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    超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定柴胡中4種成分的含量

    2022-09-13 03:58:02郭宇鴿柏玉冰李洪權(quán)胡冠羽黎旭湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院長沙40007長沙市第三醫(yī)院長沙4005株洲市食品藥品檢驗所湖南株洲4000
    中南藥學 2022年8期
    關鍵詞:柴胡皂苷槲皮素柴胡

    郭宇鴿,柏玉冰,李洪權(quán),胡冠羽,黎旭*(.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,長沙 40007;.長沙市第三醫(yī)院,長沙 4005;.株洲市食品藥品檢驗所,湖南 株洲 4000)

    柴胡是傘形科(Apiaceae)植物北柴胡(Bupleurum chinenseDC.)的干燥根。其性味辛、苦,微寒,歸肝、膽、肺經(jīng),具有疏散退熱,疏肝升陽,升舉陽氣等功效[1]。柴胡主要含有皂苷[2]、揮發(fā)油[3]、黃酮[4]、多糖[5]、香豆素、多炔[6]等成分,具有解熱、調(diào)節(jié)免疫[7]、抗抑郁[8]、保肝[9]、抗腫瘤[10]、抗炎[11]等作用。

    目前,柴胡所有藥理作用中,研究最典型的是解熱作用。有研究認為,其作用成分主要為直接產(chǎn)生解熱作用的柴胡皂苷和揮發(fā)油以及通過抑制熱源而間接產(chǎn)生解熱作用的黃酮[12-13]。也有研究者認為,柴胡的傳統(tǒng)用藥方式為煎煮,此時,揮發(fā)油含量不足以達到解熱效果[14],因此,柴胡發(fā)揮解熱作用的成分應該以柴胡皂苷和黃酮為主。而柴胡中各種柴胡皂苷和黃酮含量有差異,含量較高者為柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、蘆丁以及槲皮素[15-17]。目前,關于同時測定含這4種成分含量的方法,只有液相色譜法[18]。而相對液相色譜法,具有信號采集時間短,選擇性強等優(yōu)勢[19]的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法尚未見報道。

    本文基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLCMS/MS)法建立柴胡中4種成分的含量測定方法,以期更好地控制其質(zhì)量。

    1 材料

    1.1 試藥

    柴胡樣品源自于藥店、網(wǎng)商和藥材市場,信息見表1。所有批次藥材經(jīng)株洲市食品藥品檢驗所胡冠羽主管藥師鑒定均為傘形科(Apiaceae)植物北柴胡(Bupleurum chinenseDC.)的段根。柴胡皂苷a(批號:110777-201711,純度:98.0%)、柴胡皂苷d(批號:110778-201711,純度:98.0%)、槲皮素(批號:100081-200907,純度:97.4%)和蘆?。ㄅ枺?0080-200707,純度:90.5%)對照品(中國食品藥品檢定研究院)。

    表1 樣品信息Tab 1 Sample information

    甲酸、乙酸銨(分析純,國藥集團化學試劑有限公司);甲醇、乙腈(色譜純,霍尼韋爾有限公司)。

    1.2 儀器

    XSE 205DV型電子天平(精度:0.01 mg,梅特勒托利多儀器有限公司);HNS-SY-150型超聲波儀(北京恒奧德儀器儀表有限公司);Agilent 1290 Infinity Ⅱ型超高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司);QTRAP 4500型三重四極桿質(zhì)譜(上海愛博才思分析儀器有限公司)等。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 色譜-質(zhì)譜條件

    2.1.1 色譜條件 采用Welch Utimate AQ-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)色譜柱,以水(A)-乙腈(B)為流動相,梯度洗脫(0~5 min,90%→55%A;5~10 min,55%→30%A;10~12 min,30%→10%A;12~12.5 min,10%→90%A;12.5~15 min,90%A),流速0.5 mL·min-1,采集時間15 min,柱溫30℃,進樣量5 μL。

    2.1.2 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜:電噴霧電離源(ESI),負離子掃描,多反應監(jiān)測(MRM),離子源溫度:550℃,電噴霧電壓:-4500 V,氣簾氣:35.0 psi,離子源氣1:55 psi,離子源氣2:55 psi,碰撞氣:氬氣。各成分的質(zhì)譜參數(shù)見表2,準分子離子見圖1。

    圖1 4種成分的準分子離子圖Fig 1 Excimer ion of 4 components

    表2 4種成分的保留時間及質(zhì)譜參數(shù)Tab 2 Retention time and UPLC-MS/MS parameters of the 4 components

    2.2 溶液的制備

    2.2.1 混合對照品儲備液 精密稱取柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、槲皮素和蘆丁對照品適量,置25 mL量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,即得。經(jīng)含量折算后,上述各對照品的質(zhì)量濃度分別為1.0094、1.0388、0.983 74、0.977 40 mg·mL-1。對照品提取離子色譜圖見圖2A。

    2.2.2 供試品溶液 取柴胡粉末(粉碎后過4號篩)約0.5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇30 mL,稱量,超聲(400 W,40 kHz)提取30 min,靜置至室溫,再稱量,用70%甲醇補足減失的量,搖勻,精密量取1 mL搖勻后的溶液,置于10 mL量瓶中,加入70%甲醇定容至刻度線,再次搖勻,濾過,取續(xù)濾液作為供試品溶液,注入質(zhì)譜儀進行分析。柴胡樣品提取離子色譜圖見圖2B。

    圖2 柴胡混合對照品和樣品中分析物提取離子色譜圖Fig 2 Extracted ion chromatogram of Bupleurum chinense DC.mixture reference and sample

    2.3 方法學考察

    2.3.1 線性關系考察 精密量取混合對照品儲備液適量,用70%甲醇稀釋得系列混合對照品溶 液(柴胡皂苷a:100.940、504.700、1009.40、2018.80、4037.60、5047.00 ng·mL-1;柴胡皂苷d:103.880、519.400、1038.80、2077.60、4155.20、5194.00 ng·mL-1;槲 皮 素:4.918 70、24.5935、49.1870、98.3740、196.748、245.935 ng·mL-1;蘆丁:122.175、610.875、122 1.75、244 3.50、488 7.00、610 8.75 ng·mL-1),進樣測定,以質(zhì)量濃度X(ng·mL-1)為橫坐標,峰面積Y為縱坐標,計算4種成分的線性回歸方程,結(jié)果見表3,4種成分在各自線性范圍內(nèi)呈良好的線性關系。

    表3 線性關系結(jié)果(n=6)Tab 3 Linear regression (n=6)

    2.3.2 精密度試驗 取混合對照品溶液,按照“2.1”項下條件連續(xù)進樣6次,記錄各成分峰面積并計算RSD。結(jié)果柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、槲皮素和蘆丁峰面積的RSD分別為0.96%、0.79%、1.1%和1.2%,表明儀器精密度良好。

    2.3.3 重復性試驗 取同一批樣品(批號:CH20210314-1)6份,按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,進樣測定,記錄各成分峰面積并計算RSD。結(jié)果柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、槲皮素和蘆丁峰面積的RSD分別為1.3%、1.3%、1.4%和1.2%,表明該方法重復性良好。

    2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取同一批樣品供試品溶液(批號:CH20210314-1),分別于0、2、4、8和12 h進樣分析,記錄各成分峰面積并計算RSD。結(jié)果柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、槲皮素和蘆丁峰面積的RSD分別為1.7%、2.0%、1.5%和1.7%,表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    2.3.5 加樣回收試驗 取已知含量的樣品(批號:CH20210314-1)6份,每份約0.25 g,精密稱定,分別加入絕對含量接近0.25 g藥材所含量的對照品溶液后,按“2.2.2”項下方法制備,進樣分析,計算加樣回收率,結(jié)果柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、槲皮素和蘆丁的平均加樣回收率為98.74%、97.96%、97.97%和98.41%,RSD均小于1.5%,表明本方法回收率良好。

    2.4 樣品測定

    精密稱取6批次不同批號的柴胡各2份,分別按照“2.2.2”項下方法制備,按照“2.1”項下條件進樣測定,代入線性回歸方程,計算4種成分的含量,結(jié)果見表4。

    表4 6批次樣品的4種成分的含量(μg·g-1,n=2)Tab 4 Contents of 4 components in 6 batches of samples(μg·g-1,n=2)

    3 討論

    3.1 供試品溶液制備條件優(yōu)化

    本研究比較了不同提取溶劑(30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇和90%甲醇),不同提取體積(20、30、40和50 mL),不同提取時間(10、20、30和40 min)對供試品溶液制備的影響,以4種成分的峰面積大小為判斷依據(jù),確定最佳條件。結(jié)果,當甲醇濃度為70%,提取體積為30 mL,提取時間為30 min時,各成分峰面積均為最大值,因此選為最佳制備條件。

    3.2 色譜條件優(yōu)化

    本研究比較了4種流動相組成(甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液和乙腈-含5 mmol·L-1乙酸銨的0.1%甲酸水溶液),4種C18色 譜 柱(Agilent Eclipse XDB、Thermo Acclaim 120、Welch Xtimate和Welch Utimate AQ,規(guī)格:4.6 mm×150 mm,5 μm),2種洗脫程序[乙腈-水(40∶60)等度洗脫和梯度洗脫(詳見本文色譜條件)],3種流速(0.3、0.5和0.7 mL·min-1)。結(jié)果,流動相組成為甲醇-水溶液時,各成分的峰稍有拖尾現(xiàn)象,水相加入乙酸銨各成峰面積被抑制;加入乙腈-水,拖尾得到改善,峰寬較窄;加入甲酸,無明顯變化,因此,乙腈-水為最佳流動相組成。4種色譜柱均得到良好的峰形和分離度,但是Welch Utimate AQ柱相對其他色譜柱,各成分峰寬更窄,峰形更為尖銳,保留性更好,因此選為最合適色譜柱。洗脫程序中,等度洗脫時各成分峰形均有拖尾,換成梯度洗脫,峰形得到改善,因此選為最佳洗脫程序。流速為0.3和0.5 mL·min-1時,各成分峰形、峰面積相當;但是當流速為0.3 mL·min-1時出峰慢,不利于提高分析效率;當流速為0.7 mL·min-1時,各成分離子化不充分,峰面積變小,因此,選擇0.5 mL·min-1為最佳流速。

    3.3 質(zhì)譜參數(shù)的建立

    通過比較正、負離子模式下各成分分子離子峰信號強度,選擇負離子模式;根據(jù)信號強度曲線,選擇各成分分子離子峰信號最強時所顯示數(shù)值;離子源溫度、電噴霧電壓、氣簾氣及離子源氣等參數(shù)則選擇儀器默認參數(shù)。

    3.4 方法優(yōu)劣比較

    目前對柴胡中皂苷和黃酮成分進行定量分析的方法有多種,如HPLC-DAD(二極管陣列檢測器)、HPLC-ELSD(蒸發(fā)光散射檢測器)等。相對而言,本法優(yōu)勢明顯,主要體現(xiàn)在快速、選擇性強等方面。如郭司群等[20]測定柴胡皂苷d的時長達到60 min,韋英杰等[18]同時測定柴胡中皂苷和黃酮成分的時長更是達到70 min,而本法只需15 min。另外,李衛(wèi)斌等[21]測定柴胡皂苷含量時,柴胡皂苷c與雜峰分離不徹底,有部分重疊。韋杰英等[18]采用的方法中,柴胡皂苷a峰也與雜峰有重疊,影響到皂苷成分定性定量的準確性,而本法除色譜柱的分離功能,還可根據(jù)分析物的不同質(zhì)荷比具有二次分離功能,專屬性強,干擾少。但是,本法設備比較昂貴,可能在前期投入和方法推廣方面不如上述方法。

    3.5 總結(jié)

    本研究建立了柴胡中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、槲皮素和蘆丁4種成分的超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜含量測定方法,為基于這4種成分對柴胡進行解熱的量效關系評價提供了研究基礎。

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