聯(lián)合組BBB評分顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與電針組比較，聯(lián)合組BBB評分顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠干預(yù)后不同時間BBB評分比較

2.2 各組大鼠脊髓HE染色

在HE染色中，圖像細胞質(zhì)呈粉紅色淡染，細胞核呈藍色深染。空白組和假手術(shù)組大鼠脊髓組織神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)完整，核仁清晰。組織結(jié)構(gòu)排列緊密，未見空洞、出血等。干預(yù)1 d，模型組可見脊髓組織結(jié)構(gòu)被破壞，組織壞死，細胞皺縮，灰、白質(zhì)分界不清，中央管結(jié)構(gòu)紊亂，白質(zhì)神經(jīng)纖維腫脹增粗，排列紊亂，灰質(zhì)內(nèi)紅細胞大量聚集，細胞間質(zhì)水腫，細胞核固縮、破碎等，并可見明顯的空泡。電針組、經(jīng)顱磁刺激組、聯(lián)合組與模型組病理改變相似；干預(yù)7 d，模型組可見白質(zhì)與灰質(zhì)的邊界仍然模糊不清，內(nèi)有固縮、破碎的細胞核,白質(zhì)神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)腫脹明顯，灰質(zhì)內(nèi)出血減少。電針組、聯(lián)合組較模型組組織結(jié)構(gòu)更加完整，空洞減少，可觀察到更多結(jié)構(gòu)正常細胞，整體修復情況優(yōu)于模型組。見圖1。

2.3 各組大鼠脊髓BDNF表達比較

脊髓經(jīng)免疫組織化學法染色，BDNF免疫陽性產(chǎn)物主要在脊髓組織的運動神經(jīng)元中表達，以胞漿著色為主，呈現(xiàn)棕黃色的，空白組和假手術(shù)組中可見分布于胞漿的棕黃色小顆粒?？瞻捉M與假手術(shù)組BDNF蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與空白組比較，1 d、7 d模型組BDNF蛋白表達均顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；1 d時:各組BDNF蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；7 d時：與模型組和經(jīng)顱磁刺激組比較，電針組和聯(lián)合組大鼠脊髓組織中BDNF蛋白表達顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與電針組比較，聯(lián)合組大鼠脊髓組織中BDNF蛋白表達顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2、表2。

表2 各組大鼠干預(yù)后損傷脊髓組織BDNF陽性表達比較

Western blot法檢測顯示，空白組與假手術(shù)組BDNF蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與空白組比較，1 d、7 d模型組BDNF蛋白表達均顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；1 d時:各組BDNF蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；7 d時：與模型組比較，經(jīng)顱磁刺激組BDNF蛋白表達微升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與模型組和經(jīng)顱磁刺激組比較，電針組和聯(lián)合組大鼠脊髓組織中BDNF蛋白表達顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與電針組比較，聯(lián)合組大鼠脊髓組織中BDNF蛋白表達顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3、表3。

表3 各組大鼠干預(yù)后損傷脊髓組織BDNF蛋白表達比較

2.4 各組大鼠脊髓TrkB表達比較

脊髓經(jīng)免疫組織化學法染色，TrkB免疫陽性產(chǎn)物主要在脊髓組織的運動神經(jīng)元中表達，主要集中在胞膜、胞質(zhì)，呈現(xiàn)棕黃色，空白組與假手術(shù)組中可見分布于胞膜、胞質(zhì)的棕黃色小顆粒。空白組與假手術(shù)組TrkB蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與空白組比較，1 d、7 d模型組TrkB蛋白表達量均顯著變化，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；1 d時：各組TrkB蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；7 d時：與模型組與經(jīng)顱磁刺激組比較，電針組和聯(lián)合組TrkB蛋白表達顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與電針組比較，聯(lián)合組TrkB蛋白表達顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4、表4。

表4 各組大鼠干預(yù)后損傷脊髓組織TrkB陽性表達比較

Western blot法檢測顯示，空白組與假手術(shù)組TrkB蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與空白組比較，1 d、7 d模型組TrkB蛋白表達量均顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；1 d時：各組TrkB蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；7 d時：與模型組和經(jīng)顱磁刺激組比較，電針組和聯(lián)合組TrkB蛋白表達顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與電針組比較，聯(lián)合組TrkB蛋白表達顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖5、表5。

表5 各組大鼠干預(yù)后損傷脊髓組織TrkB蛋白表達比較

2.5 各組大鼠脊髓p75NTR表達比較

p75NTR的免疫陽性產(chǎn)物主要在脊髓組織的運動神經(jīng)元中表達，其亞細胞定位主要位于陽性細胞的胞漿，呈現(xiàn)棕黃色?？瞻捉M與假手術(shù)組p75NTR基本不表達或表達較少，當受到刺激或應(yīng)激狀態(tài)下被誘導進而介導細胞凋亡?？瞻捉M與假手術(shù)組p75NTR蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與空白組比較，1 d、7 d模型組p75NTR蛋白表達量均顯著上升，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；1 d時：各組p75NTR蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；7 d時：與模型組和經(jīng)顱磁刺激組比較，電針組與聯(lián)合組p75NTR蛋白表達顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與電針組比較，聯(lián)合組p75NTR蛋白表達顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖6、表6。

表6 各組大鼠干預(yù)后損傷脊髓組織p75NTR陽性表達比較

Western blot法檢測顯示，空白組與假手術(shù)組p75NTR蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與空白組比較，1 d、7 d模型組p75NTR蛋白表達量均顯著上升，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；1 d時：各組p75NTR蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；7 d時：與模型組比較，電針組和聯(lián)合組p75NTR蛋白表達顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與經(jīng)顱磁刺激組比較，聯(lián)合組p75NTR蛋白表達顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖7、表7。

表7 各組大鼠干預(yù)后損傷脊髓組織p75NTR蛋白表達比較

3 討論

BDNF是1982年Barde等從豬腦中分離出的一種神經(jīng)元存活誘導因子[15]。在治療脊髓損傷中作為細胞存活和神經(jīng)突起生長促進劑具有非常大的潛力作用[16]。BDNF在脊髓損傷中發(fā)揮作用的途徑主要是通過相應(yīng)受體結(jié)合來激活細胞內(nèi)多種下游信號通路[17]。TrkB是BDNF具有高親和力的特異性受體(酪氨酸激酶受體)[18]。BDNF誘導的TrkB信號可能通過經(jīng)磷脂酰-3激酶( P1-3K ) /Akt通路、Ras/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)途徑、磷脂酶C-γ( PLC-γ) /3-磷酸肌醇(IP-3)通路和N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體的磷酸化等途徑來實現(xiàn)促進的軸突生長以及細胞內(nèi)環(huán)境的改善[19-22]。另一方面，BDNF與p75NTR結(jié)合可以通過激活p53來激活Jun N末端(JNK)激酶，觸發(fā)細胞死亡，通過JNK非依賴性機制觸發(fā)促凋亡級聯(lián)反應(yīng)[23-24]。

《靈樞·寒熱病》關(guān)于“體惰”的描述:“身有所傷血出多，及中風寒，若有所墮墜，四肢懈惰不收，名曰體惰?！迸c現(xiàn)代醫(yī)學對于脊髓損傷的描述極為相似。《難經(jīng)·二十八難》云:“督脈者，起于下極之俞，并于脊里，上至風府，入屬于腦?！倍矫}與脊髓并行于脊柱之中，傷其脊骨是表象，損其督脈是實質(zhì)，故脊髓病變當求治于督脈[25]。督脈電針治療脊髓損傷能夠促進軸突的生長、功能的恢復和抑制細胞凋亡因子等[26]。馮紅霞等[27]發(fā)現(xiàn)電針“大椎”“命門”穴結(jié)合康復訓練能改善不完全性脊髓損傷的感覺、運動功能,效果優(yōu)于單純的康復訓練。經(jīng)顱磁刺激(TMS)技術(shù)是1985年由Barker及其助手創(chuàng)立的，其原理是利用交變磁場產(chǎn)生的感應(yīng)電流，對運動皮層產(chǎn)生電流刺激，同時對于運動皮層誘發(fā)電位作出相應(yīng)記錄[28]。重復經(jīng)顱磁刺激治療脊髓損傷的可能機制有：TMS刺激大腦皮層激活上運動神經(jīng)元，進而誘發(fā)神經(jīng)沖動在皮質(zhì)脊髓束傳導；TMS能夠直接刺激中樞神經(jīng)，實現(xiàn)對大腦皮層的重塑，刺激運動通路，進一步增強癱瘓肢體的功能[29]。Hoffman采用經(jīng)顱磁刺激對四肢癱瘓的患者進行了為期3周的實驗，研究表明患者運動皮層的投射面積增加，說明經(jīng)顱磁刺激可以誘發(fā)皮層功能改變[30]。臨床研究發(fā)現(xiàn),rTMS可以改善患者的呼吸、消化和運動功能，具有鎮(zhèn)痛的作用[31-34]。電針和經(jīng)顱磁刺激一樣都具有安全可靠、無痛、無創(chuàng)、操作便捷和可重復等優(yōu)點。

本實驗選取1 d和7 d兩個時間點，希望更好地觀察脊髓損傷后大鼠行為學及其各項生物學檢測指標在急性期1 d的變化，以及隨著干預(yù)次數(shù)和時間的增加，在脊髓損傷反應(yīng)期7 d的指標變化和電針組、重復經(jīng)顱磁刺激組和聯(lián)合組的效果對比。結(jié)果表明1 d時相較于模型組，電針組、重復經(jīng)顱磁刺激組和聯(lián)合組對比大鼠行為學及其各生物學檢查指標的效果差異不明顯，而在7 d時電針組和聯(lián)合組的結(jié)果有統(tǒng)計學差異，重復經(jīng)顱磁刺激組也有所提高，這與前期研究相一致[35-36]。通過1 d和7 d比較可知,首先大鼠自身具有一定的自愈能力。而進行督脈電針、重復經(jīng)顱磁刺激或是兩者的聯(lián)合治療能加速它的恢復。

本實驗通過BBB評分，對脊髓損傷大鼠后肢功能進行行為學評價，可知在7 d的時間點時，各干預(yù)組大鼠后肢功能相較于模型組評分有所提高，電針組和聯(lián)合組有顯著改善，說明其可以改善脊髓損傷大鼠神經(jīng)功能損傷癥狀，重復經(jīng)顱磁刺激組的改善不顯著，但具有一定的上升趨勢，在下一步的研究中可以延長干預(yù)時間，觀察重復經(jīng)顱磁刺激在脊髓損傷恢復期。HE染色觀察脊髓也能看到在7 d的時間點時，神經(jīng)元邊緣開始清晰，出現(xiàn)小膠質(zhì)細胞的增生,但是脊髓灰質(zhì)和白質(zhì)邊界仍不清晰，損傷部位組織結(jié)構(gòu)致密程度有所改善。但相對于正常大鼠水平，仍有一定的差距。免疫組織化學法和Western blot法的檢查結(jié)果基本一致。在7 d的時間點時，可見在對BDNF、TrkB及p75NTR的蛋白表達影響方面，聯(lián)合組的效果優(yōu)于電針組;電針組的效果優(yōu)于重復經(jīng)顱磁刺激組和模型組；重復經(jīng)顱磁刺激組與模型組比較，效果不顯著。

綜上所述，本實驗觀察電針聯(lián)合重復經(jīng)顱磁刺激對脊髓損傷大鼠BDNF及其受體TrkB和p75NTR表達的影響，探討單純電針或重復經(jīng)顱磁刺激在脊髓損傷中發(fā)揮的作用，以及聯(lián)合治療是否能夠比單純電針或重復經(jīng)顱磁刺激在該實驗中效果更好。結(jié)果表明電針相對單純經(jīng)顱磁刺激在大鼠脊髓損傷的反應(yīng)期效果更好，聯(lián)合治療對比單純電針的效果更顯著。說明督脈電針聯(lián)合重復經(jīng)顱磁刺激可改善脊髓損傷大鼠神經(jīng)功能損傷癥狀，促進受損脊髓的出血減少、神經(jīng)元再生，其機制可能與上調(diào)激素中BDNF及TrkB以及下調(diào)p75NTR的表達有關(guān)。