采用HPLC-MS-AIS法測(cè)定鉤藤中四種生物堿含量

張 燕 ，張 鎖 ，丁 靖 ，魏 瑋 ，趙彩萍 ，戴尊孝

（1.西安市精神衛(wèi)生中心，陜西 西安 710100；2.西安市藥學(xué)（精神衛(wèi)生）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710100*通信作者：張 燕，E-mail：zy22661685@163.com）

鉤藤為茜草科植物鉤藤、大葉鉤藤、毛鉤藤、華鉤藤或無(wú)柄果鉤藤的干燥帶鉤莖枝［1］，始載于《名醫(yī)別錄》，可用于治療偏頭痛［2］、焦慮［3］、老年癡呆［4］等。鉤藤植物中生物堿約七十余種［5-6］。神經(jīng)精神系統(tǒng)藥效學(xué)研究顯示，鉤藤總堿可以恢復(fù)模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力［7］；鉤藤堿對(duì)癲癇有明顯的抑制作用［8］；異鉤藤堿具有鎮(zhèn)靜、促進(jìn)睡眠［9］及改善帕金森癥狀的作用［10］；去氫鉤藤堿及其異構(gòu)體可以改善谷氨酸功能缺陷小鼠的探究行為［11］。作用強(qiáng)度與鉤藤生物堿含量相關(guān)，故對(duì)其生物堿的準(zhǔn)確測(cè)定尤為重要。

鉤藤中有效生物堿成分主要為鉤藤堿及其同分異構(gòu)體、異鉤藤堿及其同分異構(gòu)體，上述四種物質(zhì)可作為鉤藤藥材生物堿的質(zhì)量標(biāo)志物。目前，已報(bào)道的關(guān)于鉤藤生物堿分析方法有高效液相色譜法（HPLC）［12-13］、液質(zhì)聯(lián)用法（HPLC-MS）［14-15］、毛細(xì)管電泳法（HPCE）［16-18］以及超高效液相色譜法（UPLC-MS）［19］等。上述方法存在諸多局限性，例如，HPLC分析時(shí)間較長(zhǎng)，HPLC-MS采用外標(biāo)法或是多組分定量使用同一個(gè)內(nèi)標(biāo)，均不利于樣本的快速準(zhǔn)確定量。高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用-自體內(nèi)標(biāo)法（HPLC-MS-AIS）采用自體內(nèi)標(biāo)法（Autogenous Internal Standard，AIS），避免了 HPLC 分析時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、HPLC-MS外標(biāo)法與被分析物質(zhì)碰撞能量不同，因而在定量分析方法中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。AIS是通過(guò)時(shí)間程序設(shè)定，使待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)先后進(jìn)入分離系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)利用化合物本身作為內(nèi)標(biāo)的新技術(shù)。本研究主要采用HPLC-MS-AIS技術(shù)測(cè)定鉤藤中四種生物堿的含量，為鉤藤藥材的質(zhì)量控制提供新方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

液相色譜儀30AT、三重四極桿質(zhì)譜儀8050CL、色譜工作站Version 5.81（日本島津公司）；全自動(dòng)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜耦合儀9500Ms-Mate（湖南德米特公司）；XW渦旋混合器（上海琪特分析儀器有限公司）；吉爾森移液槍（吉爾森科技有限公司）；高速冷凍離心機(jī)HC-3616R（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；萬(wàn)分之一分析天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；Milli-Q Academic超純水儀（美國(guó)Millipore公司）；電熱套、循環(huán)水泵（上海暉創(chuàng)化學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試藥與試劑

甲酸（天津市天力化學(xué)試劑有限公司）；分析級(jí)甲醇、分析級(jí)乙腈（美國(guó)安可化學(xué)公司）；鉤藤堿對(duì)照品（LOT：C22M11S113789）、異鉤藤堿對(duì)照品（LOT：P08A10S85061）、去氫鉤藤堿對(duì)照品（LOT：MUST-12101703）、異去氫鉤藤堿對(duì)照品（LOT：MUST-17092903）均購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司；鉤藤藥材（四川成都荷花池中藥材專業(yè)市場(chǎng)）。

1.3 色譜與質(zhì)譜條件

色譜條件：C18色譜柱（3.0 mm×50 mm，3.3 μm）；流動(dòng)相A為0.1%甲酸（pH=4.2），流動(dòng)相B為乙腈，A∶B=82∶18（v/v）；柱溫30℃；流速0.5 mL/min；進(jìn)樣量2 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源；正離子檢測(cè)方式；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；干燥氣流速10 L/min；霧器流速為3.0 L/min；接口溫度300℃；毛細(xì)管電壓為4 000 v；選擇質(zhì)子數(shù)/電荷數(shù)（m/z）：385.25/160.10（鉤藤堿）、385.30/160.10（異鉤藤堿）、383.25/160.15（去氫鉤藤堿）、383.25/160.15（異去氫鉤藤堿）作為檢測(cè)離子對(duì)。

1.4 溶液配制

1.4.1 儲(chǔ)備液配制

精確稱取鉤藤堿2.40 mg、異鉤藤堿2.40 mg、去氫鉤藤堿2.60 mg、異去氫鉤藤堿2.60 mg于10 mL容量瓶，以甲醇定容至10 mL。將溶液進(jìn)行4倍稀釋，獲得鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿混合對(duì)照品溶液，濃度分別為60.0、60.0、65.0、65.0 μg/mL，置于-20℃冰箱備用。

1.4.2 AIS溶液配制

精確吸取“1.4.1”項(xiàng)下配制的混合對(duì)照品溶液，流動(dòng)相溶液作為稀釋劑，配得內(nèi)標(biāo)溶液中鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿濃度分別為0.40、0.40、0.45、0.45 ng/mL，在分析樣本時(shí)，進(jìn)樣后2.0 min，切入分析系統(tǒng)，進(jìn)樣量50 μL。

1.4.3 對(duì)照品溶液及質(zhì)控溶液制備

將“1.4.1”項(xiàng)中的混合對(duì)照品溶液吸取適量，用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋得到不同濃度對(duì)照品溶液及質(zhì)控溶液，鉤藤堿和異鉤藤堿系列濃度為2.30、23.04、115.20、288.00、480.00、600.00 ng/mL，高、中、低質(zhì)控溶液標(biāo)示濃度分別為5.40、270.00、540.00 ng/mL；去氫鉤藤堿和異去氫鉤藤堿系列濃度為2.47、24.70、124.80、312.00、520.00、650.00 ng/mL，高、中、低質(zhì)控溶液標(biāo)示濃度分別為5.85、292.50、585.00 ng/mL。

1.4.4 藥材供試品溶液制備

稱取藥材約30 g于圓底燒瓶中，加入300 mL水，接入回流裝置，煮沸1 h。冷卻至室溫后，取適量提取液，經(jīng)4℃、17 757×g離心10 min，精確吸取上清液1 mL至棕色瓶中，用流動(dòng)相進(jìn)行11倍稀釋，密封保存。

1.5 分析性能評(píng)價(jià)

1.5.1 專屬性

按照分析條件，將制備的供試品溶液進(jìn)樣，得到目標(biāo)物色譜保留時(shí)間。各峰間無(wú)干擾則專屬性良好。

1.5.2 線性范圍

分別取系列對(duì)照品溶液100 μL，在色譜和質(zhì)譜條件下依次進(jìn)樣。計(jì)算被測(cè)物質(zhì)在不同濃度下峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值，然后將比值與濃度進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程及相關(guān)系數(shù)，并以信噪比（S/N）=10為定量下限。

1.5.3 精密度

取1份對(duì)照品溶液，在分析條件下測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次。計(jì)算各對(duì)照品與AIS的峰面積比值的精密度。

1.5.4 準(zhǔn)確度

取系列濃度對(duì)照品溶液及質(zhì)控溶液，進(jìn)樣分析。對(duì)高、中、低濃度質(zhì)控溶液各測(cè)定3次，計(jì)算各質(zhì)控溶液測(cè)定濃度均值。準(zhǔn)確度=（測(cè)定濃度均值/標(biāo)示濃度）×100%。

1.5.5 穩(wěn)定性

取供試品溶液，分別間隔0、6、12、24、48和72 h進(jìn)樣分析，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各成分的濃度，得到穩(wěn)定性。

1.5.6 重復(fù)性

取6份鉤藤藥材各30 g，制備藥材供試品溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算四種鉤藤生物堿的重復(fù)性。

1.5.7 加樣回收率

精確吸取藥材供試品溶液6份，各100 μL，分別精確加入等量對(duì)照品溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算四種鉤藤生物堿的加樣回收率。

1.5.8 含量測(cè)定

取3份藥材供試品溶液進(jìn)行分析測(cè)定，并計(jì)算折合生藥量。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)處理采用Lab Solution工作站，采用Excel進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果以（±s）表示，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性采用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2 結(jié) 果

2.1 專屬性

鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿保留時(shí)間分別為4.88、3.50、2.91、3.73 min，見表1。色譜峰見圖1，與AIS無(wú)相互干擾。

圖1 各成分專屬性結(jié)果色譜圖Figure 1 Chromatogram of specific results for each component

表1 各化合物保留時(shí)間（min）Table 1 Retention time of each compound

2.2 定量線性范圍

四種鉤藤生物堿回歸方程相關(guān)系數(shù)均＞0.99，其定量線性范圍、檢測(cè)下限、定量下限見表2。

表2 各成分的回歸方程、線性范圍、檢測(cè)下限、定量下限Table 2 Regression equation，linear range，lower limit of detection and lower limit of quantification for each component

2.3 精密度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性

鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿精密度RSD分別為2.30%、1.10%、0.90%、1.70%，均＜3.00%。四種鉤藤生物堿的高、中、低質(zhì)控溶液濃度測(cè)定準(zhǔn)確度為92.40%～104.10%。四種鉤藤生物堿穩(wěn)定性RSD分別為1.60%、3.50%、5.00%、1.80%，均≤5.00%。見表3。

表3 四種鉤藤生物堿的精密度、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性Table 3 Precision，accuracy and stability of four kinds of alkaloids in Uncaria

2.4 重復(fù)性

鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿含量RSD分別為2.80%、2.80%、4.90%、5.20%，均＜6.00%。

2.5 加樣回收率

鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿加樣回收率分別為101.40%、104.60%、96.60%、95.90%，均在（100%±5%）范圍內(nèi)，RSD均＜3.00%。見表4。

表4 四種鉤藤生物堿的回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 4 Recovery results of four kinds of alkaloids in Uncaria

2.6 樣品測(cè)定結(jié)果

鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿折合生藥量分別為99.54、33.51、30.38、139.16 μg/g。見表5。

表5 鉤藤生物堿含量測(cè)定結(jié)果Table 5 Results of alkaloid content determination of Uncaria

3 討 論

有研究表明［20］，鉤藤生物堿水溶液在酸性環(huán)境中更加穩(wěn)定，故采用pH=4.2的0.1%甲酸水作為分離水相，其配制的流動(dòng)相作為供試品的稀釋溶液，保證了供試品溶液在酸性環(huán)境下的穩(wěn)定性，并使鉤藤生物堿色譜峰獲得了良好的峰型。本研究定量分析的四種生物堿互為同分異構(gòu)體［21］，化合物檢測(cè)離子對(duì)相同，不能通過(guò)質(zhì)譜定性，故需要借助液相色譜進(jìn)行分離。采用甲醇和乙腈［22］作為移動(dòng)相均有報(bào)道，本研究考察了3種流動(dòng)相系統(tǒng)（乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸水、甲醇乙腈-0.1%甲酸水），結(jié)果表明乙腈-0.1%甲酸水分離效果最佳，同分異構(gòu)體分離度良好，在8 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了鉤藤中四種生物堿的分離定量。

與池雨鋒等［14］研究結(jié)果相比，本研究采用HPLC-MS-AIS方法測(cè)定的鉤藤藥材生物堿含量偏低，分析原因有兩點(diǎn)：一是供試品制備時(shí)參照鉤藤入藥的傳統(tǒng)方法，即將2～3 cm帶鉤莖枝水煎，未將鉤藤飲片粉碎處理，鉤藤藥材粉碎度對(duì)水提取生物堿含量的影響較大［23］；二是不同產(chǎn)地的鉤藤藥材中生物堿的含量也可能存在差異［24］。

樣本測(cè)定時(shí)由自動(dòng)進(jìn)樣器先行進(jìn)樣，2.4 min后，液相串聯(lián)質(zhì)譜藕合儀通過(guò)閥切換將AIS和分析流路連通，內(nèi)部的計(jì)量泵吸入50 μL AIS注入色譜柱前端，由流動(dòng)相帶入柱內(nèi)分析。切入時(shí)間決定樣本和AIS的分離程度，切入時(shí)間為2.4 min時(shí)，目標(biāo)物與AIS色譜峰分離度＞1.5。目前，內(nèi)標(biāo)法定量通常使用同位素或物理化學(xué)性質(zhì)類似的化合物，同位素具有弱放射性、昂貴、穩(wěn)定性差的特點(diǎn)，性質(zhì)類似的其他類型化合物與目標(biāo)物分子的碎裂方式以及碰撞能量不同，對(duì)定量準(zhǔn)確性存在一定的干擾。本研究中，AIS法使用目標(biāo)物自身作為內(nèi)標(biāo)，彌補(bǔ)了其他類型內(nèi)標(biāo)的不足，并且每種化合物均有與之對(duì)應(yīng)的內(nèi)標(biāo)，凸顯了AIS法在多組分分析中的優(yōu)勢(shì)。

HPLC-MS-AIS方法將色譜對(duì)復(fù)雜樣品的高分離能力和質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度以及能夠提供相對(duì)分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來(lái)，在測(cè)定鉤藤生物堿含量中，具有準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性好的特點(diǎn)，為鉤藤藥材質(zhì)量控制提供了新方法。相較于HPLC 技術(shù)［12］，HPLC-MS技術(shù)根據(jù)化合物離子鑒別，洗脫時(shí)間更短；但與 UPLC-MS 方法［21］比較，HPLC-MS-AIS分析速度依然不足，有待進(jìn)一步改進(jìn)。