介孔硅納米粒作為植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因載體的研究

陸新華 孫德權(quán) 張秀梅

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶果樹生物學(xué)重點實驗室，湛江 524091）

遺傳轉(zhuǎn)化是植物分子育種和功能基因組研究的重點工作之一。研發(fā)穩(wěn)定、高效的遺傳轉(zhuǎn)化新方法，是遺傳育種、分子生物學(xué)和基因工程等領(lǐng)域長期關(guān)注的焦點問題［1］。目前，基因槍轟擊、農(nóng)桿菌侵染和病毒侵染等是常用的傳統(tǒng)植物遺傳轉(zhuǎn)化方法。但是，這些方法存在一些不足之處［2］。例如基因槍轟擊法具有成本高；容易形成嵌合體，造成轉(zhuǎn)基因的失活或沉默；所需外源DNA量大以及植物組織損傷大等缺點［3］。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化受體物種有限，并且易產(chǎn)生隨機(jī)插入造成非目標(biāo)基因功能失活。對于大多數(shù)木本植物或頑拗型基因型的植物來說，仍存在遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)難題［4］。利用植物病毒介導(dǎo)法對植物基因進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化效率比較高，但其安全性受到質(zhì)疑，目前該方法主要用于動物的基因轉(zhuǎn)移［5］。

近年來，隨著納米技術(shù)的快速發(fā)展，納米材料作為基因載體在植物遺傳轉(zhuǎn)化、動物細(xì)胞和醫(yī)學(xué)治療等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用［6-7］。納米材料具備獨特的理化性質(zhì)，表面能大大增加，易與其他原子結(jié)合變穩(wěn)定，粒子上的官能團(tuán)密度和選擇性吸附能力變大，可以通過表面修飾精準(zhǔn)地調(diào)控其與生物分子（如 DNA、RNA 以及蛋白）的相互作用［8］。另外，零維和一維的納米材料可以不借助外力穿透細(xì)胞膜，容易進(jìn)入到植物細(xì)胞的內(nèi)部，使得它成為重要生物分子極佳的傳送載體［9］。利用不同化學(xué)基團(tuán)對納米顆粒表面進(jìn)行功能化修飾，通過物理或化學(xué)親和作用裝載或者吸附靶向外源 DNA等核酸分子，構(gòu)建成納米核酸復(fù)合物。然后，通過靜電吸附或化學(xué)鍵作用與細(xì)胞受體結(jié)合，利用細(xì)胞胞吞作用將納米復(fù)合物導(dǎo)入植物細(xì)胞，釋放外源目的基因，最終實現(xiàn)納米載體介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化，是一種具有高效性創(chuàng)新的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)［10］。與傳統(tǒng)方法相比較，納米載體不僅能夠?qū)Φ鞍?、DNA和RNA等多種生物分子進(jìn)行有效保護(hù)，還可以方便、快捷、高效地把靶標(biāo)分子導(dǎo)入植物愈傷、胚乳等不同組織，對單子葉植物和雙子葉植物都能轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且能夠進(jìn)行多基因同時轉(zhuǎn)化［11-14］。

在眾多的轉(zhuǎn)基因納米材料中，介孔硅納米粒（mesoporous silica nanoparticle，MSNs）因具有顆粒大小均勻、比表面積大、高裝載量、易于修飾的內(nèi)外表面、高穩(wěn)定性以及良好的生物相容性等特點，正被逐漸用于植物轉(zhuǎn)基因載體材料［15-16］。2007年，Torney等［17］利用MSNs裝載綠色熒光蛋白（GFP）基因，用金納米粒子進(jìn)行封堵，利用基因槍將納米復(fù)合物導(dǎo)入煙草葉片細(xì)胞，首次實現(xiàn)了MSNs介導(dǎo)基因在植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。此外，Martin-Ortigosa等［18］利用MSNs裝載Cre酶蛋白，在借助基因槍外力作用下，將靶基因?qū)胗衩着咧?，并且實現(xiàn)了目的基因的表達(dá)。MSNs表面進(jìn)行聚乙烯亞胺修飾后用于裝載GUS基因，然后與煙草懸浮細(xì)胞混合培養(yǎng)，并且通過超聲波處理，目的基因被導(dǎo)入到煙草細(xì)胞中并得到了成功表達(dá)［19］。不少研究也表明，外源生物分子在無機(jī)械無外力輔助下也可通過納米材料透過細(xì)胞壁實現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)化［20-21］。例如，Chang等［15］將mCherry蛋白和GFP蛋白基因裝載于MSNs，在不借助外力的情況下，納米復(fù)合物穿透擬南芥根部而進(jìn)入到植株細(xì)胞內(nèi)。利用激光共聚焦顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)，目的基因在根系的表皮層以及更深層次的皮質(zhì)和內(nèi)胚層根組織都實現(xiàn)了表達(dá)。

本文采用軟模板法，以十六烷基三甲基溴化銨為模板劑，正硅酸乙酯為硅源，合成了兩種直徑分別為20 nm和50 nm介孔硅納米粒（MSNs）。利用3-氨基丙基三乙氧基硅烷對MSNs表面進(jìn)行修飾，對其進(jìn)行形態(tài)、紅外光譜和電位表征。通過凝膠阻滯實驗測試兩種氨基化的介孔硅納米粒對靶標(biāo)基因的裝載性能和保護(hù)性能；作為遞送綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記的質(zhì)粒DNA的載體，對擬南芥原生質(zhì)體進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)，在熒光顯微鏡下觀測綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，綜合評估兩種不同MSNs作為基因載體的效率。以期為納米基因載體在植物轉(zhuǎn)基因中的研究與應(yīng)用提供新的材料和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥（Arabidopsis thaliana）野生型Col-0種子和smGFP［22］標(biāo)記的大腸桿菌來自本實驗室。質(zhì)粒提取試劑盒購自Bioline公司；DNase I購自Thermo Fisher公司；纖維素酶和離析酶購自Yakult公司；正硅酸乙酯（98%）、十六烷基三甲基溴化銨（99%）、3-氨基丙基三乙氧基硅烷和1, 3, 5-三甲苯購自 Sigma-Aldrich公司；其它均為分析純，購自北京索萊寶科技有限公司。JEM-2100透射電鏡（日本電子株式會社）；UV1700型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；傅里葉變換紅外光譜儀Vertex 70（德國Bruker 公司），Zeta電位儀（英國Malven公司），激光共聚焦顯微鏡TCS5SP5（德國Leica公司），Milli-Q?IQ7003超純水儀（德國Merck公司），集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（杭州大力科教儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 介孔硅納米粒的制備 制備采用軟模板法，具體參照文獻(xiàn)［23］。稱取2.968 g十六烷基三甲基溴化銨溶解于100 mL Milli-Q水中（用氨水調(diào)節(jié)pH值至10.0），80℃劇烈攪拌30 min 后，冷卻至30℃。逐滴加入1.86 mL正硅酸乙酯，混合液繼續(xù)攪拌反應(yīng)24 h，然后置于80℃ 烘箱中24 h。接著用 0.1 μm孔徑的硝酸纖維素膜過濾反應(yīng)液，將所得的白色產(chǎn)物分散在含有 1 mL HCl（32%）的 100 mL 酒精里，60℃水浴攪拌過夜。得到的白色物質(zhì)于 9 000 r/min離心10 min，并用酒精洗滌3次，最終產(chǎn)品真空干燥 24 h，得到小尺寸的介孔硅納米粒（MSN-20）。

大尺寸的介孔硅納米粒的合成同上。不同之處為十六烷基三甲基溴化銨溶解15 min 后，加入1, 3, 5-三甲苯8.91 mL，繼續(xù)攪拌15 min，冷卻至30℃，后續(xù)步驟相同。最后所得產(chǎn)物是大尺寸的介孔硅納米粒（MSN-50）。

1.2.2 氨基修飾的硅納米粒（Am-MSNs）制備 將兩種不同尺寸的介孔硅納米粒100 mg 分別分散在100 mL純乙醇，超聲均勻后，劇烈攪拌，然后分別逐滴加入5 mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷。反應(yīng)1 h后，加入5.0 mL Milli-Q水，繼續(xù)在室溫下劇烈攪拌反應(yīng)24 h。最后將反應(yīng)液離心，用乙醇洗滌3次，真空干燥，即得到兩種不同尺寸的氨基化硅納米粒（Am-MSN-20和 Am-MSN-50）。

1.2.3 材料表征 利用透射電子顯微鏡觀察材料形態(tài)特征，采用傅里葉變換紅外光譜儀對材料進(jìn)行紅外光譜測試，使用 zeta 電位儀測量樣品電位。

1.2.4 質(zhì)粒DNA（pDNA）的擴(kuò)增與純化 將含有smGFP質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α接種在LB 固體培養(yǎng)基（含 1% 胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，0.5%氯化鈉5 g，1.5%瓊脂和50 μg/ mL氨芐青霉素），于37℃下培養(yǎng)24 h復(fù)活。然后挑取單菌落接種于新平板上培養(yǎng) 8 h后，用滅菌的槍頭將新鮮的單菌落轉(zhuǎn)移進(jìn)LB液體培養(yǎng)基（同固體培養(yǎng)基，不加瓊脂），37℃下165 r/min搖床中培養(yǎng)過夜。按照質(zhì)粒提取試劑盒說明書進(jìn)行質(zhì)粒提取，通過瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光度計鑒定質(zhì)粒純度、大小和濃度，選取OD260/OD280≈1.8的pDNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 Am-MSNs與pDNA 的結(jié)合和保護(hù)性試驗 將1 μg pDNA與兩種尺寸的Am-MSNs 按照不同質(zhì)量比例進(jìn)行混合，室溫下振蕩結(jié)合2 h，形成的Am-MSNs/pDNA復(fù)合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳阻滯試驗。

Am-MSNs對pDNA的保護(hù)通過添加DNase I進(jìn)行評價。將1 μg pDNA分別與40 μg的兩種尺寸硅納米粒混合于W5溶液（含0.1% 葡萄糖，0.08%KCl，0.9% NaCl，1.84% CaCl2和 2 mol/L MES-KOH，pH 7.5），室溫下放置2 h。加入1 U DNaseI，于37℃下對Am-MSNs/pDNA復(fù)合物進(jìn)行酶解消化1 h后，加入1 μL乙二胺四乙酸停止反應(yīng)。產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測納米載體對pDNA的保護(hù)情況，同時設(shè)置陽性和陰性對照。

1.2.6 擬南芥原生質(zhì)體的提取 參照文獻(xiàn)［24-25］方法，從生長在MS培養(yǎng)基上14 d的擬南芥幼苗葉片中提取原生質(zhì)體。具體來說，將擬南芥幼苗葉片，切成1 mm的長條，放入酶解液中［含0.5 mol/L蔗糖，10 mol/L MES-KOH（pH 7.5），20 mol/L CaCl2，40 mol/L KCL，2%纖維素酶和0.4% 離析酶］，室溫黑暗條件下過夜。然后將釋放出的原生質(zhì)體用Miracloth過濾入50 mL離心管，100 g離心2 min，并用預(yù)冷的W5溶液洗滌2次。最后純化的原生質(zhì)體重新懸浮于W5溶液，置于冰上30 min后備用。

1.2.7 Am-MSNs 對原生質(zhì)體的毒性試驗 提前將Am-MSNs置于超凈工作臺下進(jìn)行紫外消毒，然后用W5溶液洗滌3次備用。將新鮮制備的原生質(zhì)體與不同質(zhì)量濃度（0，1，10，100 mg/L）的氨基化的硅納米?；旌现糜?孔培養(yǎng)板中，每孔含有2 mLW5溶液，在室溫黑暗條件下振蕩培養(yǎng)（35 r/min），每天每孔加入0.1 mL W5溶液。原生質(zhì)體活力用FDA染色法［26］進(jìn)行檢測，每個處理重復(fù)3次，每個重復(fù)觀察3個視野。

1.2.8 Am-MSNs /pDNA的植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化 Am-MSNs介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化參照文獻(xiàn)［17］。經(jīng)預(yù)實驗篩選，選取質(zhì)量比為40∶1的Am-MSN-20/pDNA和質(zhì)量比為20∶1的Am-MSN-50/pDNA復(fù)合物，其中pDNA用量為1 μg。分別吸取100 μL擬南芥原生質(zhì)體（106個/mL）分別與復(fù)合物充分混勻，然后將混合液轉(zhuǎn)移至預(yù)先用5%小牛血清處理過的12孔培養(yǎng)板中，室溫下35 r/min搖床上暗箱培養(yǎng)。同時以PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化作為陽性對照，用20 μg pDNA和100 μL擬南芥原生質(zhì)體（104個/mL）共培養(yǎng)。并將20 μg pDNA加入 100 μL原生質(zhì)體（106個/mL）培養(yǎng)作為陰性對照。培養(yǎng)一段時間后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。每個處理重復(fù)3次，每個重復(fù)觀察3個視野。

2 結(jié)果

2.1 硅納米粒的形態(tài)表征

圖1為制備的兩種尺寸的硅納米粒和相應(yīng)的氨基化硅納米粒的TEM圖。從圖中可以看出，小尺寸的MSN-20（圖1-A）和Am-MSN-20（圖1-B）呈現(xiàn)大小均勻，分散性高的類球形。其中MSN-20具有清晰的介孔結(jié)構(gòu)，粒徑約為20 nm左右，并且氨基修飾后的納米粒直徑變化不大。本試驗中，通過加入擴(kuò)孔劑1, 3, 5-三甲苯，合成了MSN-50（圖1-C）和Am-MSN-50（圖1-D）呈現(xiàn)出單分散的花狀結(jié)構(gòu)，其尺寸和介孔都有顯著增加，直徑約為50 nm。

圖1 不同納米材料透射電鏡圖Fig.1 TEM images of different nanoparticles

2.2 硅納米粒的紅外光譜分析

采用紅外光譜分析比較硅納米粒在氨基修飾前后表面基團(tuán)的變化，從而確定官能團(tuán)是否連接成功。從圖2的紅外光譜可以看出，所有材料呈現(xiàn)出了二氧化硅骨架的典型特征峰：Si-O-Si 對稱伸縮振動峰（υ= 801 cm-1）、Si-O伸縮振動峰（υ = 965 cm-1）和Si-O-Si不對稱伸縮振動峰（υ = 1 090 cm-1）［27-28］。氨基修飾后，兩種硅納米粒在1 559 cm-1處出C-N基團(tuán)特征伸縮振動峰，證明氨基基團(tuán)成功地接枝到材料表面，為后續(xù)裝載DNA做好準(zhǔn)備。

圖2 不同納米材料紅外光譜圖Fig.2 FTIR spectra of of different nanoparticles

2.3 硅納米粒的Zeta電位

用3-氨基丙基三乙氧基硅烷修飾硅納米粒后，將材料分別分散于雙蒸水中，用Zeta電位儀測定其Zeta電位值。由圖3可以看出，兩種未修飾的硅納米粒的表面均帶負(fù)電荷，其中 MSN-20的Zeta電位較低（-16.0 mV）。然而，氨基修飾的兩種硅納米粒的表面均帶正電荷，這是因為氨基化的硅納米粒的表面含有大量的氨基，氨基修飾前后硅納米粒的Zeta電位的變化也進(jìn)一步表明氨基成功修飾到兩種納米粒上。其中大尺寸的Am-MSN-50的Zeta電位較高（9.1 mV），表明Am-MSN-50表面比Am-MSN-20枝接了更多的氨基基團(tuán)。

圖3 不同納米材料的Zeta電位Fig.3 Zeta potential of different nanoparticles

2.4 Am-MSNs與pDNA 的結(jié)合分析

從圖4凝膠阻滯實驗結(jié)果來看，陽性對照純pDNA在電場的作用下遷移，因而在泳道上呈現(xiàn)明顯的熒光條帶，陰性對照的兩種Am-MSNs的泳道中都沒有熒光。而與Am-MSNs結(jié)合的DNA滯留在點樣孔中，因此點樣孔發(fā)出明顯的熒光。不同質(zhì)量比條件下，Am-MSN-20與 DNA的結(jié)合程度不同。由圖4-A所示，當(dāng)Am-MSN-20與pDNA質(zhì)量比為5∶1，10∶1，20∶1，30∶1時，泳道中有DNA條帶，點樣孔中也有不同程度的熒光，表明Am-MSN-20未能有效結(jié)合pDNA，有不同程度多余的DNA在泳道中遷移。但當(dāng)Am-MSN-20與pDNA 質(zhì)量比大于40∶1時，納米粒已與DNA完全結(jié)合，滯留在點樣孔，泳道中沒有任何條帶。同樣從圖4-B可以看出，當(dāng)Am-MSN-50與pDNA質(zhì)量比大于20∶1時，DNA被納米粒完全吸附，滯留在孔中，發(fā)出熒光。結(jié)果表明Am-MSN-20/pDNA 和Am-MSN-50/pDNA最佳質(zhì)量比分別是40∶1和20∶1。因為 Am-MSN-50的Zeta電位高于Am-MSN-20，所以相同質(zhì)量的Am-MSN-50比 Am-MSN-20 可能負(fù)載更多的 DNA。

圖4 兩種Am-MSNs與DNA結(jié)合的凝膠阻滯實驗Fig.4 Agarose gel electrophoresis assay of Am-MSNs/DNA complexes

2.5 Am-MSNs對pDNA的酶切保護(hù)

由圖5所示，作為對照的裸露pDNA在凝膠泳道中遷移（泳道 1），添加DNase I后，DNA分子被完全消化，泳道中沒有任何條帶（泳道 2）。泳道3和5中的Am-MSNs/pDNA復(fù)合物滯留在點樣孔中，用DNase I消化后，在凝膠的點樣孔中仍可見明顯的復(fù)合物滯留條帶（泳道 4和6），說明pDNA 與Am-MSNs 結(jié)合后，納米基因載體能保護(hù)其不受DNase I的降解。

圖5 氨基化硅納米粒對pDNA的酶切保護(hù)Fig.5 Protection of Am-MSNs against pDNA digestion

2.6 Am-MSNs對原生質(zhì)體的細(xì)胞毒性實驗

本實驗應(yīng)用FDA染色法檢測不同濃度Am-MSNs對擬南芥原生質(zhì)體的細(xì)胞毒性，以確定其應(yīng)用于基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的可行性及劑量。從圖6可以看出，與未處理的對照原生質(zhì)體相比，不同濃度的兩Am-MSNs對擬南芥原生質(zhì)體均無顯著的細(xì)胞毒性，即使是濃度高達(dá)100 mg/L。另外，在不同的培養(yǎng)時間點，兩種Am-MSNs沒有顯著降低原生質(zhì)體的存活率。

圖6 氨基化硅納米粒對擬南芥原生質(zhì)體的細(xì)胞毒性評價Fig.6 Assessment of Am-MSNs cytotoxicity to A.thaliana mesophyll protoplasts

2.7 Am-MSNs/pDNA擬南芥原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化

選取質(zhì)量比為40∶1的Am-MSN-20/pDNA和質(zhì)量比為20∶1的Am-MSN-50/pDNA兩種納米粒轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體，培養(yǎng)36 h后置于激光共聚焦顯微鏡下觀察，兩組納米粒均可以成功的將含有smGFP的pDNA轉(zhuǎn)入擬南芥原生質(zhì)體瞬時表達(dá)（圖7-D和7-E）。陽性對照PEG也能介導(dǎo)pDNA進(jìn)入原生質(zhì)體，產(chǎn)生綠色熒光蛋白表達(dá)（圖7-C），而陰性對照裸露pDNA（圖7-A）和Am-MSNs（圖7-B）處理的原生質(zhì)體里均無綠色熒光蛋白的表達(dá)。培養(yǎng)48 h 后，Am-MSN-50/pDNA的轉(zhuǎn)化效率較高，能達(dá)到13.1%，顯著高于Am-MSN-20/pDNA 的轉(zhuǎn)化效率5.0%（圖8-A）。同時陽性對照PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化效率62.3%（圖8-A），分別是 Am-MSN-50/pDNA和Am-MSN-20/pDNA轉(zhuǎn)化效率的4.7倍和12.4倍。

圖7 氨基化硅納米粒介導(dǎo)的smGFP質(zhì)粒在擬南芥原生質(zhì)體中的瞬時表達(dá)Fig.7 Am-MSN-mediated transient smGFP expression in the protoplasts of A.thaliana

圖8 轉(zhuǎn)化48 h后 smGFP在擬南芥原生質(zhì)體中的基因表達(dá)評價Fig.8 Assessment of smGFP gene expression in the protoplasts of A.thaliana 48 h post-transformation

3 討論

MSNs具有較高的表面自由能，大量活性羥基導(dǎo)致其親水性強(qiáng)，極易發(fā)生集聚現(xiàn)象，以至于在有機(jī)相中的MSNs分散不均，從而影響材料的結(jié)構(gòu)與性能［29］。另外，未經(jīng)修飾的MSNs表面帶有大量負(fù)電荷，不利于裝載和吸附同樣帶負(fù)電荷的核酸分子。因此，有必要根據(jù)不同的使用目的，通過一定的技術(shù)手段對MSNs表面進(jìn)行化學(xué)或物理修飾［30-31］。通過引入某些特殊官能團(tuán)，使MSNs粒子表面的硅羥基和不飽和鍵與所需基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，接枝有機(jī)分子鏈段，減少其表面的硅羥基含量，增加其與聚合物之間的相容性，降低表面極性以提高其水溶性和分散性［32-33］。為了使納米顆粒具有生物活性，3-氨基丙基三乙氧基硅烷作為一種常用原料制備氨基改性的納米硅材料，應(yīng)用于不同的研究領(lǐng)域。例如，氨基改性納米硅接枝棉織物，可以顯著提高布料耐洗牢度、超疏水性和紫外防性能［34］。He等［35］利用氨基改性納米硅作為基因載體，將GFP順利導(dǎo)入動物COS-7細(xì)胞并實現(xiàn)了表達(dá)。本研究采用3-氨基丙基三乙氧基硅烷對MSNs進(jìn)行表面修飾，枝接大量氨基基團(tuán)，從而攜帶高密度的正電荷。作為載體的氨基修飾后的MSNs可以將帶負(fù)電荷的DNA分子壓縮、吸附和纏繞在載體的介孔縫隙內(nèi)以及納米顆粒表面，同時對靶標(biāo)基因也起到有效地保護(hù)作用［36-37］。通過電鏡觀察到納米基因復(fù)合物呈環(huán)狀的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，Kukowska-Latallo等［38］證實了納米載體在與DNA復(fù)合過程中發(fā)生了結(jié)構(gòu)上的壓縮和變形。

納米材料的制備方法決定了其與靶標(biāo)基因的結(jié)合方式。一步法是在納米基因載體制備過程中加入靶標(biāo)DNA，使其以物理包裹的方式與納米材料相結(jié)合。而兩步法則是先合成納米載體，然后通過共價鍵或者靜電吸引使其與靶標(biāo)核酸相結(jié)合［39］。納米材料對靶標(biāo)基因的負(fù)載能力是衡量其作為介導(dǎo)載體性能的一個重要指標(biāo)。本文中凝膠阻滯實驗結(jié)果表明，兩種Am-MSNs顯示出與質(zhì)粒DNA很強(qiáng)的結(jié)合能力，Am-MSNs/pDNA復(fù)合物被凝膠阻滯，且20 nm和50 nm兩種材料與pDNA最佳質(zhì)量比分別是40∶1和20∶1。結(jié)果同時顯示，50 nm Am-MSNs對pDNA有更好的結(jié)合能力。這歸結(jié)于大顆粒的MSNs具有更大的比表面積、更多的介孔空間和數(shù)量更多的正電荷，這些因素使得其吸附pDNA的能力更強(qiáng)［40］。理論上，納米材料顆粒和介孔越大，能夠裝載的生物分子越多。但納米材料會影響細(xì)胞內(nèi)的一些生物學(xué)過程，如細(xì)胞分裂、DNA復(fù)制和細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等［41］。MSNs顆粒大小是決定其對植物細(xì)胞毒害性強(qiáng)弱的重要因素，直徑小于20 nm或大于2 500 nm的MSNs對細(xì)胞的傷害性更強(qiáng)［42-43］。本實驗中兩種未經(jīng)修飾的MSNs在超純水中的Zeta電位為負(fù)，而氨基修飾后都帶上了較強(qiáng)的正電荷，這些結(jié)論與Yang等［44］研究發(fā)現(xiàn)相似。

在復(fù)雜的植物細(xì)胞胞內(nèi)和胞外環(huán)境中，存在著大量的核酸酶，如果載體不能提供有效保護(hù)，DNA就會在進(jìn)入細(xì)胞核表達(dá)之前被降解，導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)染效率的下降［45］。因此，對于有效的基因輸送來說，載體不僅需要具備高效的DNA負(fù)載能力，更要具備良好的抵抗核酸酶降解的能力，確保DNA能夠順利到達(dá)細(xì)胞內(nèi)并實現(xiàn)外源基因的表達(dá)。劉?。?6］以淀粉納米顆粒為載體，結(jié)合DNA后，發(fā)現(xiàn)納米顆粒的表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)改變了DNA的空間構(gòu)型，阻礙了酶與DNA 鏈上的酶切位點靠近與結(jié)合，使DNA免受酶的消化降解［47-48］。由于納米顆粒的表面體積效應(yīng)等作用，引起酶分子形狀的變化，有可能使活性中心不能再與底物結(jié)合，從而抑制酶的反應(yīng)［49］。本文中凝膠電泳證明了兩種Am-MSNs載體能有效的保護(hù)外源基因，這可能是由于氨基修飾的MSNs帶有正電荷，以及DNA構(gòu)象上的變化，阻止了Mg2+、核酸酶與DNA接觸，從而保護(hù)了DNA免受 DNase I酶切［50］。

表面氨基化修飾的介孔二氧化硅納米載體，通過物理和化學(xué)偶聯(lián)作用與核酸分子形成納米載體基因復(fù)合物，并且主要是通過胞吞作用進(jìn)入植物細(xì)胞［51-52］。隨后，納米載體基因復(fù)合物被內(nèi)陷的細(xì)胞膜形成的內(nèi)含體包裹，然后被細(xì)胞內(nèi)的溶酶體吞噬［53］。細(xì)胞中質(zhì)子與納米載體上的陽離子基團(tuán)置換，溶酶體內(nèi)質(zhì)子含量不斷升高，導(dǎo)致溶酶體裂解，通過質(zhì)子-海綿效應(yīng)使得納米載體基因復(fù)合物逸出溶酶體，最終釋放在植物細(xì)胞胞漿內(nèi)［54］。擴(kuò)散到核膜表面的納米載體基因復(fù)合物通過核膜孔或在核定位信號的幫助下進(jìn)入細(xì)胞核或在細(xì)胞分裂期，直接整合到細(xì)胞基因組［55-56］。研究表明，轉(zhuǎn)染效率受原生質(zhì)體細(xì)胞濃度和活力、靶標(biāo)核酸濃度高以及基因載體類型等因素影響［24，57］。本實驗表明，Am-MSNs可以攜帶DNA進(jìn)入擬南芥原生質(zhì)體中，并有綠色熒光蛋白瞬時表達(dá)。大顆粒Am-MSN-50的轉(zhuǎn)化效率顯著高于小顆粒Am-MSN-20，這是因為同樣質(zhì)量的前提下，Am-MSNs-50具有更大的尺寸、介孔容量和正電荷量，因此能負(fù)載更多的DNA［58］。作為PEG介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化率達(dá)到62.3%，明顯高于兩種Am-MSNs介導(dǎo)的表達(dá)效率，GFP蛋白表達(dá)的熒光強(qiáng)度也數(shù)倍高于Am-MSNs。但是，在本實驗中必須看到Am-MSNs介導(dǎo)的較高的轉(zhuǎn)化率是在裝載1 μg pDNA與106/mL擬南芥原生質(zhì)體濃度條件下獲得的，是相同條件下PEG（20 μg pDNA，104/mL擬南芥原生質(zhì)體）介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化率的2 000倍，這個結(jié)果表明基于高遺傳轉(zhuǎn)化效率Am-MSNs的基因傳遞系統(tǒng)可以應(yīng)用于植物細(xì)胞中。本研究展示了不同尺寸的基于硅納米粒的基因載體的遺傳轉(zhuǎn)化效率，這將為納米基因載體在植物轉(zhuǎn)基因中提高轉(zhuǎn)化效率提供了新的研究基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究利用軟模板法，加入擴(kuò)孔劑合成了兩種尺寸的MSNs。通過表面修飾后形成的Am-MSNs，帶有較高的正電荷，可以通過靜電吸附結(jié)合并保護(hù)DNA，對擬南芥原生質(zhì)體沒有毒性。利用Am-MSNs作為基因載體可以傳送DNA進(jìn)入擬南芥原生質(zhì)體，出現(xiàn)GFP熒光瞬時表達(dá)，其中大尺寸的Am-MSN-50介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化效率高于小尺寸的Am-MSN-20。