基于數(shù)據(jù)挖掘和網(wǎng)絡藥理學分析社區(qū)獲得性肺炎用藥規(guī)律和機制*

張晨曦，關勝男，謝凱，張康，王海峰

1.河南中醫(yī)藥大學，河南 鄭州 450046； 2.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院呼吸科，河南 鄭州 450000； 3.呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450000

社區(qū)獲得性肺炎(community acquired pneumonia，CAP)是一種由多種病原體引起的急性肺部感染性疾病，有高發(fā)病率和病死率[1]。隨著人口老齡化、免疫功能減弱、宿主數(shù)量增多和抗生素耐藥性增加等問題，CAP的發(fā)病率持續(xù)增長[2]。有研究表明，依據(jù)感染指標指導的抗生素濫用率在55%以上，且其耐藥性在全球范圍內(nèi)迅速蔓延，對公眾健康造成了嚴重威脅[3-4]。中醫(yī)藥治療呼吸系統(tǒng)疾病具有獨特優(yōu)勢和顯著療效，且具有多靶點、不良反應少、統(tǒng)籌整體的特點[5]。研究表明，中藥治療CAP能明顯改善臨床癥狀，降低炎癥指數(shù)，調(diào)節(jié)免疫功能[6-9]。CAP屬中醫(yī)“風溫肺熱”“咳嗽”范疇[10]。臨床上關于中藥治療CAP的研究多為隨機對照試驗、動物實驗、系統(tǒng)及療效評價等，缺少方藥總結(jié)和機制探索。因此，本文通過挖掘具有明顯臨床治療效果的常用代表方藥，總結(jié)經(jīng)典藥對，采用網(wǎng)絡藥理學篩選出藥物的核心化學成分，分析其作用的靶點和機制，并結(jié)合中藥性能闡釋中醫(yī)藥治療CAP的有效性和科學性。

1 資料與方法

1.1 文獻來源本研究所搜集的文獻主要來源于知網(wǎng)、萬方醫(yī)學數(shù)據(jù)庫和維普資訊等數(shù)據(jù)庫，檢索時間為數(shù)據(jù)庫建立至2021年8月。以“社區(qū)獲得性肺炎”“肺炎”“肺部感染”“風溫肺熱病”“中醫(yī)”“中醫(yī)藥”“中草藥”“中藥”為主題詞，限定文獻類型為實驗性研究、觀察性研究、名老中醫(yī)經(jīng)驗、醫(yī)案、驗案等。

1.2 文獻納入標準①符合CAP且病種單一，無較多合并癥，年齡大于18歲；②有明確的方藥組成；③有明顯的臨床療效；④單純的湯劑治療。

1.3 文獻排除標準①排除妊娠期和哺乳期婦女；②排除重復方藥、中西藥聯(lián)用、中藥針劑、復合制劑、中藥貼敷、針刺治療；③排除動物實驗、療效與系統(tǒng)評價、綜述、指南、共識。

1.4 文獻整理與數(shù)據(jù)規(guī)范所篩文獻查重后由兩名工作人員通過對文獻標題及摘要進行首次剔除，由第3名工作人員瀏覽全文確定最終文獻。將文獻中所記載的所有方劑名、中藥、中醫(yī)證型記錄于Excel 2019軟件中，參考2015年版《中華人民共和國藥典》和2004年版《中醫(yī)藥學名詞》對所記載的中藥名進行規(guī)范，如“酒軍”更改為“大黃”，“新會皮”更改為“陳皮”，“元參”更改為“玄參”，“淡子芩、條芩”更改為“黃芩”等。

1.5 數(shù)據(jù)挖掘利用Excel 2019軟件對藥物進行描述性統(tǒng)計分析，獲得高頻藥物，利用SPSS Modeler軟件對所有藥物進行關聯(lián)規(guī)則分析，獲取藥物之間的關聯(lián)度。利用SPSS Statistics軟件對藥物進行系統(tǒng)聚類分析，最后結(jié)合藥物頻率、關聯(lián)規(guī)則及聚類分析結(jié)果得出中藥治療CAP的核心配伍藥對。

1.6 網(wǎng)絡藥理學通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)篩選出核心配伍藥對的有效化學成分并獲取相應的靶點，通過蛋白質(zhì)分析數(shù)據(jù)庫(universal protein，UniProt)匹配靶點的基因名(物種限定為人類)。在OMIM、GeneCard、Grugbank數(shù)據(jù)庫，以“Community acquired pneumonia”為檢索詞，將所有的疾病靶點合并、去重，得到CAP的疾病靶點，并通過UniProt數(shù)據(jù)庫矯正基因名。使用Venny2.1.0(http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)獲取藥物和疾病的交集靶點，將交集靶點和藥物靶點導入Cytoscape3.7.1軟件構建疾病-藥物-化學成分-靶點網(wǎng)絡，獲得藥物核心化學成分。通過STRING(https：//string-db.org)獲取“string_interractions.tsv”文件，導入Cytoscape軟件，構建蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡，找到核心靶點。基于Metascap(http：//metascape.org/)進行基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析、京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，了解核心靶點的生物信息和信號通路。

2 結(jié)果

2.1 高頻藥物頻次與頻率共篩選到文獻8 794篇，剔除相關文獻后獲得286篇論文，方劑168篇，其中包含266味中藥。通過Excel 2019軟件進行描述性統(tǒng)計分析得出頻率大于10%的高頻藥物有27味，見表1。

表1 高頻藥物頻次與頻率

2.2 高頻中藥關聯(lián)規(guī)則與可視化在SPSS Modeler軟件中采用Apriori算法對高頻中藥進行關聯(lián)規(guī)則分析，設置最小支持度為10%，最小規(guī)則置信度為80%，最大前項數(shù)為2。獲得兩項藥對組合兩個，分別是麻黃→杏仁、薄荷→連翹。3項藥對組合5個，分別是麻黃、杏仁→石膏，麻黃、石膏→杏仁，麻黃、黃芩→石膏，麻黃、黃芩→杏仁。其中麻黃→杏仁配伍支持度最高為16.67%，置信度>90%，出現(xiàn)頻次最高為28次，見表2。將關聯(lián)規(guī)則結(jié)果進行網(wǎng)絡可視化處理，見圖1。27種高頻藥物在設置鏈接數(shù)≥15時，顯示杏仁、黃芩、麻黃、魚腥草、金銀花等藥物之間關系密切；當鏈接數(shù)≥25時，顯示杏仁、黃芩、甘草、麻黃等藥物之間關系密切。

表2 高頻藥物組合關聯(lián)規(guī)則(支持度>10%，置信度>80%)

2.3 高頻中藥聚類分析與可視化將27種高頻藥物數(shù)據(jù)信息整合，依據(jù)是否在同一處方中出現(xiàn)分別記為“1”和“0”，導入SPSS Statistics軟件進行系統(tǒng)聚類分析，采用組間聯(lián)接法，設置區(qū)間為Pearson相關性，獲得譜系圖，結(jié)果顯示當截距值取為12.5時，麻黃、杏仁、石膏可聚為一類，見圖2。結(jié)合關聯(lián)規(guī)則中，在置信度>80%的條件下，麻黃→杏仁支持度最高，考慮麻黃與杏仁為治療CAP的核心配伍藥對。

2.4 “麻黃-杏仁”化學成分和靶點網(wǎng)絡構建通過TCMSP平臺檢索麻黃、杏仁，篩選出口服吸收率≥30%、類藥性≥0.18的有效化學成分，結(jié)果顯示：麻黃的有效化學成分有23個、杏仁有19個，兩者分別有452個、182個成分靶點。將麻黃和杏仁

圖1 高頻藥物關聯(lián)規(guī)則網(wǎng)絡圖

圖2 27種高頻中藥聚類譜系圖

圖3 藥物-疾病靶點基因韋恩圖

圖4 藥物-疾病-化學成分-交集靶點網(wǎng)絡圖

的成分靶點去重后分別為217個、70個靶點，通過UniProt數(shù)據(jù)庫對靶點進行基因名矯正。通過OMIM、GeneCard、Grugbank數(shù)據(jù)庫，以“Community acquired pneumonia”為搜索詞檢索疾病靶點，所有疾病靶點合并去重后余135個，并通過UniProt數(shù)據(jù)庫矯正基因名，與藥物靶點基因取交集得54個，即麻黃-杏仁的有效化學成分作用于疾病的靶點，見圖3。將藥物靶點、疾病靶點、交集靶點進行整理，生成"network" "type"文件，導入Cytoscape軟件構建“藥物-疾病-化學成分-交集靶點”網(wǎng)絡圖(圖4)。該網(wǎng)絡包含213個節(jié)點，306條邊，藍色和紫色分別為麻黃和杏仁的有效化學成分，綠色為藥物的基因靶點，紅色為疾病和藥物的交集基因靶點。對網(wǎng)絡圖進行分析，選擇度值排名前5位作為麻黃與杏仁的核心化學成分，分別是槲皮素(quercetin)、植物甾醇(stigmasterol)、柚皮素(naringenin)、甘草查爾酮B(licochalcone B)、β-谷甾醇(β-sitosterol)，相關度值見表3。

表3 核心化學成分及度值

2.5 基于String和Cytoscape軟件的PPI網(wǎng)絡構建將交集靶點基因上傳至String平臺，獲取“string_interractions.tsv”文件，導入Cytoscape軟件并構建PPI網(wǎng)絡，即核心藥物與疾病PPI網(wǎng)絡圖，見圖5。根據(jù)度值調(diào)整網(wǎng)絡圖參數(shù)，圓圈代表每個蛋白質(zhì)目標，連接線代表蛋白質(zhì)目標之間的緊密程度。圓的大小、顏色、連接線的粗細、線條顏色與蛋白靶點的重要性呈正相關。白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、絲氨酸激酶B(AKT1)、IL-1β、腫瘤蛋白p53(oncoprotein p53，TP53)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP9)、胱天蛋白酶3(caspase 3，CASP3)、CXCL8、血管細胞黏附因子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM1)、細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM1)、1SERPINE1等 10個蛋白靶點可能是藥物與疾病交互作用的重要靶點。其中IL-6、AKT1、IL-1β、MMP9、CXCL8這5個靶點與呼吸系統(tǒng)密切相關，可作為此次研究的核心靶點。

圖5 核心藥物-疾病PPI網(wǎng)絡

2.6 分子對接驗證將5個核心靶點基于蛋白質(zhì)結(jié)構數(shù)據(jù)庫獲取蛋白結(jié)構，進行分子對接。結(jié)合能見表4，對接結(jié)構可視化可見圖6—圖10。5個核心靶點與中藥核心化學成分結(jié)合能均小于-5 kcal·mol-1，均有較強的結(jié)合作用。

表4 分子對接結(jié)合能

圖6 AKT1與5種核心化學成分對接圖

圖7 CXCL8與5種核心化學成分對接圖

圖8 IL-6與5種核心化學成分對接圖

圖9 IL-1β與5種核心化學成分對接圖

圖10 MMP9與5種核心化學成分對接圖

2.7 GO功能富集分析、KEGG通路富集分析依據(jù)Metascape數(shù)據(jù)庫對交集靶點進行GO功能富集分析、KEGG通路富集分析。在GO功能富集分析中取富集得分前10位，從生物過程(biological process，BP)來看，麻黃與杏仁的核心化學成分主要參與了凝血的正調(diào)控、氧化應激誘導的內(nèi)在凋亡信號通路的負調(diào)控、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、一氧化氮代謝過程的正調(diào)控、凝血機制調(diào)節(jié)、纖溶、止血調(diào)節(jié)、血管收縮的正調(diào)控、凝血調(diào)節(jié)。在細胞組成(cellular component，CC)方面，核心化學成分作用的位置可能是小窩、質(zhì)膜筏、膜筏、膜微區(qū)、肽酶復合物、富含ficolin-1的顆粒管腔、高爾基體、含膠原細胞外基質(zhì)、核基質(zhì)、核外圍。從分子功能(molecular function，MF)來看，核心化學成分可能影響了一氧化氮合酶結(jié)合、蛋白磷酸酶2A結(jié)合、無序結(jié)構域特異性結(jié)合、氧化還原酶活性、核心啟動子序列特異性 DNA 結(jié)合、腫瘤壞死因子受體超家族結(jié)合、蛋白酶結(jié)合、蛋白激酶C結(jié)合、轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)子結(jié)合、絲氨酸水解酶活性，生物注釋與富集得分見圖11。KEGG通路富集分析則根據(jù)count值選取前20條通路，將其可視化，見圖12。點越大表示該通路上所富集的基因越多，顏色越深表示P值越小。其中位于前10位的通路主要有流體剪應力與動脈粥樣硬化、晚期糖基化終末產(chǎn)物和受體(AGE-RAGE)信號通路、癌癥相關的通路、愛潑斯坦-巴爾病毒感染、丙型和乙型肝炎、磷脂酰肌醇-3激酶/絲氨酸/蘇氨酸激酶(PI3K/AKT)信號通路、結(jié)核，考慮核心靶點可能作用于這些通路上。

圖11 BP、CC、MF生物注釋和富集得分

圖12 KEGG通路富集分析氣泡圖

3 討論

本文對286篇文獻，168個方藥進行梳理規(guī)整和數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)在CAP的臨床治療中，麻黃與杏仁可作為核心藥對。兩者均入肺經(jīng)，一辛一苦，辛能升發(fā)，苦能斂降，宣降相因，共奏降氣化痰平喘之功，為宣降肺氣常用組合。臨床上也常應用于外感風寒表實證、外感風寒內(nèi)兼郁熱證、外感風寒肺失宣降證等。

槲皮素、植物甾醇、柚皮素、甘草查爾酮B、β-谷甾醇為麻黃、杏仁發(fā)揮藥效的核心化學成分。有研究表明，槲皮素可以促進自噬反應，通過調(diào)節(jié)活性氧的產(chǎn)生和病毒的生命周期，從而達到抗氧化、抗病毒和抗炎作用[10-11]。柚皮素作為柚皮苷的苷元，屬二氫黃酮類化合物，具有抗炎、抗病毒、抗氧化、保護心臟等多種生物性能[12]，可通過抑制核苷酸結(jié)合域樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥小體、核轉(zhuǎn)錄因子信號(NF-κB)通路，減少細胞毒性，降低肺支氣管的炎癥反應，改善肺損傷程度[13-15]。甘草查爾酮B為甘草的提取物，其所含的生物活性有抗革蘭陽性細菌作用，對耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌的作用尤為突出[16]。此外，甘草查爾酮B同樣也抑制NF-Kb信號通路的能力，具有很好的抗炎作用[17]。β-谷甾醇多存在于植物油、綠植和果蔬中，在抗炎、抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等方面有獨特的藥理活性[18-19]。Zhou等[20]研究發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇通過下調(diào)促凋亡因子來減輕視黃酸誘導基因I介導的肺泡上皮細胞的凋亡損傷，對病毒感染的肺損傷有較好改善作用。Yuk等[21]研究發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇能減少嗜酸性粒細胞浸潤及杯狀增生，改善黏液分泌過多的現(xiàn)象，從而可以減輕肺部炎癥。Mahajan等[22]發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇通過抑制細胞反應，減少2型T輔助細胞(Th2)細胞因子的釋放與合成，減輕肺部和氣道炎癥。

10個蛋白靶點中與呼吸系統(tǒng)疾病密切相關的核心靶點主要有IL-6、AKT1、IL-1β、MMP9、CXCL8。其中，IL-6、IL-1β、CXCL8為炎癥反應中的重要細胞因子，是中性粒細胞誘導趨化因子和炎癥的關鍵介質(zhì)[23]。機體發(fā)生感染或組織損傷時，炎癥細胞會迅速產(chǎn)生IL-6[24]。IL-1β會誘導各種趨化因子，影響外周循環(huán)的炎癥因子聚集至肺組織結(jié)構，加重肺部炎癥[25]。尚立芝等[26]發(fā)現(xiàn)，通過抑制CXCL8、CXC趨化因子受體1(CXCR1)、CXC趨化因子受體2(CXCR-2)的基因表達，可以控制炎細胞趨化，減緩疾病進程。絲氨酸激酶(AKT1)參與糖代謝、調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和凋亡過程。MMP參與各種生理過程中的組織重塑，如血管再生和傷口修復。已有研究證明，MMP-9在糖尿病和代謝疾病中的作用[27]。張永標等[28]在臨床中發(fā)現(xiàn)，CAP患者血清MMP-9水平明顯上升，推測MMP-9可參與CAP的炎性反應過程。

KEGG通路富集分析中PI3K/AKT信號通路與哮喘、COPD、急性肺炎等呼吸系統(tǒng)密切相關。P13K/AKT信號通路參與了氣道和肺部的炎癥反應[29-30]。該通路能夠激活炎癥反應和細胞凋亡調(diào)節(jié)因子，產(chǎn)生腫瘤壞死因子、IL等炎性因子[31]。PI3K/AKT通路也是病毒感染影響各種細胞功能的重要機制[32]，通過抑制PI3K的表達，能夠抑制IL-1β、IL-18等炎癥因子的活化[33]。除此之外，抑制PI3K/AKT通路能夠改善氣道重塑和降低炎癥反應，抑制Th2細胞因子的產(chǎn)生，減少嗜酸性粒細胞浸潤和氣道黏液，降低氣道高反應性[34-35]。其余通路參與CAP作用機制的相關科研證據(jù)尚不充分。由此，PI3K/AKT信號通路參與支氣管及肺部的炎癥反應過程及氣道重塑過程，作為麻黃-杏仁參與CAP的重要通路之一。

綜上所述，本文總結(jié)了CAP的臨床用方規(guī)律，對其進行描述性統(tǒng)計分析、關聯(lián)規(guī)則和系統(tǒng)聚類分析，得出麻黃和杏仁是臨床CAP的常用藥對組合。槲皮素、植物甾醇、柚皮素、甘草查爾酮B、β-谷甾醇為其發(fā)揮藥效的核心化學成分，發(fā)揮抗炎、抗氧化、抑制炎癥產(chǎn)生相關信號通路的作用，并作用于IL-6、IL-1β、AKT1、MMP9、CXCL8等蛋白靶點，參與PI3K/AKT信號通路，從而達到減輕肺部炎癥反應，改善臨床癥狀的治療效果，為今后中西醫(yī)治療CAP的臨床診療提供理論依據(jù)。