血清中乳酸標準物質(zhì)的研制

丁 敏， 孟嬌然， 夏 娃

(上海市計量測試技術(shù)研究院，上海 201203)

0 引 言

乳酸是人體能量代謝過程的中間產(chǎn)物，它與糖、脂、蛋白質(zhì)代謝以及細胞內(nèi)的能量代謝有著密切的關(guān)系。乳酸廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)，作為糖尿病等多種代謝性疾病及膿毒癥、感染性休克、急性心衰、惡性腫瘤等多種危重疾病治療和診斷的指標，可用于確定疾病的嚴重程度及評估對治療干預(yù)的反應(yīng)[1]，也廣泛應(yīng)用于運動醫(yī)學(xué)的人體乳酸代謝研究[2]。近年隨著研究的深入，乳酸可能是三羧酸循環(huán)最主要的能量物質(zhì)原料[3]，也有認為乳酸的升高不僅是指導(dǎo)疾病治療的指標，它還很可能為人體最重要的能量載體和癌細胞最重要的直接營養(yǎng)來源，其含量監(jiān)測可能為癌癥等疾病的研究打開新的思路[4]，也有研究表明乳酸也是一種重要的臨床信號分子[5]。因此臨床乳酸含量準確檢測能為疾病的診斷、治療、轉(zhuǎn)歸預(yù)測以及腫瘤學(xué)代謝等研究提供有效的參考。目前化學(xué)實驗室常用乳酸檢測方法有滴定法[6]、氣相色譜法[7]、液相色譜法[8]，主要應(yīng)用于食品添加劑中乳酸的檢測；臨床實驗室基于快速檢測需要常用的乳酸檢測方法反應(yīng)機理有乳酸氧化酶和乳酸脫氫酶法，檢測方法有電化學(xué)法和光學(xué)法等，測量樣本對象包括血清、全血、尿液、腦脊液等[9-12]。在實際測量過程中，由于檢測原理和儀器類型的差異，還有同類型儀器核心耗材和校準液的不同，儀器質(zhì)量參差不齊，乳酸檢測結(jié)果存在顯著性的差異。

由于我國尚未建立完整的血清乳酸量值溯源（參考測量）系統(tǒng)，沒有建立臨床血清乳酸參考方法，經(jīng)檢索國內(nèi)和國際標準物質(zhì)數(shù)據(jù)庫（包括NIST、LGC、IRMM、JCTLM），未查詢到血清中乳酸標準物質(zhì)，難以對血清乳酸測定值的準確性進行有效地評價，相應(yīng)臨床儀器的量值溯源工作一直難以開展?；谝陨蠁栴}，本文研制了血清中乳酸標準物質(zhì)，采用同位素稀釋質(zhì)譜法（IDMS）進行標準物質(zhì)定值，IDMS是一項基準方法，具有最高的計量特性，在臨床參考系統(tǒng)方面有著廣泛的應(yīng)用，如用于參考測量程序的建立，血清基體標準物質(zhì)的定值以及國際比對等[13]，該標準物質(zhì)能為臨床乳酸檢測提供量值溯源的依據(jù)。由于人體只具有代謝L-（+）-乳酸的酶（L-乳酸脫氫酶），因此本文研究的標準物質(zhì)為血清中的 L-（+）-乳酸標準物質(zhì)。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQ-S，美國 waters 公司)；電子天平（XS205型，瑞士梅特勒-托利多公司）；酶膜法乳酸分析儀（YSI2500，美國YSI公司）。

L-（+）-乳酸 ： ≥98%，L6402（美國 Sigma-Aldrich 公司) ；同位素標記 L-乳酸鈉：13C3，CLM-1579-0（美國劍橋同位素實驗室) ；氫氧化鈉滴定溶液標準物質(zhì)：GBW(E)080494，0.5 mol/L，Urel=0.3%（k=2）（上海市計量測試技術(shù)研究院）；硫酸滴定溶液標準物質(zhì)：GBW(E)080496，0.1 mol/L，Urel=0.3%（k=2）（上海市計量測試技術(shù)研究院）；其他試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準物質(zhì)的制備和封裝

標準物質(zhì)采用人血清作為基質(zhì)，血清需經(jīng)生物安全性檢測未檢出乙肝表面抗原 (HbsAg)、人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體 、丙型肝炎病毒(HCV)，具有良好的生物安全性保障。將冷凍血清采用逐步解凍法解凍至常溫后，搖晃均勻，在酶膜法乳酸分析儀上檢測初始濃度為（5±0.5） mol/L，平均分為3份，根據(jù)臨床乳酸分析儀測量范圍0～30 mol/L設(shè)定目標濃度為 5 mol/L、10 mol/L、15 mol/L。使用 L-（+）-乳酸純物質(zhì)配制5 mol/L乳酸濃溶液，根據(jù)初始濃度添加適量乳酸溶液，低速混勻使乳酸充分溶解，得到3個濃度水平的血清中乳酸標準物質(zhì)候選物。采用酶膜法乳酸分析儀對每個濃度水平的候選物進行均勻性初檢，符合要求后分裝于滅菌后的0.5 mL離心管，-80 ℃速凍。

1.2.2 均勻性評估

根據(jù) JJF 1343—2012《標準物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計學(xué)原理》[14]，每個濃度水平標準物質(zhì)隨機抽取15個單元，采用酶膜法乳酸分析儀進行均勻性檢測，該方法可直接對樣本進行分析，避免引入樣本處理過程中的隨機影響因素，經(jīng)評定該方法的精密度水平優(yōu)于標準物質(zhì)的定值方法，靈敏度能有效滿足標準物質(zhì)的檢測要求，且每次檢測前采用經(jīng)滴定溯源的乳酸溶液進行儀器校準，確保方法的溯源性。以隨機次序進行檢測，每個單元平行檢測3次，采用單因素方差分析法對檢測結(jié)果進行評價。

1.2.3 穩(wěn)定性評估

1）長期穩(wěn)定性。采用經(jīng)典穩(wěn)定性評估法對標準物質(zhì)的長期穩(wěn)定性進行評估。參考均勻性評估對方法精密度的要求，采用酶膜法乳酸分析儀對-80 ℃條件保存的標準物質(zhì)的乳酸濃度進行監(jiān)測，該方法可直接對樣本進行分析，避免引入樣本處理過程中的隨機影響因素，經(jīng)評定該方法的精密度水平優(yōu)于標準物質(zhì)的定值方法，靈敏度能有效滿足標準物質(zhì)的檢測要求，且每次檢測前采用經(jīng)滴定溯源的乳酸溶液進行儀器校準，確保方法的溯源性。檢測時間間隔先密后疏，分別在樣品制備完成后當天、0.5，1，2，3，6，9個月進行檢測，每次檢測抽取每個濃度水平標準物質(zhì)各3個單元，每個單元平行測定3次取算術(shù)平均值為乳酸濃度檢測結(jié)果。在動力學(xué)機理未知的情況下，對時間和濃度值進行線性擬合，得到穩(wěn)定性評估模型為：

式中：Y——乳酸濃度值；

X——時間；

β0和β1——擬合曲線的截距和斜率。

對監(jiān)測數(shù)據(jù)統(tǒng)計，用t檢驗法進行評價，若β1小于t（0.95,7-2）與 β1的標準偏差s（β1）的乘積則判定標準物質(zhì)量值在監(jiān)測時間段在相應(yīng)保存條件下穩(wěn)定。

2）短期穩(wěn)定性。采用同步穩(wěn)定性評估法對標準物質(zhì)的短期穩(wěn)定性進行評估。制備好血清標準物質(zhì)凍入-80 ℃ 冰箱后，第 1，15，22，26，28 天分別取出置于-20 ℃冰箱中冷凍保存，每次取3瓶，第29天-20 ℃冰箱中保存的標準物質(zhì)連同-80 ℃冰箱保存的每個濃度3瓶標準物質(zhì)全部取出（-20 ℃保存天數(shù)分別為第 0，1，3，7，14，28 天），采用酶膜法乳酸分析儀進行檢測，以長期穩(wěn)定性同樣方法統(tǒng)計評價。

1.2.4 標準物質(zhì)的定值

標準溶液配制：采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法對血清中乳酸標準物質(zhì)進行定值，配制1 g/L乳酸標準溶液和1 g/L乳酸鈉同位素內(nèi)標溶液，移取相應(yīng)體積的乳酸標準溶液和乳酸鈉同位素內(nèi)標溶液按照表1配制系列質(zhì)量比標準溶液，檢測時以20%甲醇水溶液稀釋標準溶液5倍進樣。

表1 乳酸與乳酸鈉內(nèi)標質(zhì)量比標準溶液配制方法

血清標準物質(zhì)處理：移取100 μL待測血清樣品至1.5 mL離心管中，加入50 μL 1 g/L乳酸鈉同位素內(nèi)標溶液。加入1 000 μL甲醇，渦旋30 s后以14 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min。上清液用0.22 μm尼龍濾膜過濾。移取200 μL濾液至進樣瓶中再加入800 μL去離子水，渦旋10 s將溶液充分混勻作為標準物質(zhì)處理液。

以液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀對標準溶液和標準物質(zhì)處理液進行分析。色譜條件：色譜柱Waters ACQUITY BEH C18 2.1 mm × 100 mm，1.7 μm；流動相：A相為H2O，含0.1%（V/V）甲酸，B相為乙腈；流量：0.2 mL/min；進樣體積：2 μL；柱溫：40℃；標準溶液檢測方法梯度：95%A相，等度運行2.5 min；血清樣品檢測方法梯度見表2。

表2 血清樣品檢測方法梯度

質(zhì)譜條件：掃描方式為負離子模式；檢測方式為多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；乳酸及內(nèi)標離子對檢測參數(shù)見表3；毛細管電壓1.0 kV；脫溶劑氣流量800 L/h；脫溶劑氣溫度500 ℃。

表3 乳酸及內(nèi)標離子對檢測參數(shù)

以乳酸峰面積與乳酸鈉同位素的峰面積比值作為縱坐標，乳酸與乳酸鈉同位素質(zhì)量比0.2～2.0、1.0～3.0和2.0～4.0范圍分別作為橫坐標，分別用最小二乘法擬合建立標準曲線，將血清樣品的峰面積比值帶入對應(yīng)標準曲線計算得到血清中乳酸含量。

乳酸標準溶液配制用乳酸純物質(zhì)參照GB 1886.173—2016 《食品安全國家標準 食品添加劑乳酸》[6]中的滴定法進行定值，以氫氧化鈉、硫酸有證標準物質(zhì)滴定，以離子色譜法對滴定的干擾因素中的有機酸、無機酸進行定值和扣除后的結(jié)果作為標準值[15]。定值用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法經(jīng)方法學(xué)檢驗，回收率大于95%，通過比較乳酸和乳酸鈉同位素內(nèi)標在校準溶液和基質(zhì)匹配校準溶液中的曲線斜率來判斷基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果證明同位素稀釋質(zhì)譜法可以抵消基質(zhì)效應(yīng)帶來的影響，保證了方法的量值溯源性。

多家實驗室隨機抽取高、中、低3個濃度水平血清中乳酸標準物質(zhì)各3個單元，每個單元重復(fù)檢測3次，確定各實驗室數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布后，對每個實驗室定值原始數(shù)據(jù)進行異常值檢驗、等精度檢驗、正態(tài)分布檢驗，符合要求后以多家實驗室定值結(jié)果的算術(shù)平均值作為血清中乳酸標準物質(zhì)標準值。

2 結(jié)果與討論

2.1 均勻性評估

均勻性評估結(jié)果見表4，根據(jù)統(tǒng)計分析可知，當顯著性水平α=0.05時，3個濃度水平的血清中乳酸標準物質(zhì)的F值均小于F0.05(14，30)=2.04，證明標準物質(zhì)均勻性良好。

表4 血清中乳酸標準物質(zhì)均勻性評估結(jié)果

瓶內(nèi)均勻性采用同樣方法，取瓶中不同3個位置檢測，通過統(tǒng)計檢驗證明標準物質(zhì)瓶內(nèi)均勻性良好。采用差減法平行測定多次進樣消耗質(zhì)量，根據(jù)密度和質(zhì)量計算得到最小取樣量約為25 μL。

2.2 穩(wěn)定性評估

1）長期穩(wěn)定性。9個月濃度監(jiān)測圖見圖1。通過對穩(wěn)定性監(jiān)測數(shù)據(jù)的統(tǒng)計，用t檢驗法進行評價，β1絕對值小于t（0.95,5）與 β1的標準偏差s（β1）的乘積，判定該系列標準物質(zhì)特性量值在監(jiān)測時間段9個月內(nèi)-80 ℃能夠穩(wěn)定保存，結(jié)果見表5。

圖1 血清乳酸標準物質(zhì)穩(wěn)定性監(jiān)測圖

表5 血清中乳酸標準物質(zhì)長期穩(wěn)定性（9個月）評估結(jié)果

2）短期穩(wěn)定性。28天濃度監(jiān)測圖見圖1。通過對穩(wěn)定性監(jiān)測數(shù)據(jù)的統(tǒng)計，可判定該系列標準物質(zhì)特性量值在監(jiān)測時間段28天內(nèi)-20 ℃能夠穩(wěn)定保存，可在該溫度條件下進行運輸貯存，結(jié)果見表6。

表6 血清中乳酸標準物質(zhì)短期穩(wěn)定性（28天）評估結(jié)果

2.3 定值結(jié)果

按照1.2.4方法定值，乳酸標樣、乳酸內(nèi)標和血清標物中的乳酸色譜圖見圖2。繪制定值標準曲線，結(jié)果顯示該方法在乳酸及乳酸鈉同位素內(nèi)標比值0.2～2.0、1.0～3.0 和 2.0～4.0范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R均大于0.999。檢驗數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布后，以狄克遜（Dixon） 和格拉布斯（Grubbs）法分別對8家實驗室定值原始數(shù)據(jù)（n=9）進行 異常 值 檢 驗，均 未 發(fā) 現(xiàn) 異 常 值，采用科克倫（Cochran）法對8家實驗室檢測結(jié)果進行等精度檢驗符合要求，再采用格拉布斯（Grubbs）法檢驗各實驗室定值結(jié)果算術(shù)平均值是否有顯著性差異，以上檢驗均通過，采用偏態(tài)系數(shù)和峰態(tài)系數(shù)法進行所有數(shù)據(jù)的正態(tài)分布檢驗，所有數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用8家實驗室檢測結(jié)果的算術(shù)平均值作為血清中乳酸標準物質(zhì)定值結(jié)果（見表7）。

圖2 乳酸、內(nèi)標及血清中乳酸的多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）色譜圖

表7 血清中乳酸標準物質(zhì)定值結(jié)果 mmol/L

2.4 不確定度評定

血清中乳酸標準物質(zhì)的不確定度來源由三部分組成。第一部分為定值引入的不確定度，包括測量方法引入的不確定度及多家實驗室定值分散性的不確定度；第二部分為標準物質(zhì)的均勻性引入的不確定度；第三部分為標準物質(zhì)在有效期內(nèi)的變動性引入的不確定度，包括短期穩(wěn)定性引入的不確定度和長期穩(wěn)定性引入的不確定度。各不確定度分量關(guān)系見圖3。

圖3 血清中乳酸標準物質(zhì)不確定度分量合成圖

2.4.1 定值引入的不確定度度評定

1）測量方法引入的不確定度

根據(jù)血清中乳酸標準物質(zhì)定值方法，先通過擬合標準曲線計算得到血清標準物質(zhì)中乳酸與乳酸鈉同位素內(nèi)標質(zhì)量比值Rs，將其帶入下式測量模型計算得到血清中乳酸的含量。

式中：c(serum)——血清中乳酸的濃度， mmol/L；

m(NaLA)——血清樣品中加入的乳酸鈉同位素質(zhì)量，μg；

V(serum)——血清的體積，mL；

90.08 ——乳酸的分子量，g/mol。

根據(jù)式（2），血清中乳酸標準物質(zhì)定值的不確定度來源主要包括三部分，第一部分為標準曲線法測量得到的質(zhì)量比值Rs的不確定度，包括回歸計算引入的不確定度，標準曲線標準值引入的不確定度；第二部分為血清體積計算值的不確定度，包括血清的密度ρ(serum)、血清的稱樣質(zhì)量m(serum)引入的不確定度；第三部分為乳酸分子量引入的不確定度。由于Rs為乳酸質(zhì)量和乳酸鈉內(nèi)標質(zhì)量比值，乳酸鈉內(nèi)標質(zhì)量在所有標準曲線標準點及血清樣品中加入量一致，且測量過程使用同一移液器及天平稱量，其由天平稱量不準引入的不確定度與式（2）中的m(NaLA)為負相關(guān)，且天平稱量重復(fù)性引入的不確定度較小可忽略，模型Rs×m(NaLA)中僅需考慮乳酸質(zhì)量引入的不確定度。以下逐個分析各輸入量的標準不確定度。

①標準曲線法測量得到的質(zhì)量比值Rs的標準不確定度

標準曲線法測量得到的質(zhì)量比值Rs的標準不確定度包括兩部分，第一部分回歸計算引入的不確定度，第二部分為標準曲線標準值引入的不確定度，即為乳酸標準溶液配制質(zhì)量標準值引入的不確定度。

a. 回歸計算引入的相對標準不確定度urel(R）

標準曲線包含5個測量點，由直線擬合引入的不確定度可由下式計算：

sR——擬合直線產(chǎn)生的標準偏差，計算見式（4）；

B1——擬合直線的斜率；

P——每個樣品的測量次數(shù)，P=9；

n——標準溶液的測量次數(shù)，每個濃度測量3次，共15次；

Rj——標準曲線各測量點的比值；

式中：Aj——各測量點的乳酸與同位素內(nèi)標峰面積比值；

B0——擬合直線的截距。

根據(jù)式（3）～（4）計算得到回歸計算引入的相對標準不確定度urel(R)見表8。

表8 血清中乳酸定值結(jié)果不確定度匯總

b. 標準曲線標準值的相對標準不確定度urel(Rstd)

標準曲線中乳酸的質(zhì)量標準值使用乳酸純物質(zhì)配制的標準溶液稱量計算得到，其不確定度由乳酸標準溶液濃度值的標準不確定度、乳酸標準溶液的密度和乳酸標準溶液的稱量質(zhì)量的不確定度組成。其中乳酸標準溶液配制采用的高純?nèi)樗峒兌鹊牟淮_定度由滴定用量值溯源標準物質(zhì)及滴定過程不確定度組成，文獻[15]中詳細評定。三者互不相關(guān)，采用各分量相對標準不確定度方和根合成得到標準曲線標準值的相對標準不確定度urel(Rstd)，結(jié)果見表8。

②血清體積計算值的不確定度

血清體積計算值的不確定度包括血清的密度ρ(serum)、血清的稱樣質(zhì)量m(serum)引入的不確定度。

a. 血清密度測量引入的相對標準不確定度urel(ρs)

血清的密度采用稱量法測量，用20 mL單標線移液管移取血清，再用電子天平稱取血清的質(zhì)量，以10次重復(fù)測量的質(zhì)量和體積相除，得到血清密度測量結(jié)果。其不確定度由重復(fù)測量分散性引入的不確定度、移液誤差和稱量誤差引入的不確定度組成。

采用標準不確定度的A類評定方法計算測量重復(fù)性引入的標準不確定度，采用標準不確定度的B類評定方法評定20 mL移液管的最大允許誤差、溫度變化和電子天平最大允許誤差引入的不確定度，按照均勻分布估計各輸入量分布。假設(shè)各分量互不相關(guān)，采用方和根合成除以血清密度測得值得到血清密度的相對標準不確定度 urel(ρs)，結(jié)果見表8。

b. 血清的稱樣質(zhì)量引入的相對標準不確定度urel[m(serum)]

樣品處理過程中血清取樣量為100 μL，以稱量法計算其準確加入質(zhì)量。該部分主要由天平稱量準確度引入。I級電子天平稱量100 mg質(zhì)量的最大允許誤差為±0.05 mg，則天平稱量過程引入的相對標準不確定度為：

血清體積計算值的相對不確定度 urel(V)不確定度以血清的密度、血清的稱樣質(zhì)量的相對不確定度方和根合成得到，結(jié)果見表8。

乳酸分子式為C3H6O3，根據(jù)IUPAC發(fā)表的各元素的相對原子質(zhì)量及引用不確定度計算得到乳酸分子量標準不確定度則乳酸分子量的相對標準不確定度為：

以上三項標準不確定度互不相關(guān)，以方和根合成得到測量方法引入的不確定度 urel（M），結(jié)果見表8。

2）定值分散性引入的不確定度

根據(jù)8家實驗室定值結(jié)果，使用貝塞爾公式計算各實驗室定值結(jié)果的相對標準偏差RSD，評定定值結(jié)果分散性引入的不確定度見下式：

2.4.2 均勻性引入的不確定度度評定

式中：Q1和Q2——組間方差和與組內(nèi)方差和；

計算如下：

2.4.3 穩(wěn)定性引入的不確定度度評定

綜合評價以上三部分不確定度，得到標準物質(zhì)各分量不確定度，采用方和根合成得到標準值的合成不確定度和擴展不確定度見表8，即3個濃度水平標準物質(zhì)定值結(jié)果分別為(5.53±0.14) mmol/L、(10.22±0.09) mmol/L、(15.76±0.27) mmol/L，包含因子 k =2。研制的血清中乳酸標準物質(zhì)的不確定度遠小于現(xiàn)有乳酸測定儀的最大允許誤差，可以有效運用于儀器性能評定和方法學(xué)評價。

3 血清中乳酸標準物質(zhì)的應(yīng)用

本文研究的血清中乳酸標準物質(zhì)主要應(yīng)用于以下三方面：

應(yīng)用于臨床檢驗實驗室乳酸測量溯源性的建立：血清中乳酸標準物質(zhì)能有效地將量值傳遞至臨床檢驗實驗室，建立臨床乳酸測定結(jié)果的溯源性，使臨床實驗室檢驗結(jié)果更加準確一致。

應(yīng)用于乳酸測定儀器的校準：應(yīng)用本文研制的具有高中低3種濃度水平的標準物質(zhì)，能夠有效滿足乳酸測定儀器測量范圍的性能評價以及血清乳酸檢驗中系統(tǒng)誤差的修正需要，客觀準確評價儀器性能和檢驗結(jié)果，及時識別測量系統(tǒng)的偏移和異常。

應(yīng)用于評價血清中乳酸分析方法：作為臨床檢驗的一個重要指標，乳酸的檢測方法多樣化，有酶法、電化學(xué)法、比色法、干式化學(xué)法等，使用血清中乳酸標準物質(zhì)可以有效評價新方法的準確度、分析范圍、回收率、分析靈敏度、檢出限等性能。

4 結(jié)束語

本文研制的血清中乳酸標準物質(zhì)選取人血清作為基質(zhì)，具有高、中、低3個濃度水平，以多家實驗室同位素稀釋高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法定值，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)評價，定值結(jié)果準確可靠；經(jīng)評定標準物質(zhì)足夠均勻，且在指定保存條件下量值穩(wěn)定，通過標準物質(zhì)成果的應(yīng)用可為臨床實驗室血清乳酸檢驗質(zhì)量控制提供有力保障，保障各實驗室測量結(jié)果的一致性，科學(xué)評價乳酸測定儀的性能，進一步提高醫(yī)學(xué)檢驗實驗室乳酸檢測水平，為乳酸相關(guān)科學(xué)研究提供準確數(shù)據(jù)。